Glycan Analyse Node: une approche bottom-up à Glycomics

Résumé

Cet article présente une forme améliorée d’une nouvelle technique de glycomique ascendante conçue pour analyser le profil de composition groupé des glycanes dans les biofluides non fractionnés par la décomposition chimique des glycanes en leurs monosaccharides spécifiques de liaison constitutive pour la détection par GC-MS. Les applications potentielles comprennent la détection précoce du cancer et d’autres troubles glycanes-affectifs.

Résumé

Synthétisés dans un processus non piloté par des enzymes appelées glycosyltransférases, les glycanes jouent un rôle clé dans divers événements intra- et extracellulaires significatifs. De nombreuses conditions pathologiques, notamment le cancer, affectent l’expression des gènes, ce qui peut à son tour déréguler l’abondance relative et les niveaux d’activité des enzymes glycoside hydrolase et glycosyltransférase. Des glycanes entiers aberrants uniques résultant de glycosyltransférases dérégulées sont souvent présents à l’état de traces dans des biofluides complexes, ce qui rend leur détection difficile et parfois stochastique. Cependant, avec une bonne préparation des échantillons, l’une des plus anciennes formes de spectrométrie de masse (chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse, GC-MS) peut détecter régulièrement l’ensemble de monosaccharides spécifiques aux points de branchement et de liaison (« nœuds glycanes ») présents dans des biofluides complexes. En complément des techniques traditionnelles de glycomique descendante, l’approche décrite ici implique la collecte et la condensation de chaque nœud glycane constitutif d’un échantillon en un seul signal analytique indépendant, qui fournit des informations structurales et quantitatives détaillées sur les changements du glycome dans son ensemble et révèle des glycosyltransférases potentiellement dérégulées. Les améliorations apportées à la perméthylation et aux étapes ultérieures d’extraction liquide/liquide fournies dans le présent document améliorent la reproductibilité et le rendement global en facilitant l’exposition minimale des glycanes perméthylés à des conditions aqueuses alcalines. Les modifications de l’étape d’acétylation augmentent encore l’étendue de la réaction et le rendement global. Malgré leur reproductibilité, les rendements globaux des acétates d’alditol partiellement perméthylés (PMAA) de N-acétylhexosamine (HexNAc) se sont révélés intrinsèquement inférieurs à leur valeur théorique attendue par rapport aux PMAA hexose. Le calcul du rapport entre l’aire sous le chromatogramme ionique extrait (XIC) pour chaque hexose PMAA (ou HexNAc PMAA) individuel et la somme de ces aires XIC pour tous les hexoses (ou HexNAcs) fournit une nouvelle méthode de normalisation qui facilite la quantification relative des nœuds glycanes individuels dans un échantillon. Bien qu’elle soit actuellement limitée en termes de limites absolues de détection, cette méthode accélère l’analyse des biofluides cliniques et s’avère très prometteuse en tant qu’approche complémentaire à la glycomique descendante traditionnelle.

Introduction

Glycolipides, des glycoprotéines, des protéoglycanes et glycosaminoglycanes constituent les quatre principales classes d'hydrates de carbone, hétérogènes complexes collectivement appelés glycanes. En tant que composants omniprésents et intégrales de la membrane plasmique, glycocalyx, et de la matrice et des fluides extracellulaires, les glycanes participent à de tels procédés biochimiques divers que l'endocytose, le trafic intracellulaire, la motilité cellulaire, la transduction du signal, la reconnaissance moléculaire, l'activation du récepteur, l'adhésion cellulaire, l'interaction hôte-pathogène , la communication intercellulaire, immunosurveillance et immunitaire initiation de réponse. ¹ Présent dans presque tous les domaines de la vie, enzymes appelées glycosyltransférases qui construisent des polymères glycanes agissent en tandem avec glycoside hydrolases (également connu sous le nom glycosidases, qui décomposent les glycanes) pour construire, rénover, et , finalement , produire finalisé polymères glycanes ^2. Bien que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur différents glycoconjugués, une glycosyltransféraseforges généralement une liaison glycosidique linkage- et anomère spécifique en transférant le fragment monosaccharide d'un nucléotide activé donneur de sucre particulier (par exemple, GDP-fucose) à une certaine catégorie d'accepteurs nucléophiles (par exemple, un lipide, un polypeptide, un acide nucléique, ou de plus en plus oligosaccharide). Il a été estimé que plus de 50% de protéines ( en particulier membranaires et des protéines sécrétoires) sont post-traductionnelle modifié par glycosylation ³ calculs combinatoires rudimentaires fournissent une appréciation de la variabilité considérable, la polyvalence et la spécificité accordée aux glycoprotéines par glycosylation. Par exemple, si un substrat de polypeptide ne possède que 10 sites de glycosylation et chaque site peut former une liaison glycosidique avec une des extrémités réductrices seulement trois monosaccharides différents, alors, en principe, la glycoprotéine finale peut prendre ¹⁰ = 3 59049 identités distinctes. Dans les glycoprotéines, les liaisons glycosidiques forment communément avec la chaîne latérale d'azote of résidus d'asparagine dans la séquence Asn-X-Ser / Thr (X peut être un acide aminé quelconque excepté la proline) pour obtenir le N -glycans ² et des chaînes latérales hydroxyles des résidus de serine et de threonine pour donner -glycans O ^4. La composition du glycome d'une cellule ( par exemple, son complément de produits de glycosylation) est unique et limitée parce que, à quelques exceptions près, les glycosyltransférases présentent des donateurs stricte, accepteur, et la spécificité de liaison. ⁵ glycoprotéines de plasma sanguin importants et abondants souffrent glycosylation aberrante comme conséquence aval de l' expression de la glycosyltransférase et l' activité anormale due à de nombreux états pathologiques, en particulier le cancer et les maladies inflammatoires. ^6-24

Principalement en raison de facteurs épigénétiques, l'glycome est nettement plus diversifiée, dynamique et complexe que le protéome et du transcriptome. ^25,26 Alors qu'environ 1% du génome de mammifère code pour la formation, la modification, etEnsemble de glycanes, ²⁷ glycosylation se déroule de manière-un contraste marqué non orientés modèles de polypeptide et de la biosynthèse des acides nucléiques. L'interaction entre la quantité relative et l' activité des enzymes de glycosylation et des facteurs environnementaux tels que la disponibilité des nutriments et d'un précurseur détermine finalement la nature, le taux et l' étendue de la glycosylation. ^5,28 embryogenèse (par exemple, la détermination et de la différenciation), l' activation cellulaire et la progression à travers l'expression de l' influence du gène de cycle cellulaire ( par exemple, la transcription et la traduction) et modifier l'identité et la quantité des glycosyltransférases disponibles, dont l' activité est le facteur déterminant en amont immédiat du profil glycane de la cellule. Parce que (certains) le proliférative, adhésif, et les propriétés invasives des cellules cancéreuses ressemblent à celles des cellules embryogènes ordinaires, des changements spécifiques dans les voies de biosynthèse glycane (par exemple, l' accumulation de précurseur, l' expression dérégulée, aberrant modification, troncature structurelle ou formation roman) servent de biomarqueurs du cancer comme universels qui indiquent différentes étapes de la formation de tumeurs, la progression, la migration et l' invasion ²⁹ Bien que la glycosylation est très complexe, évidemment que quelques modifications de glycosylation peuvent permettre à la carcinogenèse et les métastases. apparemment, certains produits de glycosylation "aberrantes" en effet bénéficier des cellules cancéreuses en leur permettant de se soustraire à la reconnaissance immunitaire et de survivre aux exigences de la migration dans des environnements intravasculaires et métastatiques inhospitalières. ^28,30,31 Sans surprise, les expériences ont montré que la perturbation ou la prévention des motifs de changé l' expression génique et la formation glycane aberrante peuvent stopper la tumorigenèse. ²⁹ Néanmoins, les glycanes aberrantes détectées dans un échantillon de fluide biologique (par exemple, l' urine, la salive et le plasma ou le sérum sanguin) peuvent ne pas être des indicateurs directs de cancer (ou une autre maladie), mais plutôt en aval résultats de subtile mais significativedes changements dans le système immunitaire ou des ramifications quantifiables d'une condition pernicieuse dans un organe imprévisible. ³²

Bien qu'ils fournissent des informations universelles sur le glycome, de nombreux glycomique à base d'interaction-techniques moléculaires (par exemple, lectine / matrices d' anticorps et métabolique / marquage covalent) dépend de la détection de structures glycanniques entières et ne fournissent pas des informations structurelles détaillées sur glycanes individuelles. En contraste marqué, la spectrométrie de masse (MS) peut aider à identifier et quantifier les structures glycanniques individuelles et révéler de telles informations structurelles que les sites de fixation à noyaux polypeptidiques. l'expression ou l'activité d'une seule glycosyltransférase dérégulée peut initier une cascade d'événements moléculaires nuisibles dans de multiples voies de glycosylation. Parce que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur plus d'un substrat de glycoconjugué et à travers différents polymères glycanes croissance, cascades biosynthétiques déréglementés donnent dispropornellement des quantités accrues d'un seul produit glycane mais plusieurs classes hétérogènes de glycanes aberrantes dans les fluides intra- ou extracellulaires. ³³ Cependant, ces glycanes aberrants uniques sont parfois considérés comme peu pratique en tant que biomarqueurs pour le cancer ou d' autres pathologies glycanes-affectif parce que, par rapport à la grande piscine des glycanes bien réglementé, ces glycanes aberrantes représentent une très petite fraction qui peut souvent rester indétectable même par des techniques très sensibles comme la spectrométrie de masse. Par exemple, dans des fluides corporels intra- et extracellulaire, le large spectre de protéines de concentration (qui couvre huit ordres de grandeur) peut empêcher la détection de glycoprotéines rares qui sont masquées par les espèces les plus abondantes. ³² En outre, la détermination de l' activité de glycosyltransférase reste un important pratique et défi théorique parce que beaucoup de glycosyltransférases sont absents dans biofluides cliniques ou devenir inactif ex vivo. Malgré la difficulté de consistendétecter tly et la quantification des quantités ultra-minute de glycanes entiers uniques, les praticiens de la spectrométrie de masse ont fait d'énormes progrès vers l'emploi glycanes intactes comme marqueurs cliniques. Nous avons récemment développé une approche complémentaire à l'analyse des glycanes intactes, utilisant GC-MS, facilite la détection de toutes les branches point constituant et monosaccharides spécifiques liaison ( "noeuds glycanes") qui confèrent ainsi un caractère unique à chaque glycane et dans de nombreux cas servent directement substituts moléculaires qui permettent de quantifier l'activité relative de la glycosyltransférase (s) coupable.

Depuis sa première rapporté application directe à l' analyse glycanes en 1958, chromatographie en phase gazeuse (GC) a prouvé une technique puissante pour analyser les mono- et disaccharides per-méthylé, ³⁴ déterminer leur anomericity et la configuration absolue, et de les séparer pour analyse ultérieure par spectrométrie de masse. ³⁵ Entre 1984 et 2007, Ciucanu et ses collèguesintroduit et affiné une technique de perméthylation glycane phase solide qui employait l' hydroxyde de sodium et de l' iodométhane, suivie d' une extraction liquide / liquide de glycanes perméthylés utilisant de l' eau et le chloroforme. ^35,36 Entre 2005 et 2008, Kang et ses collègues ont intégré une rotation de gain de temps approche -column dans l'étape de perméthylation. ^37,38 En 2008, le groupe de recherche Goetz a conçu une phase solide quantitative perméthylation méthode glycane-profilage par laser désorption-ionisation assistée par matrice (MALDI) spectrométrie de masse pour comparer et potentiellement distinguer invasive et non les cellules cancéreuses du sein -invasive; ³⁹ puis, en 2009, l'équipe Goetz combinée enzymatique et les techniques de libération chimiques clivent O -glycans de glycoprotéines intactes dans un schéma de perméthylation en phase solide fortement alcalin ⁴⁰ Bien que la procédure Goetz facilitée perméthylation simultanée et la libération de produits chimiques. de -glycans O, il a été appliqué uniquement aux pré-isolé glycoles protéines. Nous avons modifié cette technique en 2013 et adapté pour biofluides non fractionnées entiers et des échantillons de tissus homogénéisés en incorporant l' acide trifluoroacétique (TFA) hydrolyse, réduction et acétylation étapes. ³³ Ces étapes supplémentaires libérer également les glycanes de glycolipides et N lié en glycanes de glycoprotéines et convertir les en acétates partiellement méthylés d'alditols (PMAAs, figure 1), dont les modèles de méthylation et acétylation distinctive de faciliter l' analyse par GC-MS et uniquement caractériser les nœuds glycanes constitutifs dans l'original intact polymère glycane ⁴¹ (Figure 2). ³³ en fin de compte, ce procédure produit un portrait composite de tous les glycanes dans un fluide biologique complexe basé sur la quantification par rapport direct des caractéristiques uniques, telles que des glycanes "fucosylation du noyau", "6-sialylation", "GlcNAc bissecteur", et "bêta 1-6 ramification» - chaque dérivé d'un seul chromatograp GC-MSpic HIC. Cet article présente l'optimisation du perméthylation, acétylation, l'isolement et les étapes de nettoyage ainsi que des améliorations dans le mode de quantification relative.

Protocole

Attention: Éviter le contact / des yeux de la peau avec l' un des réactifs utilisés dans cette expérience. Lors de l'exposition, rincer soigneusement la zone touchée avec de l'eau et consulter immédiatement un médecin.

1. perméthylation et Glycan Extraction

1. Préparation de la colonne
   1. Obtenir autant d'unités de colonne microcentrifugeuse de rotation que les échantillons à analyser. Pause et détacher les bouchons de tube de réservoir en plastique. Placer un filtre microfuge mini dans chaque tube réservoir. Placez les colonnes de spin microcentrifugation assemblées (contenant les mini-filtres) dans un rack tube de microcentrifugation.
   2. Obtenir un stock d'hydroxyde de sodium (NaOH) perles (20-40 mesh). Transférer une partie de NaOH à un petit bateau de pesée ou, si l'humidité est à l'origine agglutination, un mortier de porcelaine chaud que le stock de travail de NaOH. Évitez d'utiliser des bouquets de perles de NaOH ou écrasés / NaOH en poudre.
      Attention: NaOH est une toxine puissante et une base corrosive. Rincer la peau exposée / yeux à l'eau pendant 15 min. Thorougnettoyer hly l'établi après avoir terminé l'expérience.
   3. En utilisant une petite cuillère ou une spatule, transférer perles NaOH du stock de travail pour remplir les microcentrifugation mini-filtres avec NaOH jusqu'à la première biseau externe (~ 5 mm au-dessous du bord). Appuyez sur les filtres à centrifuger remplis sur la paillasse pour emballer / condenser les perles de NaOH.
      Remarque: Au cours de cette expérience, afin de minimiser l' adsorption d'eau excessive par des billes de NaOH hygroscopiques, de maintenir le niveau de tous les fluides ajoutés (par exemple, l' acétonitrile, le diméthylsulfoxyde, la solution d'analyte) au- dessus de la surface du garnissage de colonne de NaOH et de limiter le contact direct avec l' air.
   4. Obtenir un stock d'acétonitrile (ACN). Transfert ~ 350 pi ACN à chaque mini-filtre microfuge NaOH-emballés. Gardez le NaOH immergé sous ACN et éliminer les grosses bulles d'air en agitant avec un gel de chargement pointe de la pipette tip-frisée.
      Attention: Acétonitrile est un irritant inflammable.
   5. Colonne centrifugation
      1. Disposez les colonnes de microcentrifugation symétriquement à l'intérieur d'une centrifugeuse; utiliser un tube d'équilibrage si nécessaire. Évitez de renverser des granules de NaOH dans la centrifugeuse. Fermez le couvercle de la centrifugeuse.
      2. Centrifugeuse les colonnes (contenant NaOH et ACN) pour ~ 15 s à 2400 × g.
      3. À la fin de la centrifugation, supprimer des colonnes microcentrifugation de la centrifugeuse, et jeter le ACN dans un conteneur de déchets dangereux. Gardez la colonne NaOH emballage intact.
   6. Ajouter ~ 350 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque mini-filtre microfuge NaOH-emballés. Gardez le NaOH immergé dans du DMSO et éliminer toutes les grosses bulles d'air avec une pointe de pipette. Comme décrit précédemment, les colonnes de centrifugation pour ~ 15 s à 2400 × g, et jeter le DMSO tout en gardant le NaOH emballage intact.
      Attention: Le DMSO est un mutagène et irritant et est facilement absorbé par la peau.
   7. Branchez tous les mini filtres à centrifuger avec les bouchons inclus dans le filtre rotatiftrousse. Transfert ~ 350 pi de DMSO à chaque microfuge mini-filtre NaOH-emballé et utiliser une pointe de pipette 200 pi pour éliminer les bulles d'air dans l'emballage NaOH de sorte que le DMSO atteint toutes les régions à l'intérieur puis l'emballage NaOH. Éviter d'écraser ou de raclage excessivement les billes de NaOH; poudre de NaOH est indésirable. Terminez cette étape aussi rapidement que possible.
2. Préparation du contrôle de la qualité Plasma (QC) échantillon (s)
   Remarque: Pour obtenir des résultats cohérents dans les lots expérimentaux, envisager d' utiliser au moins une partie aliquote d'un échantillon prélevé à partir d' une grande collection en vrac, homogène de la matière biologique d'intérêt à analyser dans chaque lot. Par exemple, si l'analyse du plasma sanguin, en utilisant aliquote (s) d'une collection en vrac du plasma sanguin comme l'échantillon (s) cr dans chaque lot. Procédé CQ échantillons de la même manière que les échantillons inconnus.
   1. Centrifugeuse un stock échantillon de QC plasma pendant 4 min à ~ 10 000 × g. Lors de la centrifugation, un peu de précipité à haute densité peut régler à the fond et un peu de précipité à basse densité peut flotter à la surface du plasma. Évitez la fois lors du retrait aliquote (s) du plasma.
   2. Passer à la "1.3) Préparation des échantillons" ci-dessous. Ensuite, revenez à cette étape après centrifugation du plasma est terminée.
   3. Retrait 9 pi de centrifugé QC plasma et de le transférer à un tube à essai en polypropylène de 1,5 ml étiqueté de manière appropriée équipée d'un bouchon snap-fermeture (ci-après dénommé "tube à essai en plastique de 1,5 ml"). Ajouter 1 pi d'eau déminéralisée pour chaque aliquote; si on le désire, utiliser comme support pour la norme (s) interne.
   4. Ajouter 270 ul de DMSO à ce contrôle de plasma. Vortex pour garantir une dissolution complète.
3. La préparation des échantillons
   1. Obtenir autant de tubes à essai en plastique de 1,5 ml comme le nombre d'analytes () échantillons biologiques.
   2. Transfert 9 pi de chaque (analyte) échantillon biologique à son tube correspondant d'essai en plastique de 1,5 ml. Transfert 1 pi d'eau déminéralisée et 270 ul de DMSO dans chaque tube à échantillon.
   3. Mélanger vigoureusement (par exemple, vortex et / ou à plusieurs reprises la pipette de haut en bas) des échantillons pour assurer une dissolution complète dans le DMSO.
      Attention: Effectuez les étapes suivantes à l' intérieur d' une hotte. Utilisés dans les étapes suivantes, iodométhane (CH ₃ I), du dichlorométhane (CH ₂ Cl _2, alias chlorure de méthylène) et du chloroforme (CHCl _3, le trichlorométhane), sont des liquides volatiles capables de dissoudre certains types de plastique (par exemple, des gants en nitrile) . Assurez-vous d'utiliser des gants résistants aux solvants. En raison de leur pression de viscosité et de haute vapeur faible, ces réactifs peuvent goutter à partir d'une pointe de pipette pendant le transfert. Minimiser la perte de réactif et l'exposition potentielle en maintenant la solution mère à côté de la cuve de réception.
   4. Transférer un volume total suffisant de iodométhane à un petit tube propre. Chaque échantillon d'analyte nécessitera 105 iodométhane ul. Transfert ~ 500 ul de dichlorométhane dans another tube propre. Pour éviter le colmatage seringue, rincer la seringue avec du dichlorométhane immédiatement après le transfert iodométhane.
      Attention: iodométhane est photosensible, volatile et puissante toxine capable d'endommager le système nerveux central ou causant la mort en cas d' inhalation ou d' ingestion. Dichlorométhane est un cancérigène potentiel, mutagène reproduction et puissant irritant capable d'endommager plusieurs organes ou de causer la mort.
   5. Utiliser une seringue analytique pour ajouter 105 pi d'iodométhane à chaque échantillon d'analyte. tubes d'analyte Cap immédiatement pour minimiser l'évaporation iodométhane. Bien vortex et, si nécessaire, centrifuger brièvement tous les échantillons pour veiller à ce qu'aucun liquide reste dans le bouchon. Tout changement de couleur (par exemple, au brun, violet ou jaune) signale la dégradation des iodométhane, ce qui peut mettre en péril la réaction de perméthylation suivante.
   6. Rincer la seringue analytique utilisée pour transférer iodométhane avec du dichlorométhane au moins 3 fois. Cela permettra d'éviter qu'il from colmatage. Éliminer ce rinçage, avec iodométhane supplémentaire et du dichlorométhane dans un récipient de déchets dangereux organique. Placer les tubes d'essai utilisés dans un conteneur de déchets dangereux.
   7. Obtenir une nouvelle série de tubes de réservoir en plastique de 2 ml. Retirer snap-caps, si désiré.
   8. Débranchez les filtres microfuge mini. Centrifugeuse les colonnes débranchés pendant 15 secondes à 2400 × g, puis jeter les tubes de réservoir ainsi que l'effluent de DMSO.
   9. Rebranchez les colonnes de spin centrifugés, et les placer à l'intérieur des nouveaux tubes de réservoir. Numéro de chaque colonne de centrifugation et son tube de réservoir correspondant ayant le même nombre d'échantillons. Assurez-vous que les mini-prises de filtre sont serrés; une fuite potentielle peut avoir un impact à l'étape suivante. Minimiser le temps entre la suppression du DMSO dans les colonnes de centrifugation et de transfert des échantillons d'analyte sur les colonnes de spin.
   10. perméthylation
       1. Quantitativement transférer chaque solution d'échantillon à son NaOH-bead rempli co microfuge de spin correspondantlonne. Utiliser un embout de pipette de 1000 pi pour cette étape. Après le transfert, à sertir ~ 2 mm de l'extrémité d'une pointe de 200 pi et le laisser dans le contenu de la colonne à utiliser comme un agitateur. Répétez l'opération pour tous les échantillons.
          Note: La faible viscosité de iodométhane peut entraîner une perte échantillon parce que la solution d'analyte peut goutter à partir de la pointe de la pipette pendant le transfert. Maintenir le tube d'échantillon et la colonne de centrifugation adjacents les uns aux autres avec une part, et transférer rapidement la solution d'échantillon avec l'autre main.
       2. Laisser la réaction de perméthylation se dérouler pendant 11 min. Agiter chaque échantillon au moins 4-5 fois au cours de cette période. Pour faciliter perméthylation efficace, qui se produit à la surface de billes de NaOH, utiliser des embouts gel de chargement pipette tip-frisée comme Agitateurs pour mélanger délicatement le contenu de la colonne. mélange agressif peut percer le filtre de spin, pulvérisez et de suspendre des perles de NaOH (ce qui peut réduire l'efficacité de l'extraction liquide / liquide ultérieure), et / ou causer la perte de l'échantillon (comme sagranulés de NaOH mple trempés peuvent déborder de la colonne).
       3. En préparation à l'étape d'extraction liquide / liquide subséquente, préparer une quantité suffisante de 0,5 M de chlorure de sodium (NaCl) dans un tampon phosphate de sodium 0,2 M (pH 7,0), pour être stocké à température ambiante. Chaque échantillon nécessitera un total de ~ 12 ml de solution de NaCl pendant trois cycles d'extraction liquide / liquide.
       4. A l'issue de la période de 11 min perméthylation, immédiatement encore débrancher soigneusement les colonnes et les centrifuger pendant 15 secondes à 2400 x g. Jeter les bouchons.
   11. Retirer immédiatement les colonnes de spin de la centrifugeuse et les placer dans une nouvelle série de tubes réservoirs de spin vides, laissant la solution d'écoulement contenant glycanes fraîchement perméthylés derrière. Ne pas jeter quoi que ce soit.
   12. Dès que possible, ajouter 300 ul d'acétonitrile (ACN) pour les filtres, de spin NaOH remplis secs. Centrifuger les filtres de spin pendant 30 secondes à 9600 x g.
   13. Immediately par la suite, le transfert de la solution de perméthylation principale ( à savoir, la solution qui a été mis en incubation avec les billes de NaOH pendant 11 minutes , puis filé à travers le filtre de filage dans un tube à centrifuger avant l'addition de 300 pi d'ACN à l'étape précédente) à silanisé 13 x tubes à essai en verre de 100 mm contenant ⁴² 3,5 ml de 0,2 M de tampon phosphate de sodium contenant 0,5 M de NaCl, pH 7,0 et mélanger (vortex) immédiatement. Évitez de transférer tout résidu solide blanc lors de cette étape. Pour ce faire, pour chaque échantillon avant de passer à l'étape suivante.
   14. Sans délai, le transfert (combiner) l'ACN spin-travers dans chaque tube de réservoir (avec) le reste de l'échantillon liquide dans son tube de verre silanisée respectif et mélanger (vortex) immédiatement. Encore une fois, éviter de transférer tout résidu solide blanc lors de cette étape. Cap, secouer, et le vortex le tube de verre. Répétez l'opération pour chaque échantillon. Jeter les colonnes de NaOH et pipettes Pasteur dans des conteneurs de déchets appropriés.
4. Liquid / Liquid extraction et Glycan Purification
   1. A l'intérieur de la hotte, ajouter 1,2 ml de chloroforme à chaque échantillon. Immédiatement après, boucher les tubes de verre silanisées et vigoureusement mélanger le contenu.
   2. des blocs métalliques de préchauffage à environ 75 ° C, dans un collecteur d'évaporation. Utilisez des blocs de chauffage avec des puits pouvant accueillir 13 mm x 100 mm tubes en verre.
   3. Obtenir une nouvelle série de pipettes silanisées Pasteur, pipettes Pasteur non silanisées, et des tubes à essai en verre silanisées avec des bouchons.
      Attention: Chloroforme (CHCl ₃₎ est un irritant, mutagène et cancérigène potentiel capable d'imprégner par certains types de gants.
   4. Centrifuger (~ 3 000 x g) des tubes de verre contenant l'échantillon afin de séparer les phases aqueuses et organiques.
   5. Utiliser une pipette Pasteur silanisées non suffisante pour extraire la couche aqueuse supérieure telle que ~ 3 mm de la couche aqueuse reste au-dessus de la couche organique inférieure.
   6. Ajouter 3,5 ml de M Na 0,5solution de Cl dans un tampon phosphate de sodium 0,2 M (pH 7) à chaque tube de verre, mélanger vigoureusement et centrifuger brièvement (~ 3 000 x g). Comme dans l'étape précédente (1.4.3), en utilisant une pipette de Pasteur non silanisé pour extraire la couche aqueuse.
   7. Répétez l'étape précédente (1.4.4), mais laisser ~ 1 ml de la phase aqueuse.
   8. Utilisez un silanisé pipette Pasteur propre pour transférer la couche organique à un silanisé tube à essai en verre mm propre et correctement étiquetés 13 × 100. Éviter la contamination aqueuse par extraction de la manière suivante:
      1. Maintenir les deux tubes à essai en verre silanisée de courant et de nouveaux adjacents les uns aux autres dans une main. Avec l'autre main, appuyez sur le bulbe de pipette pour créer des bulles lors de l'insertion de la pipette vers le bas à travers la couche aqueuse.
      2. Une fois à l'intérieur de la couche organique, cesser de créer des bulles, et maintenir l'ampoule de pipette régulière pour permettre aux couches organiques et aqueuses pour stabiliser et se séparent à nouveau. Ensuite, relâchez lentement l'ampoule de retirer autant de la organic couche possible sans contamination aqueuse.
      3. augmenter rapidement la pointe de la pipette à travers la couche aqueuse, et de résister le réflexe naturel de relâcher légèrement l'ampoule (qui se traduit par le retrait une certaine contamination aqueuse) tout en augmentant la pipette hors du tube.
      4. Rapidement transférer la couche organique à faible viscosité pour le nouveau tube adjacent. Toute contamination aqueuse sera visible sous forme de petites gouttelettes de liquide sur le dessus de la couche organique extraite dans les nouveaux tubes de verre. Si la contamination aqueuse / NaCl est visible, retirez-le avec une pipette; centrifuger si nécessaire de mettre en commun les gouttelettes aqueuses en une seule goutte.
   9. Éliminer correctement les vieux tubes de verre, pipettes et aqueuse et des solutions de déchets organiques. Laver et recycler bouchons de tubes de verre.
   10. Sécher tous les échantillons sous un courant doux et constant d'azote dans une évaporation collecteur préchauffé à 75 ° C pendant environ 5 min dans une hotte. Pour assurer le refroidissement par évaporation pendant tout ste sec vers le basps, un flux doux et constant d'azote doit perturber la surface liquide sans éclaboussures ou éclaboussant le liquide. Prélever des échantillons provenant de l'évaporation du collecteur lors du séchage complet de l'échantillon final. taches blanches au fond d'un des tubes de verre séchées indiquent tampon / contamination de NaCl.
   11. Pause la procédure ici s'il n'y a pas assez de temps restant dans la journée pour terminer l'étape d'hydrolyse TFA. Temporairement (ie, la nuit) stocker des échantillons secs à -20 ° C. Pour continuer la procédure après stockage, retirer les échantillons du -20 ° C congélateur et leur permettre de se réchauffer complètement avant de déplafonnement.
   12. Alors que les échantillons au chaud, en préparation de l'acide trifluoroacétique (TFA) hydrolyse (étape suivante), mis le manteau de chauffage de telle sorte que la température du liquide contenu-éprouvette atteindra 121 ° C. Préparer la solution de TFA de TFA stock (voir l'étape 2.1 ci-dessous).

2. acide trifluoroacétique (TFA) Hydrolyse

Attention: l' acide trifluoroacétique (TFA) est un acide organique corrosif et irritant toxique.

1. Préparer une quantité suffisante d'une solution 2,0 M de TFA dans de l'eau déminéralisée. Chaque échantillon d'analyte, il faudra 325 pi de solution à 2,0 M de TFA. Concentré TFA est de 13,0 M.
2. Ajouter 325 ul de TFA à 2,0 M à chaque échantillon d'analyte. TFA pour empêcher l'évaporation et la perte d'échantillon lors de l'étape ultérieure de séchage (2.3), étroitement coiffer chaque tube d'échantillon immédiatement après l'addition de TFA. Marquer le niveau de la solution dans tous les tubes de verre. Vortex chaque échantillon soigneusement avant l'étape suivante.
3. Incuber les tubes d'échantillons bien fermés pendant 2 heures dans un bloc de chauffage préchauffé approprié ou four de telle sorte que le contenu atteignent une température de 121 ° C. Si l'on utilise un bloc chauffant au lieu d'un four, des tubes à échantillon de recouvrement avec une feuille d'aluminium pour empêcher la condensation de TFA dans la partie supérieure du tube et le séchage partiel du résidu de l'échantillon au fond du tube. Vérifiez les niveaux de solution d'échantillon après 20-30 min.pour assurer une évaporation minimale du TFA. Si nécessaire, serrer les bouchons plus ou remplacer bouchons pour un ajustement plus serré.
4. Pendant l'attente de 2 heures, régler une autre évaporation du collecteur à 75 ° C pour l'étape suivante (voir 2.4 ci-dessous).
5. Lorsque la période de chauffage de 2 heures est des échantillons complets, sèche à 75 ° C sous un léger courant d'azote gazeux pendant environ 15 min. Ne pas laisser les échantillons sans surveillance pendant plus de 15 min. Vérifiez fréquemment des échantillons, et interrompre le chauffage et le séchage, une fois tous les échantillons sont secs.
6. Pause la procédure ici s'il n'y a pas assez de temps restant dans la journée pour terminer l'étape de réduction. Temporairement (c. -à- nuit) conserver les échantillons à -80 ° C. Pour continuer la procédure après stockage, retirer les échantillons du -80 ° C congélateur, et leur permettre de se réchauffer complètement avant de déplafonnement.

3. Réduction

1. À l' intérieur d' une hotte, préparer une quantité suffisante d'un borohydrure / L de sodium 10 g (NaBH ₄₎ en solution dans 1 M Ammonium hydroxyde (NH ₄ OH). Chaque échantillon nécessitera 475 pi de cette solution. Faire une solution fraîche pour chaque lot d'échantillons. L' hydroxyde d'ammonium concentré (27-30% p / p de NH ₃₎ est d' environ 14,5 M.
   Attention: borohydrure de sodium (NaBH ₄₎ est une toxine réactif à l' eau hygroscopique et irritant puissant qui libère-au contact avec des vapeurs inflammables hautement eau qui causent des brûlures graves lors d'un contact par inhalation, ingestion ou yeux / peau.
   Attention: l' hydroxyde d' ammonium (NH ₄ OH) est un irritant corrosif et la toxine capable de causer des brûlures graves et des lésions organiques irréversibles au contact par inhalation, ingestion ou yeux / peau. Rincer les zones touchées avec de l'eau pendant 30 minutes, et empêcher la victime de frotter ou de gratter les zones touchées.
2. A chaque échantillon, ajouter 475 ul de 10 g / l de NaBH ₄ dans 1 M de NH ₄ OH. Mélanger les échantillons soigneusement pour dissoudre tous les résidus. tubes à essai et Cappermettre à la réaction de réduction se poursuivre pendant 1 h.
3. Pendant l'attente de 1 h, réglez l'évaporation du collecteur chauffé à 75 ° C. Utilisez un bloc de chauffage avec des puits appropriés pour les tubes de verre (voir 3.4 ci-dessous).
4. Lorsque la période de réaction de 1 heure est terminée, ajouter 63 ul de methanol (MeOH) à chaque échantillon. Cette étape et l'étape suivante supprimer le bore résiduel triméthyl borate - un liquide relativement volatil qui bout à 68 ° C.
5. Des échantillons secs (dans le collecteur préchauffé) à 75 ° C sous un léger courant d'azote gazeux pendant environ 15 min. Vérifiez fréquemment des échantillons et ne pas les laisser sans surveillance. De petites gouttelettes de liquide au fond des tubes en verre indiquent que l'échantillon est pas encore sec.
   Remarque: Pour distinguer les bulles d'air des gouttelettes de liquide, incliner le tube à essai. Seules les gouttelettes de liquide se déplacent après basculement, mais l'inverse est pas toujours vrai: si une bulle ne bouge pas, il peut encore être un (très petit) gouttelette de liquide.
6. Une fois samples sont complètement secs, préparer un 9: solution 1 (v / v) de méthanol (MeOH) et d'acide acétique (AcOH). Ajouter 125 ul de cette solution MeOH: AcOH à chaque échantillon.
7. Des échantillons secs (dans un collecteur préchauffé) à 75 ° C sous un léger courant d'azote gazeux.
8. Lorsque les échantillons sont complètement secs, vide-sécher les échantillons pendant 20 minutes à la température ambiante: Placer les échantillons dans une baignoire vide en plastique (tels que ceux vendus par FoodSaver), fermer le couvercle à vide, réglez la molette de vide "vide", connecter le tuyau d'aspiration, et son tour sur le vide. Pour démonter le vide, inverser ces étapes. Attendez que le système pour décompresser complètement avant de tenter d'ouvrir le couvercle du vide.
9. Pause la procédure ici s'il n'y a pas assez de temps restant dans la journée pour terminer l'étape de réduction. Temporairement (c. -à- nuit) conserver les échantillons à -80 ° C. Pour continuer la procédure après stockage, retirer les échantillons du -80 ° C congélateur, et leur permettre de se réchauffer complètement avant uncapping.
10. En attendant pour les échantillons à vide à sec (ou chaud, après le stockage), préparer les réactifs pour la prochaine étape. Obtenir et numéro un échantillonneur automatique conique inférieure silanisé (AS) flacon (avec bouchon) pour chaque échantillon. En outre, avant la chaleur à la fois un bloc profond puits AS-flacon de chauffage et d'un bloc de verre tube puits profond de telle sorte que le contenu du tube de verre atteint une température de 50 ° C.

4. acétylation (Joué dans un hottes)

1. Ajouter 18 ul d'eau déminéralisée à chaque échantillon. Cap et à fond tous les tubes vortex pour dissoudre complètement tous précipités.
2. Ajouter de l'anhydride acétique, 250 ul à chaque tube de verre. Cap, profondeur vortex et traitement par ultrasons dans un bain d'eau pendant 2 minutes pour assurer une dissolution complète de tous les résidus et les précipités.
3. Couvrir des tubes de verre avec une feuille d'aluminium et on incube à une température interne de 50 ° C pendant 10 min.
4. Ajouter 230 ul d'acide trifluoroacétique concentré (TFA) à chaque échantillon. plafonner immédiatement unD mélanger les échantillons. Ensuite, incuber des échantillons-recouverts d'une feuille d'aluminium pendant 10 minutes à une température interne de 50 ° C.
5. Après incubation, on ajoute 1,8 ml de dichlorométhane (CH ₂ Cl ₂₎ pour chaque échantillon. Cap et bien mélanger.
6. Ajouter 2,0 ml d'eau déminéralisée à chaque échantillon. Cap et des échantillons de mélange ainsi. Centrifugeuse de 0 à 3000 x g pour séparer les couches. Utiliser une pipette Pasteur non silanisé pour effectuer une extraction liquide / liquide comme décrit dans l'étape 1.4.6, ce qui évite la contamination de l'eau.
7. Répéter l'extraction une fois de plus, pour un total de deux extractions. Utilisez pipettes Pasteur silanisées pour transférer la couche organique dans étiquetée silanisé AS flacons (tenue en toute sécurité dans un rack AS). Remplir les flacons AS juste en dessous du bord.
8. Utilisez un, peu profonde et le bloc de chauffage pré-chauffé à des échantillons secs (dans des flacons AS) pendant 15 min à 40 ° C sous azote gazeux. Ne pas trop sec. Les produits finaux sont connus comme les acétates d'alditols partiellement méthylés (PMAAs).

5. chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse (GC-MS)

1. Reconstituer chaque échantillon dans 100 pi d'acétone et bien mélanger. Utilisez un échantillonneur automatique pour injecter 1 pl de chaque échantillon en mode divisé dans la GC en mode divisé doublure (maintenu à 280 ° C et contenant un petit tampon de laine de verre silanisée). Utiliser un rapport de division de 40. L'utilisation de l'hélium comme gaz porteur dans le mode de débit constant à 0,8 ml / min à travers une colonne GC DB-5ms 30 m avec un ID de 0,25 mm et 0,25 micromètre d'épaisseur de film.
2. Maintenez la température GC initiale du four à 165 ° C pendant 0,5 min. Après le temps d'attente initial, le programme du four à la rampe de la température, pour chaque essai, à partir de 165 ° C à 265 ° C à une vitesse de 10 ° C / min (ce qui prend 10 min), puis la rampe immédiatement la température de 265 ° C à 325 ° C à une vitesse de 30 ° C / min (ce qui prend 2 minutes) et maintenir la température à 325 ° C pendant 3 min. La durée totale de fonctionnement par échantillon est de 15,5 min.
3. Utilisez un properly réglé et étalonné spectromètre de masse pour soumettre les composants de l'échantillon d'élution de la colonne de GC à ionisation électronique (IE, 70 eV à 250 ° C). Pour un analyseur de masse à TOF, l' analyse de fragments de m / z 40 m / z 800 avec un taux d'addition d' impulsion de 0,1 sec. Définir un EI-filament temps de retard de solvant de 2,5 min.

Analyse 6. Données

1. Si l'on utilise un analyseur de masse TOF, la somme des ions fragments les plus abondants et / ou de diagnostic pour chaque PMAA en appliquant une fenêtre de masse de 0,15 Da pour obtenir un chromatogramme d'ions extrait. Ions cibles pour chaque PMAA ont été publiés ailleurs, ³³ mais les modifications suivantes ont été apportées: les ions t-Glc sont maintenant 145,1 + 205,1; 2-Man ions sont 161,1 + 189,1; 3-Gal ions sont 161.1 + 233.1, 6-Gal ions sont 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man ion est 189,1; ions 3,6-Man sont 189,1 + 233,1.
2. Utilisez QuanLynx ou un autre logiciel pour intégrer automatiquement les zones de pointe pour chaque résumé extrait chromatogramme d'ions.
3. vérifier manuellement les résultats d'intégration en consultant chaque chromatogramme ionique extrait intégré. Ensuite, exporter les données d'intégration de pointe à une feuille de calcul pour analyse et la normalisation des données, qui consiste à diviser la surface de chaque hexose XIC individuelle par la somme de toutes les zones de hexose XIC; De même, la surface de chacun HexNAc XIC est divisée par la somme de toutes les zones HexNAc XIC. Cette procédure produit des abondances normalisées pour chaque individu et de l'hexose HexNAc.

Résultats

Chromatogramme de courant ionique total (CIT) présentant perméthylation, de l' hydrolyse, la réduction et l' acétylation des échantillons de plasma sanguin humain par rapport au cas où les deux étapes critiques de la perméthylation ont été exécutées de manière incorrecte sont représentés sur la figure 3.

Absolute Rendement HexNAcs relative à hexoses:

Discussion

En général, la production réussie d'acétates d' alditol partiellement méthylés de (PMAAs) à partir des hexoses se heurte à moins de difficultés et est plus robuste que la production réussie de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Le mécanisme exact de ce phénomène car il joue dans toutes les étapes de cette procédure est inconnue, mais doit se rapporter à la chimie unique du groupe acétyl N (plutôt que le groupe hydroxyle) qui est unique à HexNAcs par rapport à hexoses. Le mécanisme de ce phénom...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Perles d’hydroxyde de sodium  ;	367176	Sigma-Aldrich  ;	20-40 mesh, qualité réactif 97 %
0,9 ml Colonne de centrifugation	69705	Division Pierce de ThermoFisher Scientific  ;	Comprend des prises et des frittes de polyéthylène
Flacon d’échantillonneur automatique GC-MS (silanisé)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP Flacon à haute récupération, 1,5 ml, 12  ; mm x 32  ; mm, comprend des capuchons perçables doublés de téflon
Tubes à essai en polypropylène de 1,5 ml	05-402-25	ThermoFisher Scientific  ;	Couvercle à pression
Tubes à essai en polypropylène de 2 ml	05-408-138	ThermoFisher Scientific  ;	Couvercle à pression
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich  ;	BioRéactif pour la biologie moléculaire, qualité réactif >99,0 %
Iodomethane  ;	I8507	Sigma-Aldrich  ;	Contient du cuivre comme stabilisant, ReagentPlus 99 %
Acétonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific  ;	Optima LC/MS
Microcentrifugeuse	75002436 : Centrifugeuse Sorvall Legend Micro 17	ThermoFisher Scientific  ;	24 rotors 1,5/2,0 avec couvercle de bioconfinement ClickSeal. Numéro de catalogue du rotor : 75003424
tube à essai en verre 13 x 100 (silanisé)*	53283-800	Tubes à essai en	verre borosilicate VWR 13 mm x 100 mm avec finition à bouchon à vis
Capuchons pour tubes à essai en verre	14-930-15D	ThermoFisher Scientific  ;	Kimble&trade ; Bouchons à vis phénoliques noirs ; 13  ; mm-415 filetage GPI ; Revêtement en caoutchouc PTFE.
Chlorure de sodium  ;	S7653	Sigma-Aldrich  ;	>99,5 % pur
Chloroforme	4440-08	Macron Fine Chemicals  ;
Acide trifluoroacétique  ;	299537	Sigma-Aldrich  ;	99 % purifié par redistillation pour le séquençage des protéines  ;
Borohydrure de sodium	71321	Fluka Analytical  ;	99 %
Solution d’hydroxyde d’ammonium  ;	320145	Sigma-Aldrich  ;	Teneur en NH3 : 28,0-30,0 %
Méthanol	AH230-4	Honeywell Burdick &	de qualité HPLC
;	320099	Sigma-Aldrich  ;	99,70 %
Dessiccateur sous vide en plastique  ;	Tout modèle de taille adéquate	FoodSaver
Anhydride acétique  ;	539996	Sigma-Aldrich  ;	99,50 %
Dichlorométhane  ;	D143SK-4	ThermoFisher Scientific  ;	Grade HPLC stabilisé
Acétone  ;	9006-03	J.T.Baker	Baker analysé  ;
Collecteur d’évaporation chauffé (unité principale)	pi18823	ThermoFisher Scientific  ;	Thermo Scientific* Module de chauffage et d’agitation Reacti-Therm* ; Modèle à trois blocs avec fonction de chauffage et
d’agitation Collecteur d’évaporation chauffé (évaporateur aérien)	pi18826	ThermoFisher Scientific  ;	ThermoScientific* Évaporateur Reacti-Vap, 27 ports ; À utiliser avec le module de chauffage à trois blocs Reacti-Therm
Blocs porte-échantillons en aluminium pour collecteur d’évaporation	pi18816	ThermoFisher Scientific  ;	Bloc, aluminium, Reacti-Block S-1, peut contenir 13 mm diamètre, tubes à essai, 13 trous (14  ; mm dia. x 45  ; mm de profondeur)
Chromatographe en phase gazeuse	Modèle A7890	Agilent  ;	Équipé d’un passeur d’échantillons CTC PAL
Spectromètre de masse  ;	GCT Premier (Temps de Vol)	Eaux  ;
Doublure en mode split (désactivé / silanisé)	5183-4647	Agilent	Contenant un petit bouchon de laine de verre silanisée
DB-5ms Colonne GC	122-5532	Agilent	30 m x 0,25 mm ID x 0,25 micron épaisseur
du film Chlorotriméthylsilane	95541	Sigma-Aldrich  ;
Dessiccateur sous vide en verre (pour la silanisation de la verrerie)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12 » de large ; 230 mm taille
*La silanisation de la verrerie est effectuée en interne, pendant la nuit, à l’aide de vapeur de chlorotriméthylsilane dans un grand dessiccateur sous vide en verre.