Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l'image du développement Zebrafish Eye

Résumé

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est un excellent outil pour l’imagerie du développement embryonnaire. Il permet d’enregistrer de longs films en accéléré d’embryons vivants dans des conditions physiologiques proches. Nous démontrons son application pour l’imagerie du développement de l’œil du poisson-zèbre à de larges échelles spatio-temporelles et présentons un pipeline pour la fusion et la déconvolution d’ensembles de données multivues.

Résumé

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) gagne de plus en plus en popularité en tant que méthode d’imagerie du développement embryonnaire. Les principaux avantages de la LSFM par rapport aux systèmes confocaux sont sa faible phototoxicité, ses stratégies de montage douces, son acquisition rapide avec un rapport signal/bruit élevé et la possibilité d’imager des échantillons sous différents angles (vues) pendant de longues périodes. L’imagerie à partir de plusieurs vues libère tout le potentiel de LSFM, mais en même temps, elle peut créer des ensembles de données de la taille d’un téraoctet. Le traitement de tels ensembles de données est le plus grand défi de l’utilisation de LSFM. Dans ce protocole, nous esquissons quelques solutions à ce problème. Jusqu’à récemment, la LSFM était principalement pratiquée dans des laboratoires qui avaient l’expertise nécessaire pour construire et exploiter leurs propres microscopes à feuillet de lumière. Cependant, au cours des trois dernières années, plusieurs implémentations commerciales de LSFM sont devenues disponibles, qui sont polyvalentes et faciles à utiliser pour tout biologiste du développement. Cet article s’adresse principalement aux chercheurs, qui ne sont pas des développeurs de technologie LSFM, mais qui souhaitent utiliser LSFM comme outil pour répondre à des questions spécifiques de biologie du développement.

Ici, nous utilisons l’imagerie du développement de l’œil du poisson zèbre comme exemple pour présenter au lecteur la technologie LSFM et nous démontrons les applications de la LSFM à plusieurs échelles spatiales et temporelles. Cet article décrit un protocole expérimental complet commençant par le montage d’embryons de poisson-zèbre pour le LSFM. Nous décrivons ensuite les options d’imagerie à l’aide du microscope à feuillet de lumière disponible dans le commerce. Il est important de noter que nous expliquons également un pipeline pour l’enregistrement ultérieur et la fusion d’ensembles de données multivues à l’aide d’une solution open source mise en œuvre en tant que plugin Fiji. Bien que ce protocole se concentre sur l’imagerie de l’œil du poisson-zèbre en développement et le traitement des données à partir d’une configuration d’imagerie particulière, la plupart des informations et des suggestions de dépannage présentées ici sont d’usage général et le protocole peut être adapté à une variété d’expériences de microscopie à feuillet de lumière.

Introduction

Morphogenèse est le processus qui façonne l'embryon et, avec la croissance et la différenciation entraîne l'ontogenèse d'un ovule fécondé dans un organisme multicellulaire mature. Les processus morphogénétiques au cours du développement des animaux peuvent être analysées mieux par imagerie des spécimens vivants intacts ^1-3. En effet, comme l'imagerie de l'embryon entier conserve tous les composants qui alimentent et régulent le développement, notamment des gradients de molécules de signalisation, la matrice extracellulaire, du système vasculaire, innervation ainsi que les propriétés mécaniques du tissu environnant. Pour combler les échelles, à laquelle la morphogenèse se produit, les événements intracellulaires rapides doivent être capturés sur une échelle de temps de minutes dans le contexte du développement de l'ensemble du tissu au cours des heures ou des jours. Pour répondre à toutes ces exigences, une implémentation moderne ⁴ du orthogonale plane illumination microscope ⁵ a été développé. A l'origine, il a été nommé sélective Plan Illumination Microscopy (SPIM) ^4; maintenant une feuille de lumière terme embrasse tout Fluorescence Microscopy (LSFM) est généralement utilisé. LSFM permet une imagerie à haute résolution temporelle, tout en induisant moins phototoxicité que le balayage laser ou disque rotatif de microscopes confocaux ^6,7. Aujourd'hui, il existe déjà de nombreuses implémentations du principe de base feuille de lumière d'éclairage et il a été utilisé à l' image d' une grande variété de spécimens et les processus précédemment inaccessibles aux chercheurs ^8-11.

Nous voudrions d'abord de mettre en évidence plusieurs avantages clés de LSFM par rapport aux approches de microscopie confocale classiques:

Pour acquérir des résultats significatifs de l'imagerie en direct des expériences microscopiques, il est important que l'observation ne concerne que très peu l'échantillon. Cependant, de nombreux organismes, y compris le poisson zèbre sont très sensibles à l'exposition de lumière laser, ce qui rend difficile à l'image dans un microscope confocal à haute résolution temporelle sans phototoxicité effets comme bloqué ou retardé ^6,7 de développement. LSFM est actuellement la technique d'imagerie de fluorescence avec le moins d' effets perturbateurs sur l'échantillon ^7. Comme la feuille de lumière laser mince illumine seulement la partie de l'échantillon qui est imagée à un point de temps particulier, la feuille microscope optique est en utilisant des photons très efficacement. Par conséquent, l'exposition à la lumière faible permet de plus longues observations time-lapse de spécimens sains, par exemple ^12-17. En outre, grâce à l'invasivité minimale de LSFM, le nombre d'images acquises ne sont plus dictées par la quantité de lumière de l'échantillon peut tolérer, mais plutôt par la quantité de données peuvent être traitées et stockées.

Dans le même sens de garder l'échantillon dans des conditions proches physiologiques, LSFM est livré avec des exemples de stratégies de montage alternatives bien adaptés pour les embryons vivants. Dans les techniques de LSFM, les embryons sont généralement intégrés dans une mince colonne de faible pourcentage d'agarose. Le mounting dans les cylindres d'agarose permet la liberté totale de rotation, de sorte que l'échantillon peut être observée à partir de l'angle parfait (en LSFM appelé vue) et à partir de plusieurs vues simultanément. L'imagerie multiview et la fusion subséquente multiview est bénéfique en particulier pour les grands, les spécimens de diffusion et permet de les capturer avec une haute résolution isotrope. Un résumé des autres stratégies de LSFM de montage possibles peut être trouvée dans le manuel d'utilisation du microscope officiel, dans le chapitre sur la préparation de l'échantillon écrit par le laboratoire de E. Reynaud. Il est recommandé d'une lecture, surtout si l'objectif est d'image différents échantillons que ceux décrits ici.

L'acquisition de l'image dans LSFM est basé caméra grand champ, par opposition à balayage laser microscope confocal. Il en résulte un signal plus élevé sur bruit (SNR) pour les images acquises et peut être très rapide (quelques dizaines à quelques centaines d'images par seconde). La grande sensibilité de LSFM permet en outre de l'imagerie samp faiblement fluorescentles, comme des facteurs de transcription exprimés à des niveaux endogènes ¹⁸ ou, dans un avenir proche, les protéines endogènes marqués en utilisant CRISPR / cas9. Le SNR élevé est également important pour le succès de l'analyse d'image en aval. La haute vitesse est nécessaire non seulement de capturer des processus intracellulaires rapides, mais aussi à l'image tout embryon à partir de plusieurs points de vue assez rapide. Une fusion parfaite entre les multiples points de vue ne peut être atteint, si le phénomène observé ne change pas lors de l'acquisition de ces plusieurs piles z provenant de vues séparées.

Les avantages de LSFM ne viennent généralement au détriment de la qualité de l'image. La résolution latérale de LSFM est légèrement pire que la résolution d'un microscope confocal. En effet, les objectifs de détection utilisés dans LSFM ont une ouverture numérique plus faible (généralement 1,0 ou moins) par rapport à des objectifs de 01/02 à 01/03 d'eau ou d'immersion de silicium sur les configurations de confocale classiques. En outre, en raison de la détection de champ large en LSFM (AbsenCE d'un sténopé), il n'y a plus de lumière hors-focus par rapport à un microscope confocal. La quantité de lumière hors-focus est déterminé par l'épaisseur de la nappe de lumière. Néanmoins, ces inconvénients sont compensés par le SNR supérieur en LSFM. Dans la pratique, cela se traduit par des images de qualité similaires par rapport à par exemple la filature disque acquisition confocal ^15. Par conséquent, ce qui permet une extraction fiable des fonctionnalités telles que des membranes ou des noyaux cellulaires, par exemple, pour la lignée cellulaire de traçage ^15,19.

La résolution axiale LSFM est déterminée, en plus de l'objectif de détection, par l'épaisseur de la nappe de lumière. La résolution axiale de LSFM peut, dans certains cas dépasser la résolution des microscopes confocaux. Tout d'abord, l'amélioration de la résolution vient quand la feuille de lumière est plus mince que la résolution axiale de l'objectif de détection, ce qui se produit généralement pour les grands spécimens imagées avec un objectif à faible grossissement. La deuxième façon, comment le LSFM peut atteIEVE meilleure résolution axiale, est la fusion de multiview, dans lequel les informations de haute résolution xy de différents points de vue est combiné en une seule pile d'images. La pile fusionnée résultante a une résolution isotrope approchant les valeurs de résolution dans le sens latéral ^20,21. La stratégie d'enregistrement des vues multiples sur l'autre décrit dans cet article est basé sur l' utilisation de billes de polystyrène fluorescentes comme marqueurs fiduciaires intégrés dans l'agarose autour de l'échantillon ^20,21.

À la suite de la commercialisation de LSFM, cette technique est maintenant disponible pour une large communauté de scientifiques ^22. Par conséquent, la motivation pour la rédaction de ce protocole est de rendre cette technologie accessible aux biologistes du développement qui manquent d'expérience pratique dans LSFM et pour obtenir ces scientifiques ont commencé à utiliser cette technologie avec leurs échantillons. Notre protocole utilise le microscope à feuille de lumière commerciale, ce qui constitue un microscope conceptuellement simple tchapeau est facile à utiliser. Nous aimerions en outre évoquer d' autres protocoles récents pour l' imagerie zebrafish avec des configurations de LSFM maison construite, qui pourraient convenir pour répondre à des questions particulières ^23-25. Une autre option d'entrée à LSFM sont les plates - formes ouvertes ^26,27, qui utilisent les principes d'accès ouvert pour apporter la microscopie nappe de lumière à une communauté plus large. La documentation à la fois du matériel et les aspects logiciels peuvent être trouvées à http://openspim.org et https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

Dans ce protocole, nous utilisons le zebrafish téléostéens comme un système modèle pour étudier les processus de développement avec LSFM. Morphogénèse de l'oeil du poisson zèbre est un exemple qui souligne un grand nombre des avantages de LSFM. LSFM a déjà été utilisé dans le passé pour étudier le développement des yeux dans medaka ²⁸ et chez le poisson zèbre ^29,30. Au stade précoce du développement de l'œil, il est compliqué d'orienter l'embryon correctement pour la microscopie conventionnelle,comme le jaune encombrant ne permet pas l'embryon de se coucher sur le côté avec son oeil face à l'objectif. Cependant, avec LSFM de montage dans une colonne d'agarose, l'échantillon peut être positionné de manière reproductible. En outre, lors du passage de la vésicule optique au niveau optique coupe, l'œil subit morphogénétiques remaniements majeurs accompagnés d'une croissance, ce qui nécessite la capture d'une grande z empilement et un grand champ de vision. Aussi pour ces défis LSFM est supérieure à l'imagerie confocale conventionnelle. Le processus de formation de cupule optique est en trois dimensions, il est donc difficile de comprendre et de visualiser uniquement par l'imagerie d'une vue. Cela rend l'imagerie multiview avec une résolution isotrope bénéfique. Après la formation de la cupule optique, la rétine devient de plus en plus sensible à l'exposition au laser. Ainsi, la faible phototoxicité associée à LSFM est un atout majeur pour l'imagerie à long terme.

Nous présentons ici un protocole optimisé pour l'imagerie d'un à trois jours vieux zebrafish embryons d'unnd larves en mettant l'accent sur le développement de l'œil. Notre méthode permet d'enregistrer des films en accéléré couvrant jusqu'à 12-14 heures avec une résolution spatiale et temporelle. Surtout, nous montrons également un pipeline pour le traitement des données, ce qui est une étape essentielle dans LSFM, car cette technique génère toujours de grands ensembles de données, souvent dans la gamme de téraoctet.

Protocole

NOTE: Tous les travaux des animaux a été réalisée conformément à l'Union européenne (UE) la directive 2011/63 / UE et la Loi sur la protection des animaux allemande. Le protocole est destiné à être suivi, sans interruption, du montage à l'imagerie de l'échantillon. En fonction de l'expérience pratique, il faudra 2-3 heures pour commencer une expérience time-lapse. Le traitement des données ne sont pas inclus dans le calcul du temps. Tout le matériel nécessaire pour l'expérience peut être trouvée dans la liste du matériel nécessaire avant de commencer qui est fourni en tant que document complémentaire. Porter des gants poudrés pendant les étapes 1, 2, 3 et 4. Pour les étapes 2, 3, 4 et 5 du protocole se réfère également au manuel d'utilisation du microscope officiel.

1. Le travail préparatoire avant l'expérience d'imagerie

1. Fluorescent Bead Stock Solution
   1. Pour ce protocole, utiliser les billes de diamètre polystyrène 500 ou 1000 nm (marquées en rouge émettant un colorant fluorescent). La dilution de travail des perles est de 1: 4,000. Tout d'abord, vortex la solution perle de stock pour 1 min. Diluer 10 ul de billes dans 990 pi de ddH ₂ O. Conserver la solution dans l'obscurité à 4 ° C et utiliser cette dilution 1: 100 comme solution de stock pour une dilution supplémentaire dans 1:40.
2. Solution Préparation de la chambre échantillon
   1. Dans un bécher de 100 ml mélange 38,2 ml de milieu E3 sans bleu de méthylène, 0,8 ml de 10 mM de N -phenylthiourea et 1 ml de 0,4% de MS-222. Il est avantageux d'utiliser milieu E3 filtrée pour éviter les petites particules de poussière ou de cristaux non dissous flottant dans la chambre d'échantillon plus tard.
3. Sélection d'embryons de poisson fluorescent
   1. Dans les jours avant l'expérience, la préparation des embryons exprimant des protéines fluorescentes. Juste avant l'expérience, trier les embryons sous le stéréoscope fluorescent pour la force souhaitable du signal fluorescent. Prenez 5-10 embryons sains et dechorionate les utiliser une pince à épiler.
      NOTE: Ce protocole est optimisé pour le vieux 16-72 hembryons.

2. Configuration de la Chambre échantillon

1. Montage de la Chambre Trois Fenêtres
   1. Il y a 4 fenêtres dans la chambre d'échantillon, l'un pour l'objectif et trois à être scellé avec les lamelles (diamètre 18 mm, épaisseur de 0,17 mm sélectionnés). Conservez ces lamelles dans 70% d'éthanol. Essuyez les nettoyer avant de les utiliser avec de l'éther: éthanol (1: 4).
   2. Insérez la lamelle dans la fenêtre à l'aide de pinces fines et assurez-vous qu'il insère dans la plus petite rainure. Couvrir avec le 17 mm caoutchouc d'un diamètre joint torique et visser la bague d'adaptation d'éclairage en utilisant l'outil de la fenêtre de la chambre. Répétez le processus pour les deux autres fenêtres.
2. Fixation des pièces restantes Chambre
   1. Vissez l'adaptateur pour un objectif approprié dans le quatrième côté restant de la chambre. Insérez le diamètre joint torique de 15 mm dans le centre de l'adaptateur.
   2. Vissez l'adaptateur Luer-Lock blanc dans l'ouverture en bas à droite dans la chambre et le raccord de vidange de gris dans l'ouverture supérieure gauche. Bloquer tous les trois ouvertures restantes avec les bouchons noirs.
   3. Fixer le bloc Peltier et la lame de fond en queue d'aronde en métal de la chambre à l'aide d'une clé Allen. Fixer le tuyau avec le seringue de 50 ml à l'adaptateur Luer-Lock. Insérez la sonde de température dans la chambre.
3. Insertion des objectifs et de la Chambre dans le Microscope
   1. Vérifiez sous le stéréoscope que tous les objectifs sont propres. Utilisez les 10X / 0.2 objectifs d'éclairage et l'objectif de détection Plan-Apochromat 20X / 1.0 W et assurez-vous que sa réfraction bague de correction de l'indice est fixé à 1,33 pour l'eau. Vissez l'objectif de détection dans le microscope, tout en conservant les objectifs d'éclairage couverts.
   2. Retirer les capuchons de protection en plastique couvrant les objectifs d'éclairage. Faites glisser délicatement la chambre dans le microscope et le serrer avec la vis de fixation.
   3. Connectez le pro de la températureêtre et le bloc Peltier au microscope.
      REMARQUE: Les deux tubes qui font circuler le liquide de refroidissement du bloc Peltier sont compatibles avec les connecteurs. Ils forment un circuit qui fonctionne indépendamment de l'orientation de la connexion.
   4. Remplir la chambre à travers la seringue avec la solution préparée à l'étape 1.2 jusqu'à l'arête supérieure de la fenêtre de la chambre. Vérifiez que la chambre ne fuit pas.
   5. Démarrez le microscope, l'incubation et les ordinateurs de contrôle et de stockage. Démarrez le logiciel de microscope de fonctionnement et régler la température d'incubation à 28,5 ° C.
      NOTE: Il faudra 1 heure pour équilibrer complètement. Préparer l'échantillon dans l'intervalle.

Préparation 3. Sample

1. La préparation du mélange Agarose
   1. 15 min avant de faire du mélange d'agarose, faire fondre une aliquote de 1 ml de 1% à faible point de fusion d'agarose (dissous dans un milieu E3) dans un bloc chauffant réglé à 70 ° C. Une fois que l'agarose est complètement moldix, transférer 600 ul dans un nouveau tube de 1,5 ml, ajouter 250 pi de milieu E3, 50 ul de 0,4% MS-222 et 25 pl de tourbillonnement solution perle de stock.
      NOTE: Cela fait 925 ul du mélange, tandis que 75 pi supplémentaires est calculé pour le liquide ajouté plus tard en même temps que les embryons.
   2. Garder le tube dans un second bloc de chauffage à 38-40 ° C ou veiller à ce que l'agarose est très proche de son point de gélification avant de mettre les embryons d'échantillons en elle.
2. Montage du Embryons
   1. Prenez cinq capillaires en verre de volume de 20 pi (avec une marque noire, ~ 1 mm de diamètre intérieur) et insérer les plongeurs de pointe correspondant de Teflon en eux. Pousser le piston à travers le capillaire de sorte que la pointe de téflon se trouve au fond du capillaire.
   2. Transfert cinq embryons (un nombre qui peut être monté à la fois) avec un verre ou d'une pipette en plastique dans le tube de tourbillonnement 37 ° C mélange chaud agarose.
      REMARQUE: Essayez de porter sur un volume minimum d'esprit ensemble liquideh les embryons.
   3. Insérer le capillaire dans le mélange et aspirer un embryon à l'intérieur en tirant le piston vers le haut. Assurez-vous que la tête de l'embryon pénètre dans le capillaire avant la queue. Évitez les bulles d'air entre le piston et l'échantillon. Il devrait être de ± 2 cm d'agarose au-dessus de l'embryon et ± 1 cm en dessous. Répétez l'opération pour les embryons restants.
   4. Attendez jusqu'à ce que l'agarose se solidifie complètement, ce qui se passe en quelques minutes, puis stocker les échantillons dans un milieu E3, en les collant à la paroi d'un récipient avec de la plasticine ou de ruban adhésif. L'ouverture inférieure du tube capillaire doit être suspendu libre dans la solution permettant l'échange de gaz à l'échantillon.
      NOTE: Un protocole similaire aux sections 3.1 et 3.2 peuvent également être trouvés sur la OpenSPIM page wiki http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

Positionnement 4. Sample

1. Sample Assemblée Holder
   1. Insérez 2 pochettes en plastique de la bonne taille (noir)les uns contre les autres dans la tige du porte-échantillon. Leurs côtés fendues doivent faire face vers l'extérieur. Fixer la vis de serrage sans serrer en le tournant 2-3 tours. Insérer le capillaire à travers la vis de serrage et le pousser à travers le support jusqu'à ce que la bande de couleur noire devient visible de l'autre côté. Évitez de toucher le piston.
   2. Serrer la vis de serrage. Poussez les excès de 1 cm d'agarose ci-dessous l'embryon du capillaire et le couper. Insérer la tige dans le disque de support d'échantillon.
   3. Confirmer que dans le logiciel de la platine du microscope est en position de charge. Utilisez des rails de guidage pour glisser le support entier avec l'échantillon verticalement vers le bas dans le microscope. Tournez, de sorte que les serrures magnétiques des disques de support en position.
2. Localisation de la Capillaire
   1. A partir de maintenant, le contrôle de l'échantillon de positionnement par le logiciel. Dans l'onglet Repérez choisissez l'option capillaire Localiser et positionner le capillaire en x, y et z dans le foyer juste au- dessus de l'objet de détectionlentille ive. Utilisez la représentation graphique dans le navigateur de l'échantillon à titre indicatif.
   2. Pousser doucement l'embryon hors du capillaire jusqu'à ce qu'il soit en face de la pupille de l'objectif de détection.
      NOTE: Le "capillaire Localiser" est la seule étape dans le protocole restant, au cours de laquelle le couvercle supérieur du microscope doit être ouverte et l'échantillon est poussé dehors.
3. Localisation de l'échantillon
   1. Passer à l'option 'Localiser échantillon »et à 0.5 zoom apporter l'oeil zebrafish dans le centre du champ de vision. Tourner l'embryon, de sorte que la nappe de lumière ne passera pas par toutes les parties hautement réfraction ou absorption de l'échantillon avant qu'il atteigne l'œil. De même, la fluorescence émise a besoin d'une voie claire de l'échantillon. Cliquez sur 'Home Set Position'.
   2. Ouvrez la porte avant du microscope et de mettre le couvercle en plastique avec une ouverture de 3 mm sur le dessus de la chambre pour éviter l'évaporation.
      NOTE: Si le niveau de liquide descend en dessousle niveau de formation d'image, l'expérience sera compromise.
   3. Vérifiez le rythme cardiaque de l'embryon comme un proxy pour la santé globale. Si elle est trop lente, utiliser un autre échantillon (comparer à des contrôles non-montés, les valeurs spécifiques dépendent du stade de développement). Passez au réglage de zoom final et réajuster la position de l'embryon.

5. Mise en place d'une acquisition Multidimensional

1. Paramètres d'acquisition
   1. Passez à l'onglet «Acquisition». Définir le chemin de lumière, y compris des lignes de laser, l'objectif de détection, laser filtre de blocage, diviseur de faisceau et les caméras.
   2. Activez la case à cocher de balayage de pivot. Définissez les autres paramètres d'acquisition comme la profondeur de bits, le format d'image, l'épaisseur de la nappe de lumière et de choisir un éclairage simple face.
   3. La presse «continu» et en fonction de l'intensité de l'image obtenue à changer le temps de la puissance du laser et de l'exposition de la caméra.
      NOTE: Pour régler tous les paramètres d'imagerie utilisent lespuissance s laser (0,5% de 100 mW laser, 30 temps d'exposition msec), que pour l'expérience réelle pour éviter inutiles dommages photo à l'échantillon.
2. Fiche Lumière Réglage
   1. Passez à l' 'éclairage double face »et activer le 'case en ligne Double Side Fusio'n. Démarrez le 'Lightsheet Auto-adjust assistant. Suivez les instructions étape par étape.
      REMARQUE: L'assistant se déplace la feuille de lumière dans le plan focal de l'objectif de détection, et assure qu'il ne soit pas incliné et sa taille est dans le centre du champ de vision. Après avoir terminé le réglage automatique, les positions des nappes de lumière gauche et droite sont mises à jour automatiquement dans le logiciel. Une amélioration de la qualité de l'image devrait maintenant être apparente. Activez la case à cocher «Z-stack '.
   2. Vérifier le réglage de la nappe de lumière en inspectant la symétrie de la fonction d'étalement de point (PSF) donnée par les billes fluorescentes dans le xz et yz vue ortho. Si elle net symétrique, ajuster manuellement la position du paramètre de nappe de lumière et vers le bas jusqu'à la réalisation d' un PSF de sablier symétrique en forme (figure 1A).
3. Paramètres d'acquisition multidimensionnels
   1. Définir le z-stack avec la «First Slice» et les options «Last Slice» et définir le z étape à 1 pm.
      NOTE: La feuille de lumière dans ce microscope est statique et le z tronçonnage est obtenue en déplaçant l'échantillon à travers. Toujours utiliser l'option 'entraînement continu »pour l'acquisition plus rapide des z-piles.
   2. Activez la case à cocher 'Time Series. Définir le nombre total de points dans le temps et l'intervalle entre eux.
   3. Activez la case à cocher 'Multiview'. Ajouter la vue actuelle dans la liste de multiview, où x, y, z et l'angle informations sont stockées. Utilisez le contrôleur de scène pour faire tourner le capillaire et définir les autres vues souhaitées. Mettre en place un z-stack à chaque vue et les ajouter à la liste de multiview.
      Noter lalogiciel trie les vues en mode série, de sorte que le capillaire est tourné unidirectionnelle, tandis que l'image est acquise.
4. Drift Correction et démarrage de l'expérience
   1. Une fois l'acquisition mis en place est terminée, attendez 15-30 min avant de commencer l'expérience réelle.
      NOTE: L'échantillon dérive initialement quelques micromètres en x, y et z, mais devrait cesser dans les 30 minutes. Si l'échantillon maintient la dérive pendant plus longtemps, utilisez un autre échantillon ou remount.
   2. Passer à l'onglet «Maintenir» et dans l'option «streaming» définissent la manière dont les données doivent être enregistrées, par exemple, un fichier par point de temps ou d'un fichier séparé pour chaque vue et le canal. Retour à l'onglet "Acquisition", appuyez sur 'Start Experiment »et définir le nom du fichier, l'emplacement où il doit être sauvegardé et le format de fichier (utilisation de .czi).
   3. Observer l'acquisition du premier point de temps pour confirmer que tout fonctionne parfaitement. procéder immédiatement à l'enregistrementet la fusion du premier point temporel comme décrit dans les étapes 6 et 7, afin de confirmer qu'il sera possible de traiter l'ensemble des données.

6. Multiview Inscription

1. Multiview Reconstruction application
   1. A la fin de la session de formation d'image, transférer les données depuis l'ordinateur de mémorisation de données au microscope vers un ordinateur de traitement de données. Utilisez le 'MultiView ReconstructionApplication ^'20,21,31 mis en œuvre à Fidji ³² pour le traitement des données (figure 1B).
2. Définir dataset
   1. Mettre à jour Fidji: Fidji> Aide> Mise à jour ImageJ et Fidji> Aide> Mise à jour Fidji. Utilisez le ImageJ principal et les sites de mise à jour Fidji.
   2. Transférer l'ensemble des données dans un dossier. Les résultats et les fichiers intermédiaires du traitement seront enregistrées dans ce dossier. Démarrez la reconstruction application MultiView: Fidji> Plugins> Multiview Reconstruction> Multiview demande la reconstruction.
   3. Sélectionnez 'définir un nouvel ensemble de données'. Comme le type de données sélectionnez l'option meu "Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats)" et de créer un nom pour le fichier .xml. Ensuite , sélectionnez le premier fichier .czi de l'ensemble de données (fichier dire sans index). Elle contient les données d'image ainsi que les métadonnées de l'enregistrement.
      NOTE: Une fois que le programme ouvre le premier fichier .czi, les métadonnées sont chargées dans le programme.
   4. Vérifiez que le nombre des angles, des canaux, enluminures et observer la taille de voxel à partir des métadonnées. En appuyant sur ​​OK, observer trois fenêtres séparées ouvertes (Figure 1C): une fenêtre du journal, montrant la progression du traitement et de ses résultats, le 'ViewSetup Explorer' et une console, en montrant les messages d'erreur de Fidji.
      NOTE: Le 'ViewSetup Explorer' est une interface conviviale qui montre chaque vue, le canal et l'éclairage et permet la sélection de les dossiers d'intérêt. En outre, le «ViewSetup Explorer" permet de direction de toutes les étapes de traitement.
   5. Sélectionnez les fichiers qui doivent être traitées et appuyez sur le bouton droit de la souris dans l'explorateur. Observer une fenêtre ouverte avec les différentes étapes de traitement (figure 1C).
   6. Lors de la définition de l'ensemble de données, d'observer qu'un fichier .xml dans le dossier avec les données est créé.
      NOTE: Ce fichier contient les métadonnées qui ont été confirmés avant.
   7. Dans le coin supérieur droit d'observer de l'info 'deux boutons et «sauver». En appuyant sur 'info' affiche un résumé du contenu du fichier .xml. En appuyant sur «sauver» va enregistrer les résultats de traitement.
      NOTE: Bien que le traitement dans le «MultiView Reconstruction Application 'les différentes étapes de traitement doivent être enregistrées dans le .xml avant la fermeture de Fidji.

oad / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Figure 1: Multiview Reconstruction de détection de flux de travail et le point d'intérêt (A) alignement des feuilles de lumière basée sur l' imagerie par bille fluorescente.. Le système est aligné (au centre), lorsque l'image de talon a une forme de sablier symétrique par rapport aux projections XZ et YZ. Les exemples de nappe de lumière désaligné dans les deux sens sont représentés à gauche et à droite. Les projections d'intensité maximale d'un bourrelet 500 nm dans xz, yz et xy axes sont représentés. A noter que le rapport de l'intensité du pic central du disque d'Airy (xy) sur les lobes secondaires est plus grande, lorsque la lightsheet est correctement aligné par rapport à la situation désaligné. Les images ont été prises avec 20X / 1.0 W objectif à 0,7 zoom. La barre d'échelle représente 5 um. (B) Le jeu de données est définie, puis réenregistré dans le format HDF5. Les perles sont segmentés puis enregistrés. Pour une série de temps chaque point de temps est inscrit sur un point de temps de référence. Les données sont finalement fusionnées en unseul volume isotrope. (C, en haut) Le ViewSetup Explorer affiche les différents points de temps, des angles, des canaux et des côtés d'éclairage de l'ensemble de données. (C, coin gauche inférieur) La fenêtre BigDataViewer montre la vue qui est sélectionné dans le ViewSetup Explorer. (C, milieu à droite) Faites un clic droit dans le ViewSetup Explorer ouvre les options de traitement. (C, coin inférieur droit) Les progrès et les résultats du traitement sont affichés dans le fichier journal. (D et E) Le but de la détection est de segmenter autant de points d'intérêt (perles) avec aussi peu de détection dans l'échantillon que possible ici présentée comme captures d' écran de la perle segmentation interactive. (D et E, coin supérieur gauche) La segmentation est définie par deux paramètres, les valeurs Difference-de-gaussiennes pour Sigma 1 et le seuil. (D) Un exemple d'une détection réussie avec une vue agrandie d'un bourrelet correctement détecté. (E) Segmentation avec trop de faux positifs et de détections multiples d'une seule perle. Barre d'échelle dans (C) représente 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Réenregistrez Dataset en HDF5 Format
   1. Pour réenregistrer l'ensemble des données, sélectionner tous les fichiers avec Ctrl / Pomme + un clic droit. Ensuite , sélectionnez dataset Resave et comme HDF5.
   2. Une fenêtre apparaît affichant un avertissement que tous les points de vue de l'ensemble de données en cours seront réenregistrées. Appuyez sur oui.
      NOTE: Le programme continuera à réenregistrer les fichiers .czi à hdf5 en ouvrant chaque fichier et réenregistrer les différents niveaux du format hdf5 résolution. Il confirmera avec «fait» à la fin. resaving usually prend quelques minutes par timepoint (voir le tableau 1).
      REMARQUE: Étant donné que les fichiers au format hdf5 peuvent être chargés très rapide, il est maintenant possible de consulter l'ensemble de données non enregistré par «clic droit» dans l'explorateur et basculer 'affichage dans BigDataViewer (on / off). Une fenêtre BigDataViewer apparaîtra avec la vue sélectionnée (figure 1C). Les fonctions de base de la BigDataViewer ³³ sont expliqués dans le tableau 2 et http://fiji.sc/BigDataViewer.
4. Détecter Points d'intérêt
   1. Sélectionnez tous les points de temps avec Ctrl / Pomme + a et cliquez droit , sélectionnez détecter les points d'intérêt.
   2. Sélectionnez Difference-de-gaussien ³⁴ pour le type de détection de points d'intérêt. Depuis l'enregistrement sur la base de perles est utilisé ici, le type "perles" dans le champ pour les points d'intérêt de l'étiquette. Activer 'Sous-échantillonner les images avant la segmentation.
   3. Dans la fenêtre suivante, observer la detparamètres exion. Pour 'subpixel localisation' utilisation 'ajustement quadratique 3 dimensions ^"34 et pour déterminer les valeurs Difference-de-gaussien et le rayon d'utilisation perle de segmentation« interactif »dans la spécification du point de i'nterest'.
   4. Pour 'Downsample XY' utilisation 'Match Z Résolution (moins downsampling)' et 'Downsample Z' utilisation 1 ×. La taille z étape est plus grande que la taille xy de pixel, ainsi échantillonner simplement vers le bas xy z pour correspondre à la résolution est suffisante. Sélectionnez 'compute de la CPU (JAVA). Appuyer sur OK'.
   5. Dans une fenêtre pop-up, sélectionnez une vue pour tester les paramètres à partir du menu déroulant. Une fois les charges de vue, régler la luminosité et le contraste de la fenêtre avec les Fidji> Image> Réglages> Luminosité / Contraste ou Ctrl + Maj + C. Cochez la case «look pour maxima (vert) 'pour la détection de perles.
   6. Observer la segmentation en anneaux comme verts le 'viewSetup' around les détections lors de la recherche pour les maxima et minima rouge. La segmentation est définie par deux paramètres, les valeurs Difference-de-gaussien pour Sigma 1 et le seuil (figure 1D). Ajustez - les pour segmenter autant de perles autour de l'échantillon et que quelques détections faussement positives au sein de l'échantillon que possible (figure 1D). Détecter chaque perle une seule fois et non plusieurs fois (Figure 1E). Après avoir déterminé les paramètres optimaux, appuyez sur 'fait'.
      REMARQUE: La détection commence par le chargement de chaque vue individuel du point de temps et segmentant les perles. Dans le fichier journal, le programme émet le nombre de billes, il détecté par vue. La détection doit être fait en quelques secondes (voir le tableau 1).
   7. Appuyez sur Enregistrer lorsque la quantité de détections est approprié (600 à plusieurs milliers par vue).
      NOTE: Un dossier sera créé dans le répertoire de données, qui contiendra l'information sur les coordonnées des billes détectées.
5. Inscrivez-vous l'aide de points d'intérêt
   1. Sélectionnez tous les points de temps avec Ctrl / Pomme + un clic droit et sélectionnez "enregistrer à l' aide des points d'intérêt».
   2. Utilisez 'hachage rapide 3d géométrique (rotation invariant)' pour la détection de perles comme «algorithme d'enregistrement».
      NOTE: Cet algorithme suppose aucune connaissance préalable sur l'orientation et le positionnement des différents points de vue par rapport à l'autre.
   3. Pour l'enregistrement des vues sur l'autre, sélectionnez "enregistrer timepoints individuellement» comme «type d'enregistrement». Pour «points d'intérêt» dans le canal sélectionné, l'étiquette spécifiée précédemment pour les points d'intérêt devrait maintenant être visibles (ie "perles").
   4. Dans la fenêtre suivante, utilisez les valeurs de consigne pré pour l'enregistrement. Fixer la première vue en sélectionnant «tuiles Fix: Correction première tuile et l'utilisation Ne pas mapper back '(utiliser si tiles ne sont pas fixes) dans la section «Carte retour des tuiles.
   5. Utilisez un «modèle de transformation affine» par «régularisation».
      NOTE: L'erreur a permis de RANSAC sera 5px et la «signification pour un match de descripteur» sera 10. Pour «régularisation» utiliser un «modèle rigide» avec un lambda de 0,10, ce qui signifie que la transformation est de 10% rigide et 90 % affines ^35. Appuyez sur OK pour lancer l'enregistrement.
      NOTE: Comme affiché dans la fenêtre du journal, d'abord chaque vue est adaptée à tous les autres points de vue. Ensuite , l'échantillon aléatoire consensus (RANSAC) ³⁶ teste les correspondances et exclut les faux positifs. Pour un enregistrement solide, la valeur de RANSAC doit être supérieure à 90%. Quand un nombre suffisant de vrais candidats correspondants entre les deux points de vue se trouvent, un modèle de transformation est calculée entre chaque match avec le déplacement moyen en pixels. Ensuite, l'optimisation globale itérative est effectuée et toutes les vues sont inscrits sur la vue fixe. Avec l'inscription réussie, un modèle de transformation est calculé et affiché avec son échelle et le déplacement en pixels. L'erreur moyenne devrait être de façon optimale en dessous de 1 px et la mise à l' échelle de la transformation proche de 1. L'enregistrement est exécuté en quelques secondes (voir le tableau 1).
   6. Vérifiez qu'il n'y a pas de décalage entre les différentes vues comme observé sur les structures fines dans l'échantillon, par exemple les membranes cellulaires. Ensuite, enregistrez la transformation pour chaque vue dans le fichier .xml.
      NOTE: Maintenant , les vues enregistrées se chevauchent les uns les autres dans le BigDataViewer (figure 2A) et les images de perles devraient être superposant ainsi (figure 2B).
   7. Retirez les transformations en sélectionnant les points de temps clic droit sur eux et puis sélectionnez Supprimer Transformations> Dernières / Date Transformation.

re 2 "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Figure 2:. Les résultats de la reconstruction multivues (A) Superposées vues enregistrés, chacun dans une couleur différente pour démontrer le chevauchement entre eux. (B) vue agrandie montrant le chevauchement des PSF de perles imagées des différents points de vue. (C) Gros plan d'un cordon après la fusion, le PSF est une moyenne des différents points de vue. (D) PSF du même bourrelet comme dans (C) après multiview déconvolution montrant que le PSF s'effondre en un seul point. (E) section xy et (F) section yz d'une vue unique d'une vésicule optique, dans lequel les membranes sont marquées à la GFP montrant la dégradation du signal dans z plus profondément dans le tissu. (G) section xy et (H) section yz du même avis après la fusion moyenne pondérée de 4 vues environ 20 degrés à part avec un peu plus degrarésolution xy ded globale, mais a augmenté z-résolution. (I) section xy et (J) section yz des mêmes données après multiview déconvolution, montrant une augmentation significative de la résolution et le contraste du signal tant en xy et z. Images (EJ) sont des tranches optiques uniques. La barre d'échelle représente 50 um (A, B, EJ) et 10 um (C, D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. Time-lapse Inscription
   1. Sélectionnez l'ensemble laps de temps, faites un clic droit et choisissez «Enregistrer en utilisant les points d'intérêt» pour stabiliser le time-lapse au fil du temps.
   2. Dans la «fenêtre Paramètres d'enregistrement de base sélectionnez Match contre la un point de temps de référence (pas d'optimisation globale) pour le type d'enregistrement. Ke ep t il d' autres paramètres de la même façon que dans l'enregistrement des points de temps individuels.
   3. Ensuitefenêtre, sélectionnez le point de temps pour être utilisé comme une référence, typiquement un point de temps dans le milieu du time-lapse. Cochez la case «considérer chaque timepoint comme unité rigide ', étant donné que les points de vue individuels au sein de chaque point de temps sont déjà enregistrés sur l'autre.
   4. Cochez la case "Afficher les timeseries statistiques». Les autres paramètres d'enregistrement restent comme avant, y compris la régularisation. Appuyez sur OK.
      NOTE: Dans la fenêtre du journal, la même sortie sera affiché comme dans l'enregistrement de point de temps individuel. Si l'enregistrement des points de temps individuels a réussi et robuste, le RANSAC est maintenant 99-100% et la moyenne, le minimum et l'erreur maximale est habituellement inférieure à 1 px. Enregistrer cet enregistrement avant de poursuivre.

7. Multiview Fusion

NOTE: Les transformations résultant des étapes d'enregistrement sont utilisés pour calculer une pile isotrope fondu sur les multiples points de vue. Cette pile has z nombre de tranches par rapport aux données originales augmenté, car l'espacement z est maintenant égale à la taille de pixel d'origine en xy. La fusion peut être réalisée soit par une base de contenu multiview fusion ^21,31 ou déconvolution multivues bayésienne basée sur ^31, qui sont tous deux mis en œuvre dans l'application de reconstruction multivues.

1. bounding Box
   NOTE: La fusion est un processus coûteux de calcul (voir le tableau 1), réduisant ainsi la quantité de données en définissant un cadre de sélection augmente considérablement la vitesse de traitement.
   1. Sélectionnez tous les points de temps clic droit et choisissez Définir 'Bounding Box'. Utilisez 'Définir avec BigDataViewer' et choisissez un nom pour la zone de délimitation.
   2. Déplacez le curseur pour 'min' et 'max' dans chaque axe pour déterminer la région d'intérêt, puis appuyez sur 'OK'. Les paramètres de la boîte de sélection seront affichés.
      REMARQUE: La boîte de sélection contiendra tout ce qui estla boîte verte qui est recouverte d'une couche de magenta transparent.
2. basé sur le contenu Multiview Fusion
   REMARQUE: à base de contenu multiview fusion ²¹ prend les différences de qualité d'image sur la pile (ie de dégradation du signal dans z) en compte et applique des poids plus élevés pour une meilleure qualité au lieu d'utiliser une moyenne simple de l' image.
   1. Sélectionnez le point (s) de temps qui devrait être fusionné dans le 'ViewSetup Explorer', cliquez à droite et sélectionnez 'image Fusion / Déconvolution'.
   2. Dans la fenêtre Image Fusion, sélectionnez "moyenne pondérée fusion" dans le menu déroulant, et choisissez "Utiliser Box englobante pré-défini pour Bounding Box '. Pour la sortie de l'image fusionnée select 'Append to Project XML en cours », qui écrit de nouveaux fichiers HDF5 aux fichiers déjà existants hdf5 et permet d'utiliser les vues non fusionnées enregistrés et l'image fusionnée ensemble. Appuyer sur OK'.
   3. Ensuite, dans le «pré-définir Bounding Box & #39; fenêtre pop-up sélectionnez le nom de la zone de délimitation définie précédemment et appuyez sur 'OK'.
   4. Respecter les paramètres de la zone de délimitation dans la fenêtre suivante. Pour la fusion rapide, appliquer un prélèvement sur le jeu de données fusionné.
      NOTE: Si la pile fondue est au-dessus d'une certaine taille, le programme recommande l'utilisation d'une mémoire plus efficace 'ImageLib2 containe'r. Passer de 'ArrayImg' aux 'PlanarImg (grandes images, faciles à afficher) ou CellImg (grandes images)' conteneurs, qui permettent le traitement des données plus importantes. Sinon, utilisez les paramètres prédéfinis et appliquer «fusion mélange et basée sur le contenu. Passez en appuyant sur 'OK'.
   5. Respecter les paramètres de HDF5 dans la fenêtre suivante. Utilisez les paramètres prédéfinis et de commencer le processus de fusion. Assurez-vous que les Fidji a attribué suffisamment de mémoire dans Modifier> Options> Mémoire & Fils.
3. Multiview Déconvolution
   NOTE: Multiview Déconvolution ³¹ est anotson type de fusion multiview. Ici , en outre , la fusion, la PSF du système de formation d'image est pris en compte afin de déconvoluer la résolution et le contraste de l' image et un rendement accru du signal ( par rapport à la figure 2C-J, la figure 5 le film et 3).
   1. Sélectionnez le point (s) de temps à déconvoluée, cliquez à droite et appuyez sur 'image Fusion / Déconvolution'.
   2. Sélectionnez 'Multiview Déconvolution' et l'utilisation de la zone de délimitation pré-défini et ajouter au projet XML en cours ». Sélectionnez la zone de délimitation et continuer.
      REMARQUE: Les paramètres prédéfinis pour la déconvolution sont un bon point de départ. Pour la première utilisation '20 itérations d'essai »et d'évaluer l'impact de la déconvolution en utilisant le« mode Debug ». Enfin régler le calcul sur à 512 x 512 x 512 blocs.
   3. Dans la fenêtre suivante, utilisez les paramètres prédéfinis. Réglez le «mode de débogage" pour afficher les résultats tous les '5 iterations ».
      NOTE: La sortie de la déconvolution est des données 32 bits, mais le BigDataViewer ne supporte actuellement que les données de 16 bits. Afin d'ajouter la sortie de la déconvolution de l'ensemble de données existant hdf5, il doit être converti en 16 bits.
   4. Pour la conversion, exécutez 'Utilisez min / max de la première image (peut saturer l'intensité au fil du temps).
      NOTE: La déconvolution va alors commencer en chargeant les images et de les préparer pour la déconvolution.
4. BigDataServer
   1. Afin de partager la très grande XML / ensembles de données HDF5 utilisent le serveur http BigDataServer ^33. Une introduction à la façon de configurer et se connecter à tel serveur peut être trouvé à http://fiji.sc/BigDataServer.
   2. Pour se connecter à un BigDataServer existant ouvert Fidji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
   3. Entrez l'URL, y compris le port dans la fenêtre.
      NOTE: Les films décrits dans cette publication sont accessibles via cette annonceRobe: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
   4. Observer une fenêtre qui permet de sélectionner les films. Double-cliquez pour ouvrir la fenêtre BigDataViewer et afficher les données comme décrit précédemment.

Supplémentaire: Liste de contrôle du matériel nécessaire avant de commencer

• embryons de poisson zèbre / larves exprimant des protéines fluorescentes (Garder les embryons dans le milieu de l'E3 zebrafish sans bleu de méthylène. Pour les stades de plus de 24 heures contrecarrent la pigmentation en ajoutant PTU à une concentration finale de 0,2 mM.)
• stéréoscope fluorescent
• capillaires (20 volumes ul, avec une marque noire) et poinçons appropriés (Ne pas réutiliser les capillaires. Les plongeurs, d'autre part, peuvent être réutilisés pour plusieurs expériences.)
• 1,5 ml tubes en plastique
• pinces acérées
• verre (feu poli) ou pipettes en plastique (en plastique peut être utilisé pendant 24 heures et d'embryons plus âgés)
• diamètre de verre ou des plats en plastique de 60 mm (plastique peut êtreutilisé pendant 24 heures et d'embryons âgés)
• deux fois 100 ml béchers
• 50 ml Luer-Lock seringue avec 150 cm tuyau de rallonge pour perfusion (Le tuyau et la seringue doit être maintenue complètement sec entre les deux expériences afin d'éviter la contamination par des micro-organismes).
• pâte à modeler
• bas point de fusion (LMP) agarose
• E3 moyen (NaCl 5 mM , KCl 0,17, 0,33 mM de _CaCl2, 0,33 mM MgSO ₄₎
• MS-222 (Tricaine)
• phénylthiourée (PTU)
• microsphères fluorescentes (ici appelées perles)
• à double H ₂ O distillée (ddH ₂ O)

Résultats

LSFM est une méthode idéale pour l'imagerie des processus de développement à travers les échelles. Plusieurs applications sont compilées ici montrant l'imagerie à la fois à court et à long terme des structures intracellulaires, ainsi que des cellules et des tissus entiers. Ces exemples démontrent également que LSFM est un outil utile à différents stades de développement de l' œil de la formation de cupule optique à la neurogenèse dans la rétine. Film 1 sert d'illustration de l'approche générale de LSFM, montrant d' abord une vue zoomée sur un embryon intact dans le enrobage cylindre d'agarose à fond clair et plus tard montrant une vue détaillée de la rétine dans le canal de fluorescence.

Film 1:. LSFM de la rétine zebrafish Pour illustrer l'approche de LSFM, ce film montre d' abord dans le fond clair que l'embryon est imagé intacte à l' intérieur de la unegarose cylindre avant de passer à fluorescence. Plus tard, il est démontré que le grand champ de vision permet l'observation de l'ensemble de la rétine. Ensuite, le film montre une petite région agrandie de la rétine pour mettre en évidence la bonne résolution subcellulaire. Un ath5: gap-GFP ³⁷ transgénique embryon de poisson zèbre a été utilisé pour l' imagerie. Ce transgène labels différents neurones dans la rétine (principalement des cellules ganglionnaires et des précurseurs de photorécepteurs). La partie de la fluorescence du film a été capturé en une seule vue d'enregistrement avec un éclairage à double face en utilisant le W objectif 40X / 1.0 avec des intervalles de 5 min. La projection d'intensité maximale d'un volume épais de 30 um est affichée. S'il vous plaît , cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Movie 2 démontre, comment les événements intracellulaires très rapides peuvent être capturées avec une haute résolution; dans ce cas, la croissance des microtubules àainsi que leurs extrémités dans les cellules progénitrices neuronales rétiniennes. L'information contenue dans le film permet un suivi et la quantification des microtubules ainsi que la fin de croissance.

Film 2:. Dynamique microtubules dans une cellule unique Ce film captures de plus en plus des conseils ainsi que des microtubules marqués par la pointe de plus de protéine marqueur EB3-GFP ^38. La protéine est exprimée dans une cellule progénitrice de la rétine. Les microtubules croissent principalement dans la direction apicale à partir basale (haut en bas). La vitesse moyenne des comètes EB3 a été mesurée en 0,28 ± 0,05 um / sec. La tache lumineuse sur le côté apical de la cellule présentant une activité de nucléation élevée de microtubules est le centrosome. Le type embryon sauvage a été injecté avec hsp70: EB3-GFP ADN plasmidique. Le film a été acquis 4 heures après un choc thermique (15 min à 37 ° C) à environ 28 hrpost fertilization (HPF) en une seule vue d'enregistrement avec un éclairage simple face en utilisant les 63X / 1.0 intervalles de temps objective et 1 sec W. La cellule unique a été recadrée d'un champ de vision couvrant la majeure partie de la rétine. L'intensité maximale de projection de deux tranches est affiché. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

La figure 3 montre, comment les structures intracellulaires peuvent être suivis pendant plusieurs heures. Ici, le centrosome au sein de translocation des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) est capturé.

Figure 3:. Localisation Centrosome pendant la translocation des cellules ganglionnaires de la rétine Ce montage d'une expérience time-lapse montre la position du centrosome pendant toute la maturation cellulaire ganglionnaires de la rétine (RGC).Dans les progéniteurs neuronaux centrosome est localisé dans la pointe du processus apical (1:00). Au cours de la division cellulaire, les deux centrosomes servent de pôles pour le fuseau mitotique (02h25). Cette division se traduit par une cellule fille qui se différencie en une RGC et une seconde cellule fille qui devient un précurseur de cellules photoréceptrices. Après la division, le corps cellulaire du CGR est transloqué sur le côté basal de la rétine, tandis que le processus apicale reste attaché sur le côté apical. Une fois que le RGC atteint le côté de la base, son processus apical se détache et le centrosome se déplace avec elle (06:15). Le centrosome peut être suivie tout en rétractant progressivement en même temps que le processus apical (6:50, 07:20, 08:10). Dans la dernière image (08h55) la cellule ganglionnaire augmente un axone de son côté de base, tandis que le centrosome est encore localisée apicalement. L'expression mosaïque a été réalisée par injection d'ADN plasmidique dans de type sauvage embryon à un stade de la cellule. Les cellules sont visualisées par le ath5: GFP-CAAX (vert) construct, qui marque RGC et d'autres neurones. Les centrosomes (pointes de flèches) sont marquées par Centrin-tdTomato ²⁹ expression (magenta). Du côté apical de la rétine se trouve au sommet de l'image et de la face basale vers le bas. La projection d'intensité maximale d'un volume épais de 30 um est représenté. Les images ont été coupées à partir d'un film couvrant toute la rétine. Le film commence à environ 34 h après la fécondation de (HPF). A z pile a été acquis toutes les 5 min avec le W objectif 40X / 1.0. Le temps est indiqué en hh: mm. La barre d'échelle représente 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Sur la figure 4 , il apparaît, comme seul le comportement cellulaire peut être extraite à partir des données de capture du tissu entier tel que 1 dans le film. Translocation d'un RGC peut facilement être suivie et son procédé apicale et basalees suivies.

Figure 4:. Translocation d'une seule cellule ganglionnaire La translocation RGC apical vers le côté basal de la rétine se produit après la mitose terminal tel que décrit à la figure 3. Le CGR est marqué par l' expression du ath5. Écart-GFP ³⁷ transgène. La projection d'intensité maximale d'un volume épais de 30 um est représenté. Les images ont été coupées à partir d'un film couvrant toute la rétine. Le film commence à environ 34 HPF. A z pile a été acquis toutes les 5 min avec le W objectif 40X / 1.0. Le temps est indiqué en hh: mm. La barre d'échelle représente 5 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 5 démontre la capacité de multiview LSFM pour capturer sc tissulaireprocessus morphogénétiques ale avec une résolution cellulaire sur l'exemple de fibre tasse morphogenèse, au cours de laquelle optique vésiculaire se transforme en une cupule optique. La qualité de l'image peut être grandement améliorée par l'imagerie multiview, lorsque l'image finale est combiné à partir des informations de 5 vues différentes (dans ce cas) en un seul z pile avec une résolution isotrope. Cette figure illustre l'amélioration de la qualité de l'image après la fusion moyenne pondérée et gain supplémentaire en contraste de l'image et de la résolution après multiview déconvolution. La figure montre deux tranches optiques dans différentes orientations à travers l'ensemble de données. En outre, un montage de l'ensemble de données déconvoluée montre la morphogenèse de cupule optique au fil du temps. Tous les points de temps sont ensuite présentés dans Movie 3.

Figure 5: Comparaison de la qualité d'image entre vue unique et deux méthodes de multiview fusion. (A) Une tranche optique de données de vue unique représentés à la vue latérale et (B) vue dorsale. artefacts Stripe et la dégradation du signal plus profond à l'intérieur de l'échantillon sont apparents. Aussi une partie de l'image visible dans les données fusionnées (FC) n'a pas été capturé dans ce point de vue particulier. (C) La même tranche optique, maintenant que les données multivues fusionné présentés à la vue latérale et (D) vue dorsale. A noter que les artefacts de bande sont supprimés et les structures profondes dans l'échantillon sont mieux résolus. (E) La même tranche optique maintenant multiview déconvoluée données présentées à la vue latérale et (F) vue dorsale. Notez le contraste et la résolution accrue de sorte que les membranes et les noyaux des cellules individuelles peuvent être bien distingués. La résolution ne se détériore pas notamment plus à l'intérieur de l'échantillon. L'ensemble de données a été acquis avec un éclairage à double face de 5 vues environ 20 degrés. Les z piles de abà 100 um avec 1,5 um taille de l'étape ont été acquises à chaque vue en intervalles de 10 minutes pendant 10 heures avec le W objectif 20X / 1.0. images d'entrée pour la fusion de multiview et déconvolution ont été échantillonné 2 × pour accélérer le traitement de l'image. 15 itérations de la déconvolution multivues ont été exécutés. (G) Le montage montre une zone recadrée de la vue dorsale à partir des données déconvoluées pour mettre en évidence les événements morphogénétiques au cours du développement de l' œil au début de la vésicule optique à l'étape de la cupule optique. Les deux couches de la vésicule optique, qui sont initialement épithéliums colonnaire similaires, se différencient en des populations cellulaires distinctes. La couche distale proche de l'épiderme devient le neuroepithelium rétinienne (RN) et la couche proximale proche du tube neural devient l'épithélium pigmentaire rétinien (RP). Les cellules de la forme allongée et RN invaginent pour former la coupe optique (01 heures 40-à-05h00); en même temps, les cellules RP aplatissent. L'ectoderme superficiel est amené à former une lentille (01:40), whinvagine ich plus tard (5:00). Le film commence à 17 HPF. Le temps est indiqué en hh: mm. Toutes les membranes cellulaires sont marquées par la β-actine: ras-GFP transgène et tous les noyaux sont marqués par la hsp70: H2B-RFP transgène. La barre d'échelle représente 30 um. FB prosencéphale, lentille LE, OP placode olfactif, RN neuroepithelium rétinienne, RP épithélium pigmentaire rétinien. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 3: Optic cup morphogenèse montré avec vue unique et deux méthodes de fusion multiview Le film time-lapse illustre le processus complet de fibre tasse morphogenèse de la vésicule optique à l'étape de la cupule optique.. Il montre une seule tranche optique de la vue latérale (en haut) et une seule tranche optique de la vue dorsale (en bas). Les cellules de la vésicule optique en développement subissent des réarrangements complexes, pour finalement former la cupule optique hémisphérique, avec le neuro-épithélium de la rétine interne et externe de l'épithélium pigmentaire de la rétine. Une lentille est formée à partir de l'ectoderme de surface. Il invagine avec le neuroepithelium et se trouve dans la cupule optique. Toutes les membranes cellulaires sont marquées par l'expression de la β-actine: ras-GFP (vert) transgène et les noyaux sont marqués par hsp70: H2B-DP (magenta). Le film commence à environ 17 HPF. L'ensemble de données a été acquis à double éclairage de la face 5 vues environ 20 degrés de distance et az piles d'environ 100 um ont été acquises toutes les 10 min avec le W objectif 20X / 1,0. Le temps est indiqué en hh: mm. La barre d'échelle représente 50 um. S'il vous plaît , cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

1. Les étapes critiques et dépannage pour l'acquisition de données

Les paramètres typiques d'imagerie pour une GFP et RFP exprimant l' échantillon peuvent être trouvés dans le tableau 3. Dans la configuration décrite au microscope la feuille de lumière est statique, formée par une lentille cylindrique. Les deux objectifs d'éclairage sont des lentilles de l'air et l'objectif de détection est une lentille d'eau par immersion. Zoom 1.0 avec 20X / 40X 1.0 ou / 1.0 objectifs donne 230 nm et 115 nm de taille de pixel et un champ de vision de 441 x 441 um ou 221 x 221 um respectivement. Il est recommandé d'utiliser l'épaisseur de la nappe de lumière par défaut avec le centre pour border rapport 1: 2. Pour 20X / 1,0, cette épaisseur correspond à 4,5 pm et pour 40X / 3,2 um à 1,0 dans le centre. Si la vitesse de formation d'image est pas la priorité primaire, utiliser des pistes distinctes dans le cas d'un échantillon multicolore pour éviter la diaphonie de l'émission de fluorescence entre les canaux. La vitesse la plus élevée de l'acquisition est limitée à 50 msec par z étape par levitesse de déplacement de l'axe z-conducteur. Si l'objectif est d'atteindre la vitesse d'imagerie maximale en cas, par exemple, deux pistes avec éclairage double face, le temps d'exposition doit être réglé de telle sorte que la somme de toutes les images prises par z étape est inférieure à 50 msec. D'autre part, si une seule image est acquise par z étape, il est pas bénéfique pour régler le temps d'exposition plus courte que 50 msec.

Taille 1920 x 1920 image

16 bits

Pivot scan sur

éclairage double face avec la fusion en ligne

10X objectif / 0,2 d'éclairage

20X / 1.0 W Plan-Apochromat objective de détection

Piste 1: Excitation 488 nm typiquement 2% de 100 mW laser, 550 nm Filtre SP d'émission

Piste 2: Excitation 561 nm typiquement de 3% de 75 laser mW, 585 nm filtre LP d'émission

Temps d'exposition jusqu'à 100 msec

épaisseur de la pile Z 50-100 um

1-1,5 um taille de l'étape z en mode z d'entraînement en continu

L'incubation à 28,5 ° C

Tableau 3: Imagerie Paramètres.

Inspecter l'échantillon après l'expérience

Il est important de veiller à ce que l'échantillon est toujours en bonne santé à la fin de l'expérience. Comme première lecture, vérifier le pouls de l'échantillon sous un stéréoscope. Avec une paire de pinces acérées l'échantillon peut être prélevé sur l'agarose et a déménagé à l'incubateur pour développer davantage afin de vérifier si elle a été affectée par l'imagerie. En variante, il peut être fixé pour la coloration d'anticorps.

Montage et dérive

Il est essentiel de maintenir l'osmolarité de la chambre solution près de l'osmolarité de l'agarose d'enrobage, sinon gonflement / rétrécissement de l'agarose et de l'instabilité ultérieure de l'échantillon se produira. Par conséquent, utiliser la même solution (milieu E3 sans bleu de méthylène) pour remplir la chambre et de préparer les bas point de fusion aliquotes Point d'agarose 1%. En outre, ne pas laisser l'agarose dans le bloc C de chauffage de 70 ° C pendant plus de 2 heures, car il peut perdre ses propriétés de gélification.

Ne pas incorporer le poisson en agarose trop chaud, car cela peut conduire à une réponse de choc thermique ou de la mort de l'embryon. En cas de doute sur l'effet d'agarose chaud sur les embryons, vérifiez que la queue ne se plie pas et que le rythme cardiaque ne ralentit pas. Si cela se produit, utiliser un embryon différent pour l'expérience.

Gardez la longueur totale de la colonne d'agarose avec l'échantillon court (environ 2 cm) et monter le zebrafish avec sa tête orientée vers la pointe du piston. De même, le cylindre d'agarose extrudé à partir de la capillary doit être aussi courte que possible. Ces mesures permettront d'assurer la stabilité de l'échantillon tout au long du film. Dans le même temps, la colonne d'agarose doit être suffisamment longue pour que le capillaire de verre lui-même ne parvient pas dans la trajectoire de la lumière, car cela provoquerait la réfraction et la réflexion majeure.

La dérive initiale de l'échantillon est causée par les changements de volume du cylindre agarose lui-même. Coulissante du piston est pas la raison. Par conséquent, il ne permet pas de fixer le piston avec de la plasticine ou vernis à ongles. L'embryon pourrait changer sa position pendant le film en raison de sa croissance naturelle aussi. Par conséquent, il est conseillé de centrer la région d'intérêt dans le milieu du champ de vision et de garder une certaine marge sur les bords pour accueillir ces mouvements.

Réduction de la quantité de milieu d'inclusion dans le trajet de la lumière

Orienter l'échantillon correctement aide à obtenir la meilleure qualité d'image possible ^15. Gènerallye, l'excitation et l'émission de lumière doit voyager à travers le moins de tissu et des médias de montage possible. La solution optimale est un montage d'agarose-libre. Ceci a été réalisé par exemple dans une installation d'imagerie Arabidopsis racine latérale ^14, dans lequel la racine principale a été montée dans Phytagel et les racines latérales ont été ensuite laissé à croître hors de la colonne de gel complètement. Montage sans Agarose a également été développé pour l' imagerie de l'embryogenèse complète de Tribolium dendroctone sur deux jours ^12. amélioration de la qualité de l'image n'a pas été la motivation première dans ce cas. embryons Tribolium simplement ne survivent pas à l'intérieur de l'agarose assez longtemps. Un montage sans média, absolument intégration n'a pas été atteint depuis longtemps l'imagerie à long terme chez le poisson zèbre. Pourtant, nous pouvons tirer profit du fait que lorsque la solidification d'agarose, la plupart des embryons sont positionnés en diagonale dans le capillaire avec un œil situé profondément dans l'agarose et le second oeil étant proche de la surface de la colonne d'enrobage. Til oeil près de la surface offre une qualité d'image supérieure et devrait donc être imagé préférentiellement.

concentration Agarose et l'imagerie à long terme

La concentration d'agarose pour la fixation d'un compromis entre la stabilité de l'échantillon et la possibilité d'adapter à la croissance de l'embryon et la diffusion d'oxygène à elle. Il n'y a pas de gain supplémentaire dans la stabilité de l'échantillon lorsqu'on utilise des concentrations plus élevées d'agarose à 1%. En tant que point de départ pour optimiser les expériences que nous recommandons 0,6% d'agarose, qui est également adapté pour les embryons de moins de 24 HPF qui sont trop fragiles pour être monté dans 1% d'agarose. Pour anesthésier les embryons plus âgés et les larves, la concentration MS-222 peut être portée à 200 pg / ml , sans effets secondaires ^13.

Dans le cas des embryons en développement sont imagés pendant plus de ± 12 h, agarose de montage ne soit pas recommandée, car elle limite la croissance de l'embryon et causes queue déformation. Ce problème a été résolu pour zebrafish par les embryons de montage dans des tubes de polymère FEP avec indice de réfraction similaire à l' eau ^13,39. Des embryons de souris, d'autre part, peuvent être immobilisés dans des cylindres d' agarose creux ⁴⁰ ou dans des trous d'une tige acrylique fixée à une seringue ^41. montage du tube FEP est pas recommandé comme méthode par défaut cependant, parce que la paroi du tube réfracte la lumière un peu plus d'agarose.

alignement des feuilles de lumière

Pour une bonne qualité d'image, il est essentiel d'effectuer l'alignement automatique de la nappe de lumière avant chaque expérience. Surtout si les paramètres de zoom ont été changés, les objectifs ont été retirés, ou un liquide différent a été utilisé dans la chambre.

Éclairage

Le balayage de pivotement de la nappe de lumière doit toujours être activé. Pour les grands spécimens de diffusion, il est nécessaire d'appliquer l'éclairage double face avec f en ligneusion pour obtenir un éclairage uniforme à travers le champ de vision. éclairage double face diminue également un problème spécifique de l'imagerie de l'oeil, ce qui est la réfraction de la feuille lumière incidente par la lentille de l'embryon. Les petits, les spécimens de diffusion moins peuvent être efficacement imagées en utilisant un éclairage simple face, ce qui réduit le temps d'imagerie de moitié et peut entraîner légèrement meilleure qualité d'image par rapport à un éclairage à double face. En effet, les chemins de lumière pour l'illumination des deux bras sont toujours différents et une efficacité peuvent être choisis. En outre, les deux feuilles lumineux issus de chaque côté sont jamais parfaitement dans un même plan, ce qui provoque une légère flou après la fusion. Pour les événements intracellulaires très rapides, comme les microtubules en croissance (film 2), l'éclairage double face ne convient pas, puisque les images avec éclairage de gauche et de droite sont acquises séquentiellement, ce qui pourrait entraîner le flou de mouvement.

Photobleachinget la phototoxicité

Moins fluorophore photoblanchiment est souvent mentionné comme un avantage majeur de l'LSFM. Nous soutenons que l'objectif ne devrait pas être du tout photoblanchiment. S'il y a photoblanchiment notable dans l'expérience de l'imagerie en direct, l'échantillon est probablement déjà hors de sa gamme physiologique de l'exposition au laser toléré. Lorsque l'imagerie des embryons de poisson zèbre dans le microscope à disque rotatif, dans notre expérience, haute phototoxicité peut freiner le développement de l'embryon avant même que les décolorants de signaux fluorescents de façon marquée. Par conséquent, les paramètres d'imagerie dans le LSFM doivent être ajustées de sorte que peu ou pas de photoblanchiment est observée. Même si LSFM est doux à l'échantillon, il est prudent d'utiliser uniquement autant de puissance laser et le temps d'exposition que nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit suffisant pour l'analyse subséquente des données.

Z pile, intervalles de temps et la taille des données

Les fichiers générés par LSFM sont généralement très volumineux; parfois dans la gamme de téraoctet. Il est souvent nécessaire de faire un compromis entre la qualité d'image et la taille des données. Ceci est particulièrement le cas pour z espacement des piles et des intervalles dans les acquisitions time-lapse. Pour définir les intervalles z, le bouton optimal dans l'onglet d'outil Z-pile devrait idéalement être utilisé, surtout si l'ensemble de données sera déconvoluée plus tard. Il calcule la distance pour atteindre 50% de chevauchement entre les tranches optiques voisins. Pourtant, un peu plus grandes z intervalles sont généralement acceptables. Ils réduisent le temps nécessaire pour acquérir la z pile ainsi que la taille du fichier final. L'échantillonnage de temps optimal dépend du processus d'intérêt. Pour les yeux d'ensemble des intervalles de développement 5-10 min sont généralement acceptables. Si certaines structures doivent être suivis automatiquement, les points de temps suivants doivent être suffisamment similaires.

des billes fluorescentes

perles fluorescentes servent principalement marqueurs comme repères pour enregistrer différents points de vued'un ensemble de données multiview sur l'autre. vortex toujours les solutions de perles soigneusement avant utilisation. Ne pas chauffer les perles car cela peut conduire à la perte du colorant fluorescent. La concentration optimale du talon pour l'enregistrement multivue doit être déterminée expérimentalement. Le plugin décrit fonctionne mieux avec environ 1000 perles détectées à travers chaque vue. Grandes (500 nm ou 1000 nm) perles sont détectées plus robuste que les plus petites (moins de 500 nm) perles. En effet, les grandes perles sont plus brillants et plus faciles à segmenter sans détection de faux positifs de la structure de l'échantillon. L'inconvénient des perles plus grandes est qu'ils sont très importants dans l'image finale fondue et déconvoluée. Pour chaque nouveau marqueur fluorescent, la taille des billes appropriées et l'émission de fluorescence doivent être optimisés. Pour donner un exemple de l' échantillon de la figure 5 et Movie 3, 100 perles vertes nm d'émission ont donné trop de détections faussement positives dans le canal de la membrane-GFP, mais 1000 nm perles d'émission rouge ont été solidement détectés dans le canal H2B-RFP avec très peu de détections positives à l'intérieur de l'échantillon. Si la détection de talon échoue dans le canal avec le marqueur fluorescent, un canal séparé contenant uniquement des billes peut être acquise, mais ceci est peu pratique. Les perles sous-résolution de taille donnent une lecture directe de la fonction d'étalement de point (PSF) du microscope, qui peut être utilisé pour déconvolution (figure 2C-D). Si l' enregistrement et la fusion fonctionne mieux avec de plus grandes perles (par exemple 1000 nm), une image distincte de la PSF peut être acquise avec des sous-résolution, par exemple, 100 nm perles. Utilisation de perles multicolores est utile lors de l'inscription de l'acquisition multicanal et pour vérifier que la superposition des canaux parfaitement.

L'addition de billes fluorescentes est pas nécessaire lors de l'imagerie à partir d'une vue unique et sans inscription multiview ultérieure et fusion. Cependant, même dans ces cas perles peuvent être utiles lors de l'initiaRéglage de la feuille de lumière l pour vérifier la qualité de la nappe de lumière et en général pour révéler les aberrations optiques. Ces aberrations optiques peuvent provenir de diverses sources comme objectifs endommagés ou sales, des fenêtres sales de la chambre ou inhomogénéité dans l'agarose. Les perles peuvent également être utilisés pour la correction de la dérive par l'enregistrement multiview Fidji plugin ^20.

Multiview

Aux fins de la reconstruction de multiview, il est préférable d'acquérir un nombre impair de vues 3, 5 et ainsi de suite, qui ne sont pas opposées l'une à l'autre. Cela améliore déconvolution puisque les PSF sont imagées à partir de directions différentes. Il est également important de confirmer au début de l'acquisition de laps de temps qu'il y ait un chevauchement suffisant entre les points de vue. Le mieux est empiriquement, à savoir, ce qui confirme immédiatement que les points de vue dans le premier point de temps peuvent être enregistrés avec succès. Lorsque le but de l'acquisition de multiview est d'augmenter la résolutiond'une image d'un grand spécimen de diffusion, il ne convient pas à l'image de l'échantillon entier dans chaque vue, mais pour arrêter autour du centre de l'échantillon, où le signal se dégrade. L'acquisition de faible qualité de la seconde moitié de l'échantillon ne serait pas ajouter des informations utiles à la reconstruction de multiview.

2. Les étapes critiques et dépannage pour le traitement des données

À l'heure actuelle, il existe plusieurs possibilités de traitement de données multivues à partir d'une feuille microscope optique qui sont bien documentés et relativement faciles à adopter. Nous utilisons l'application de reconstruction multivues, qui est un logiciel open source mis en place à Fidji ³² (Stephan Preibisch inédit, Lien 1a et Link1b dans la liste des matériaux). Ce plugin est une refonte majeure du SPIM enregistrement précédent plug - in ^20, revuepar Schmied et al. , ^42, intégrant le BigDataViewer et son format XML et HDF5 ³³ avec le flux de travail d'enregistrement de SPIM (figure 1B, Link 2 , Link 3 ). Cette application peut également être adapté pour cluster de calcul haute performance, ce qui accélère considérablement le traitement ^43. Cette demande d'enregistrement de multiview est activement développé plus loin et continue à améliorer. En cas de problèmes ou demandes de fonctionnalités pour le logiciel décrit, s'il vous plaît déposer des questions sur les pages GitHub respectives ( Link 4 pour la reconstruction et le Multiview Lien 5 pour BigDataViewer).

La deuxième option consiste à utiliser le logiciel disponible dans le commerce avec le microscope. Cette solution fonctionne bien et emploie le même principe de l'utilisation de perles fluorescentes pour enregistrer les différents points de vue. Cependant, il manque la possibilité de visualiser l'ensemble des données rapide comme avec le BigDataViewer. De plus, le logiciel ne peut pas être adapté à la grappe et en outre les blocs de traitement du microscope pour les autres utilisateurs, sauf si licence supplémentaire pour le logiciel est acheté.

La troisième option, qui est aussi un logiciel open source, a été publié récemment par le laboratoire Keller ⁴⁴ et fournit un cadre global pour le traitement et l' analyse en aval des données de la feuille de lumière. Ce logiciel utilise les informations à partir de l'échantillon pour effectuer la fusion multivue, par conséquent il ne nécessite pas la présence de billes fluorescentes autour de l'échantillon. Mais en même temps , il assume l' orientation orthogonale des vues d'imagerie (objectifs), de sorte qu'il ne peut pas être utilisé pour les données acquises à partir d' angles arbitraires ^44.

Exigences matérielles

ntent "> Le matériel utilisé pour le traitement peut être trouvé dans le tableau 4. Il doit y avoir une capacité de stockage suffisante et d' un pipeline clair pour le traitement des données disponibles, en avance sur l'expérience réelle. L' acquisition des images est plus rapide que l' analyse ultérieure et il est facile pour obtenir inondé de données non traitées. Il est souvent irréaliste de stocker toutes les images brutes, mais plutôt une version recadrée ou images traitées comme des vues fusionnées, des projections d'intensité maximale ou projections sphériques ^45.

Processeur	Deux processeurs Intel Xeon E5-2630 (Six Core 2,30 GHz Turbo, 15 Mo, 7,2 GT / s)
Mémoire	128 Go (16 x 8 Go) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Disque dur	4 × 4 To Serial ATA 3,5 pouces (7.200 rpm) Disque dur
contrôleur de disque dur	PERC H310 SATA / SAS Controller pour Dell Precision
Configuration du disque dur	C1 SATA 3,5 pouces, 1-4 Disques durs
Graphique	Dual 2 Go NVIDIA Quadro 4000 (2 cartes w / 2 DP et 1 DVI-I chacun) (2 DP-DVI et 2 adaptateur DVI-VGA) (MRGA17H)
Réseau	Intel X520-T2 Dual Port 10 GbE carte d'interface réseau

Tableau 4: Configuration matérielle requise.

la vitesse de traitement des données

Le temps nécessaire pour le traitement de données dépend des dimensions des données et du matériel utilisé. Dans le tableau 1, nous présentons un aperçu du temps requis pour les étapes clés dans le traitement d' un ensemble de données GB multiview exemple 8.6 qui se composait de 1 point de temps avec 4 vues et 2 canaux.

traitement step	Temps	Protocole étape
Réenregistrez comme HDF5	6 min 30 sec	6.3
Détecter Points d'intérêt	20 sec	6.4
Inscrivez-vous en utilisant les points d'intérêt	3 s	6.5
basé sur le contenu fusion multiview	4 h	7.2
Multiview déconvolution (CPU)	8 h	7.3
Multiview déconvolution (GPU)	2 h	7.3

Tableau 1: Traitement de données Temps.

formats de données d'entrée pour la reconstruction multiview

Le Fiji Plugin Multiview Reconstruction peut soutenir .czi, .tif et formats de ome.tiff. En raison de la structure de données du format .czi, des jeux de données ne sont pas discontinuespris en charge sans traitement préalable. Discontinus signifie que l'enregistrement devait être redémarré (par exemple , pour réajuster les positions en raison de la dérive de l'échantillon). Dans ce cas, les fichiers .czi doivent être réenregistrées comme .tif. Pour les fichiers .tif chaque vue et la direction d'éclairage doit être enregistré dans un fichier séparé.

Calibration de la taille de pixel

Le logiciel microscope-exploitation calcule l'étalonnage pour la taille xy de pixel sur la base de l'objectif sélectionné. Cependant, la taille des pixels en z est défini de manière indépendante par la taille de pas. Si un mauvais objectif est spécifié dans le logiciel xy z rapport est incorrect et l'enregistrement échouera.

inscription initiale

Après avoir défini l'ensemble de données le nombre d'inscriptions sera 1 et le nombre de points d'intérêt sera de 0 dans le ViewSetup Explorer. L'enregistrement initial représente l'étalonnage de l'ensemble de données. Tant le nombre oinscriptions f et les points d'intérêt augmenteront au cours du traitement.

Bas échantillonnage pour la détection de points d'intérêt

Utilisation de sous-échantillonnage est recommandé, car le chargement des fichiers et la segmentation sera beaucoup plus rapide. Il est toutefois important de noter que les paramètres de détection vont changer en fonction de l'échantillonnage vers le bas, transférant ainsi les paramètres de détection entre les différents paramètres de l'échantillon vers le bas est pas possible.

Détection des points d'intérêt

Il est conseillé de le segment le plus grand nombre de véritables perles que possible dans chaque vue, même au prix d'obtenir des détections faussement positives, parce qu'elles ne gênent pas l'enregistrement considérablement. détections parasites, si peu nombreux, sont exclus lors de l'inscription (voir Enregistrement de points d'intérêt). Cependant, les détections faussement positives massives posent un problème à l'algorithme. Il a non seulement réduit les performances de détection etl'enregistrement, car il faut beaucoup plus de temps pour segmenter l'image ainsi que de comparer ces perles entre les points de vue, mais il réduit aussi la précision de l'enregistrement. Cela peut être résolu en utilisant des paramètres de détection plus strictes. En outre, sur la segmentation des perles (ie plusieurs détections sur une perle Figure 1E) est préjudiciable à l'enregistrement et doit être évitée.

Enregistrement de points d'intérêt

Pour enregistrer les vues sur l'autre, l'emplacement de chaque perle dans chaque vue est décrit par sa position par rapport à ses trois perles voisins les plus proches. Ces constellations forment un descripteur géométrique local et permettent de comparer chaque perle entre les vues. Perles avec correspondance descripteur entre deux points de vue sont alors considérées comme des correspondances candidats. A noter que ceci ne fonctionne que pour les billes distribuées de façon aléatoire, pour lesquels les descripteurs locaux sont généralement unique pour chaque perle.On peut utiliser d'autres structures telles que des noyaux dans l'échantillon d'enregistrement. Toutefois, afin de détecter les noyaux, qui sont distribués de manière aléatoire non dans l'échantillon, d' autres méthodes sont applicables ^20,21.

Les correspondances candidats sont ensuite testés contre RANSAC ³⁶ afin d'exclure les faux positifs. Chaque correspondance suggère un modèle de transformation pour superposer les vues sur l'autre. Les vrais correspondances seraient probablement d'accord sur un modèle de transformation, alors que les valeurs aberrantes serait chaque point à un autre. Les véritables correspondances sont ensuite utilisées pour calculer un modèle de transformation affine entre les deux points de vue par rapport. Une optimisation globale avec un algorithme d'optimisation itérative est ensuite réalisée, au cours de laquelle tous les points de vue sont enregistrés sur la première vue dans le but de déplacement minimal entre les vues ^20,21.

enregistrement Time-lapse

En raison de se déplacerment du mouvement du moteur agarose et imprécis de la platine du microscope, la position de chaque pile varie modérément au fil du temps. Considérant que l'enregistrement du point de temps individuel supprime la différence entre les vues de ce point de temps, le time-lapse doit également être enregistré dans son ensemble. À cette fin, chaque point de temps individuel est inscrit sur le point de temps de référence.

point de temps de référence

Si une série de temps avec de nombreux points de temps est traitée, un point temporel représentatif est choisi comme référence généralement à partir du milieu de la série de temps puisque les intensités de perles peuvent se dégrader au fil du temps en raison de blanchiment. Sur cette référence, les paramètres de détection de points d'intérêt, l'enregistrement, zone de délimitation et la fusion peuvent être déterminées. Ces paramètres sont ensuite appliqués à l'ensemble du laps de temps pour calculer un modèle de transformation spécifique pour chaque point de temps individuel. Lors de l'enregistrement time-lapse tous les autres points de temps sont également registEred spatialement sur ce point de temps de référence. Ainsi, les paramètres de la boîte de sélection pour la totalité de l'enregistrement sont en fonction de ce point de temps spécifique.

enregistrement multicanal

Lorsque l'imagerie de multiples canaux, idéalement les mêmes billes fluorescentes doivent être visibles dans tous les canaux imagées. La détection et l'enregistrement peuvent être réalisés sur chaque canal individuellement, ce qui prend en compte l'influence des différentes longueurs d'ondes lumineuses sur la transformation. Souvent, cela est impossible, parce que les perles ne sont pas visibles dans tous les canaux ou les perles dominent l'image trop dans un canal et sont trop faible dans l'autre canal (s). La solution classique consiste à utiliser des billes visibles que dans un seul canal pour la détection et l' enregistrement et le modèle de transformation acquis (c. - après la détection, l' enregistrement et l' enregistrement time-lapse) est ensuite appliqué aux autres canaux par les Fidji> Plugins> Multiview Reconstruction> Traitement par lots> Outils> Duplicate Transformations. Dans la liste déroulante pour Appliquer la transformation de sélectionner un canal à d' autres canaux. Dans la fenêtre suivante , sélectionnez le XML et cliquez sur OK. Ensuite , sélectionnez le canal qui contient les perles comme canal de source et que le canal cible sélectionner le canal (s) sans perles. Pour Duplicate qui transformations utilisent Remplacer toutes les transformations et appuyez sur OK. Les transformations sont ensuite copiées sur tous les autres canaux et enregistrés dans le fichier XML. Pour voir les nouvelles transformations dans le ViewSetup Explorer, redémarrez la reconstruction application MultiView.

Le cadre de sélection

La fusion de vues multiples est informatiquement très intense. Cependant, les grandes images sont généralement acquises pour accueillir non seulement l'échantillon, mais aussi les perles autour d'elle. Une fois que le paramètre d'enregistrements sont extraits à partir des billes, elles ne sont plus utiles en tant que partie de l'image. Par conséquent, pour augmenter l'efficacité de la fusion, seules les parties des piles d'images contenant l'échantillon doivent être fusionnés ensemble. Une région d'intérêt (boîte de délimitation) doit être défini pour contenir l'échantillon et aussi peu de l'agarose entourant possible. Pour l'exemple de la figure 2 une fusion moyenne pondérée sur l'ensemble du volume avec 2229 × 2136 × 2106 px exigerait 38,196 Mo de RAM, alors qu'avec une boîte de délimitation du volume est réduit à 1634 × 1746 × 1632 px et les besoins en mémoire sont réduites à 17,729 MB.

basé sur le contenu fusion multiview

Le défi de la fusion des données multivues est que les vues se terminent généralement brusquement et ne contiennent pas la même qualité d'image pour les mêmes voxels. la moyenne simple des vues conduirait donc à des artefacts de mélange et de la dégradation de l'image inutile. basé sur le contenu multiview fu sion prend ces deux problèmes en compte. Tout d' abord, il mélange les différents points de vue, où une image se termine et l'autre commence et , deuxièmement, il évalue la qualité de l' image locale et applique des poids plus élevés pour une meilleure qualité d'image dans la fusion ^21. Par rapport à une seule vue il y a une amélioration de la résolution en z avec une légère dégradation du signal en xy (Figure 2E-H, la figure 5A-D).

Multiview déconvolution

déconvolution Multiview est une autre approche pour réaliser la fusion des vues. Avec cette méthode, aussi les PSF des différents points de vue sont pris en compte afin de récupérer l'image qui a été convoluée par l'optique du microscope. Cette méthode améliore considérablement la qualité de l' image en éliminant le flou et l' augmentation de la résolution et le contraste du signal ³¹ (figure 2C-D, Figure 2I-J, Figure 5E-G, Film 3).

ve_content "> Déconvolution est informatiquement très intense (voir le tableau 1), en utilisant donc un GPU pour le traitement augmente la vitesse de ce processus. Il peut également être nécessaire d'effectuer la déconvolution sur des données échantillonné. Pour l' échantillon vers le bas, utilisez Fidji> Multiview Reconstruction > traitement par lots> Outils> appliquer transformations. Ce sera appliquer un nouveau modèle de transformation sur les vues qui seront enregistrées dans le fichier .xml.

format de fichier HDF5 pour BigDataViewer et BigDataServer

Le BigDataViewer ³³ permet de visualiser facilement des données de téraoctets. Comment contrôler l'BigDataViewer est résumée dans le tableau 2. Un screencast de l'opération de base du programme est également disponible en tant que supplément dans sa publication originale ^33. Le BigDataViewer est centré sur un fichier .xml qui contient les métadonnées, et un fichier hdf5, qui contient les données d'image. Les données d'image sont present dans le hdf5 en plusieurs niveaux de résolution dans les blocs 3D. Les niveaux de résolution multiples permettent de visualiser les données plus rapide avec une résolution inférieure, avant la pleine résolution est chargé. blocs individuels ne sont chargés en mémoire en cas de besoin. Ainsi, le format d'image hdf5 permet la visualisation directe et rapide des données via le BigDataViewer ^33. Elle permet également d'accélérer le traitement, depuis le chargement des fichiers est effectuée de manière plus efficace. Par conséquent, nous recommandons réenregistrer l'ensemble de données dans ce format, bien qu'il ne soit pas strictement nécessaire pour le traitement. Pour plus d' explications sur le format de données, s'il vous plaît se référer à Link 3 . En outre, les ensembles de données peuvent être partagées avec des collaborateurs ou du public en utilisant le BigDataServer ³³ ( Lien 6 ).

clé	effet
F1	montre l'aide d'une brève description de la BigDataViewer et son fonctionnement de base
<> Roue ou de la souris	mouvement dans z
flèches haut et bas	zoom avant et arrière
clic droit et faites glisser	déplace l'échantillon dans le visualiseur
clic gauche et faites glisser	tourne échantillon autour du curseur
curseur en bas de la visionneuse ou Tab et la flèche gauche ou droite	se déplace sur l'axe des temps
appuyant en outre déplacement	un mouvement plus rapide ou rotation le long d'un axe quelconque
x et la flèche, puis à gauche et à droite	tourne autour de l'axe x
flèche y et puis à gauche et à droite	tourne autour de l'axe y
z et puis à gauche et la flèche droite	tourne autour de l'axe z
décalage et x	oriente la vue selon l'axe x
changement et y	oriente la vue le long de l'axe y
décalage et z	oriente la vue le long de l'axe z
je	commutateurs entre les différents modes d'interpolation (ie voisin le plus proche et trilinéaire)
s ou Réglages> Luminosité et contraste	modifie la couleur des canaux luminosité et le contraste
F6 ou Paramètres> Visibilité et groupement	modifie les groupes affichés, permet le regroupement de superposer différents groupes et en appelant les groupes via les touches numériques
F10 ou Outils> Enregistrer un film	acquiert une série chronologique de la tranche en cours d'affichage

Tableau 2: Big Data Viewer.

3. Limitations de la mise en œuvre décrit des LSFM

faible débit

Dans une expérience typique LSFM un seul échantillon par expérience est imagée. Pourtant, dans notre expérience, beaucoup d'informations utiles peut être extraite de cet échantillon unique. Imagerie à haut débit de plusieurs embryons a été récemment réalisés dans la maison construite LSFM configurations ^46-48, bien que généralement au détriment de la liberté de positionnement de l' échantillon et la rotation.

pénétration profonde insuffisante dans les tissus

Même si les embryons de poisson zèbre sont translucides, la qualité d'image obtenue se dégrade rapidement lors de l'imagerie plus profonde dans le tissu en raison de la diffusion et de l'absorption. Partiellement cela est un effet de la diffusion et l'absorption de la fluorescence émise par l'échantillon et ne peut pas être corrigé dans la configuration actuelle. Une autre source de la qualité d'image est inégale l'éclairement irrégulier. Til nappe de lumière est incidente à partir du côté gauche ou à droite et tous les objets dans son chemin réfracter, ce qui se traduit par des artefacts de bande et flou. L'éclairage et multiview face fusion double peut diminuer les artefacts dans l'image finale. Enfin, la qualité de l'image a tendance à être légèrement moins bonne vers le bord du champ de vision due à la géométrie naturelle de la nappe de lumière, qui est de plus en plus épaisse vers les bords.

manipulation chimique limitée

L'utilisation de médicaments ou d'inhibiteurs est très répandue dans la recherche zebrafish. Dans cette utilisation du microscope de médicaments est limitée, en raison du grand volume de la chambre de l'échantillon et des considérations d'autres utilisateurs de l'instrument, qui partagent la même chambre. L'utilisation d'une chambre supplémentaire dédiée à l'expérimentation de drogues peut résoudre ce problème. Remplissage de la chambre en partie par des billes de verre permet de réduire le volume de liquide qui est nécessaire.

Non photomanipulation

Currently il n'y a aucune possibilité de manipulation optique localisée comme photoconversion, ou ablation au laser dans ce microscope. Néanmoins, la maison construite configurations peuvent être utilisées pour de telles applications spécifiques.

4. Importance et futures applications

LSFM est la meilleure méthode disponible à ce jour pour l'imagerie rapide de gros volumes d'embryons vivants. La plupart des expériences imaginables sur un microscope confocal peut également être effectuée sur une feuille microscope optique avec des avantages mentionnés ci-dessus. Dans le cas de l'imagerie du développement de l'œil, la vitesse de LSFM est pas le paramètre crucial. Au lieu de cela, le faible phototoxicité et la flexibilité dans le positionnement de l'échantillon sont les avantages décisifs.

Les données de LSFM ont un SNR élevé, ce qui contribue à obtenir de bons résultats de déconvolution et est également bénéfique pour l'analyse automatisée de l'image et le suivi d'objets. En conclusion, LSFM est un excellent outil pour générer des données quantifiables sur le développement embryonnaire et overacellule ll et les caractéristiques des tissus pour la modélisation ultérieure et les descriptions physiques des processus en question.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopie
Agarose à bas point de fusion	Roth	6351.1
Agarose à bas point de fusion	Sigma	A4018 ou A9414
Méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle (MESAB/MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
N-Phénylthiourée (PTU)	Sigma	P7629
500 nm rouge fluorescent perles F-Y 050	Millipore (Estapor)	80380495
20 &mu ; l (1  ; mm diamètre intérieur, marqué en noir) Marque		701904	vendue comme pièce de rechange pour transferpettor
Pistons d’embout en téflon pour 20  ; &mu ; l capillaires	Marque 701932		vendue comme pièce de rechange pour transferpettor
Lamelles circulaires en verre diamètre 18 mm, épaisseur choisie 0,17  ; mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
Joints toriques pour fenêtres de chambre 17× ; Pince	épiler de microscopie
, style 55	Dumont	0209-55-PO
Seringues Luer-Lock de 50 ml	Becton Dickinson	300865
150 cm Câble d’extension pour perfusion compatible avec les seringues Luer-Lock	Becton Dickinson	397400
Links
Lien 1 Application			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Lien 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer