Méthodes pour l'étude de complexes macromoléculaires contenant MRP4 dans le règlement du fibroblaste Migration

Résumé

MRP4 réglemente les divers événements de signalisation nucléotidiques dépendant cycliques, y compris un rôle récemment élucidé dans la migration cellulaire. Nous décrivons une approche directe, mais à multiples facettes pour démêler les cibles moléculaires en aval de MRP4 aboutissant à l'identification d'un interactome MRP4 unique qui joue un rôle clé dans la régulation de fine de la migration des fibroblastes.

Résumé

Polychimiothérapie protéine de résistance 4 (MRP4) est un membre de la famille des cassettes de liaison ATP des transporteurs membranaires et est un transporteur d'efflux endogène des nucléotides cycliques. En modulant la concentration intracellulaire de nucléotides cycliques, MRP4 peut réguler des événements cellulaires multiples dépendant nucléotidiques cycliques, y compris la migration cellulaire. Précédemment, nous avons démontré qu'en l'absence de MRP4, les cellules fibroblastiques contiennent des niveaux plus élevés de nucleotides cycliques intracellulaires et peuvent migrer plus rapidement. Pour comprendre les mécanismes sous-jacents de cette constatation, nous avons adopté une approche directe encore aux multiples facettes. Tout d'abord, nous avons isolé les complexes potentiels de protéines qui interagissent de MRP4 à partir d'un système de pile à MRP4 surexpression utilisant une immunoprécipitation suivie d'une spectrométrie de masse. Après l'identification des protéines uniques dans le interactome MRP4, nous avons utilisé Ingenuity Pathway Analysis (IPA) pour étudier le rôle de ces interactions protéine-protéine dans le contexte de la transduction du signal. Nous élucidé le potentiel rôle du complexe protéique MRP4 dans la migration cellulaire et identifié F-actine comme un médiateur majeur de l'effet de MRP4 sur la migration cellulaire. Cette étude a également souligné le rôle de l'AMPc et GMPc comme des acteurs clés dans les phénomènes migratoires. En utilisant la microscopie à haute teneur, nous avons effectué des analyses de cellules migration et observé que l'effet de MRP4 sur la migration des fibroblastes est complètement abolie par la perturbation du cytosquelette d'actine ou l'inhibition de l'AMPc-dépendante kinase A (PKA). Pour visualiser les modulations de signalisation dans une cellule de la migration en temps réel, nous avons utilisé un capteur à base de FRET pour mesurer l' activité PKA et trouvé, la présence de l' activité PKA plus polarisée près de la pointe de la migration MRP4 ^{- / -} fibroblaste, par rapport à MRP4 ^{+ / +} fibroblastes. Cela augmente la formation d'actine corticale et augmenté le processus de migration. Notre approche permet d'identifier les protéines qui agissent en aval MRP4 et nous donne une plusvue du mécanisme impliqué dans la régulation de MRP4 dépendant de la migration des fibroblastes.

Introduction

La migration cellulaire est un processus en plusieurs étapes compliquées. Des études ont montré que, pendant les cellules de migration sont polarisés en bords avant et arrière. En adhérant à la matrice extracellulaire, le bord d'attaque fournit la traction nécessaire pour le corps de la cellule à se déplacer vers l'avant. Enfin, les bords de fuite libère les pièces jointes arrière et complète le ^1,2 du cycle de migration.

Cellule polarisation pour la migration cellulaire efficace est régulée par la ségrégation spatiale de la signalisation intracellulaire. Seconds messagers cellulaires, tels que l' AMPc, la médiation de la compartimentation des événements de signalisation nécessaires pour affiner directionnelle ^3,4 de migration cellulaire. Accumulations préférentielles de AMPc et AMPc-kinase dépendante de l' activité PKA à la fine pointe jouent un rôle clé dans la migration cellulaire directionnelle ^5,6. Par phosphorylant petites GTPases tels que substrat liés à Ras toxine botulique C3 (Rac) et le contrôle de la division cellulaire protéine 42 homologue ou Cdc42, PKA active la protéine apparentée à l' actine 2/3 (2/3 Arp) au niveau du bord d' attaque et induit la formation de lamellipodes ^7-9. PKA phosphoryle également un agent anti-bouchage, vasodilatateur phosphoprotéine stimulée (VASP), régule ainsi les cycles d'oscillation de l' extension de la membrane et la rétraction ^10,11.

Dans les cellules, les taux d'AMPc sont régies par trois processus principaux: i) la synthèse de l' adénylate cyclase, ii) la dégradation par phosphodiestérases, et iii) le transport par membranaires transporteurs d' efflux ^3. Polychimiothérapie protéine de résistance 4 (MRP4), membre de ATP-binding cassette (ABC) famille de transporteurs membranaires, fonctionne comme un transporteur d'efflux endogène des nucléotides cycliques. Par conséquent, MRP4 peut réguler les taux d'AMPc intracellulaires et dépendante de l' AMPc cellulaire de signalisation ^11-13. Nous avons précédemment montré que , dans MRP4 ^{- / -,} les fibroblastes contiennent des niveaux relativement élevés de nucléotides cycliques et migrent plus rapidement car rapport à MRP4 ^{+ / + 14} fibroblastes. Nous avons également signalé un effet biphasique de nucléotides cycliques sur la migration des fibroblastes. Basé sur des études antérieures et nous avons conclu que MRP4 ^{- / -} fibroblastes contiennent AMPc plus polarisée au cours de la migration, nous avons émis l' hypothèse que ce règlement MRP4 médiation de la migration des fibroblastes est AMPc dépendante. Afin de comprendre le mécanisme en aval, nous avons pris une approche directe encore aux multiples facettes.

Afin d'identifier les protéines associées et en interaction avec MRP4, on a immunoprécipité des complexes macromoléculaires contenant MRP4-de cellules HEK293 qui expriment plus MRP4. En utilisant la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs protéines MRP4 interagissant et analysé leur interconnectivité en utilisant Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA est un outil utile pour analyser les interactions protéine-protéine (à la fois structurelles et fonctionnelles) et d'explorer leurs contributions en particulier physiologiques et pathologiquesévénements basés sur la littérature et des preuves expérimentales ^15,16. CPl a indiqué que la F-actine est une cible en aval de la majeure MRP4 dans le contexte de la migration des cellules où l' AMPc et du GMPc sont la clé de ¹⁷ molécules de signalisation. Ces données ont été confirmées par une teneur élevée microscopie. La microscopie à haute teneur peut capturer et analyser les comportements cellulaires telles que la migration des cellules d'une manière plus commode, précis et à haut débit ^18. Les données à haute teneur en microscopie ont démontré que l'effet de MRP4 sur la migration des fibroblastes est complètement abolie perturbation du cytosquelette d'actine ou de l' inhibition de la PKA ^17.

En outre, nous avons utilisé un transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) à base de capteur PKA pour surveiller la dynamique PKA dans les cellules de la migration en temps réel. Capteurs de kinase à base de FRET se composent généralement de peptides de substrat de phosphorylation spécifiques flanquées de PCP et fluorophores YFP ^19-21. pmAKAR3 est un amélioré et moiMbrane ciblé PKA capteur basé sur le FRET qui contient le domaine forkhead 1 associé (FHA1) et la séquence de substrat PKA LRRATLVD ^5,22. Phosphorylation de pmAKAR3 par les PKA catalytic subunit augmente FRET signal entre CFP et YFP ^19. L' insertion d'un domaine de modification des lipides dans le capteur cible à la membrane du plasma pour le contrôle dynamique de la PKA, notamment au niveau du compartiment de la membrane ^23.

Utilisation de pmAKAR3, nous avons démontré que la pointe de la migration MRP4 ^{- / -} fibroblastes présentaient une activité PKA plus polarisée MRP4 ^{+ / +} fibroblastes, qui à son tour augmenté la formation d'actine corticale au bord d' attaque de la cellule ^17. Ensemble, ces événements ont donné lieu à une meilleure polarisation cellulaire et la migration cellulaire directionnelle plus rapide en l'absence de MRP4. Notre approche spécifique et directe a identifié des cibles en aval clés pour MRP4 et fournit un élément important, mais commed'encore inexplorée mécanisme de régulation de MRP4 dépendant de la migration des fibroblastes.

Protocole

1. Ingenuity Pathway Analysis

1. Uploading Protein-interactome Dataset
   1. Insérer les protéines / gènes d'intérêt dans une feuille de calcul avec leurs identificateurs uniques de gènes (de préférence des symboles de gènes et des numéros d'identification de gènes tels qu'ils sont obtenus avec des données de spectrométrie de masse).
   2. Attribuer une colonne dans la feuille de calcul pour le numéro d'identification de gènes et une colonne pour la valeur d' observation (par exemple., Plier changement ou p-valeur). Sélectionnez l'option "contient en-tête de colonne" pour afficher les titres des colonnes.
   3. Téléchargez le jeu de données sur le PAI en cliquant sur l'onglet téléchargement de données et en sélectionnant la feuille de calcul mentionné ci-dessus. Choisissez l'onglet Format flexible, et sélectionnez la catégorie appropriée d'identification de gènes.
      Remarque: Un format flexible de l'ensemble de données surmonte les spécifications de mise en forme pour le téléchargement.
   4. Après le jeu de données apparaît, sélectionnez ID et d'observation des colonnes. Veiller à ce que toutes les protéines (MRP4 interactome identifiés par la masse-spectrometry) sont mappés en vérifiant sur l'onglet Récapitulatif de l'ensemble de données. L'ensemble de données est maintenant prêt pour l'analyse souhaitée.
2. L'analyse des données
   Note: Décrite sont les utilisations partielles des caractéristiques du PAI qui ont été utilisés pour cette étude.
   1. Après avoir téléchargé MRP4 interactome avec leurs noms de gènes que les identificateurs uniques, cliquez sur le nouveau et choisissez l'analyse de base dans le menu en haut à gauche du logiciel IPA.
   2. Définir la valeur des seuils d'expression pour l'intensité en fonction du type d'expérience (valeur d'intensité 100 est recommandée pour l'analyse).
   3. Calculer le facteur de variation de l'expression tout en préparant l'ensemble de données si les conditions de contrôle et expérimentaux sont impliqués et l'inclure dans le cadre du fichier de données si une analyse de comparaison doit être effectuée (Une valeur de 1,5 facteur de variation de coupure est généralement recommandé pour l'analyse ).
      Nota: Après l'achèvement de l'analyse de base, des sections multiples d'analyses peuvent être obtenues. Le premier onglet affiche le résumé de the total des analyses et suggère top voies canoniques, les régulateurs en amont, des fonctions moléculaires et cellulaires, et des réseaux entre autres; tous calculés sur la base du niveau de confiance (valeur p) et disposées dans l'ordre croissant de la valeur de p.
   4. Ouvrez les principales voies canoniques (en utilisant l'option ouverte de la voie) que les grands réseaux moléculaires qui montrent picturalement croix parler, qui se chevauchent, et affectées les voies de signalisation.
      Consultez la liste des voies canoniques qui sont majorly en cause fondée sur la valeur de p (p <0,05 est considérée comme significative).
      Remarque: Les valeurs de signification pour les voies canoniques sont calculées par le test exact de Fisher droit à queue. La signification indique la probabilité d'association de molécules de l'ensemble de données avec la voie canonique par hasard seul.
   5. Confirmez les protéines d'entrée (MRP4 de interactome identifié par spectrométrie de masse) parmi la liste des protéines impliquées dans chaque voie.
      Remarque: L'utilisation de ce option, il a été observé que le réseau de signalisation cellulaire cytosquelette d' actine est la voie majeure affectée et la façon dont les protéines d'entrée entrent dans le (Figure 1). Cette approche permet d'identifier les réseaux moléculaires seraient étroitement associés et affectés par les protéines de test.
   6. Utilisez l'onglet de réseau dans les analyses pour identifier les maladies top et les fonctions qui sont potentiellement liées à un réseau de protéine particulière basée sur le nombre de molécules de discussion.
      Note: Une valeur de score est donnée sur la base des protéines connues qui sont déterminées dans le cadre d'un réseau , par exemple, l' assemblage cellulaire et réseau de l' organisation, par la connaissance de la littérature et des preuves expérimentales et de se concentrer des molécules qui sont identifiées à partir du jeu de données et de faire partie du réseau. . Désormais, le réseau est filtrée en premier lieu sur la base du nombre de molécules de discussion.

2. Haut-contenu Microscopie

1. Préparation de cellules
   Note: Tous les travaux de culture cellulaire a été réalisée dans le cadre du flux horizontal hotte de culture cellulaire.
   1. Utilisez microplaques de 96 puits pour le dosage de cicatrisation.
   2. Enduire la microplaque avec une solution de fibronectine 1% (reconstitué dans du PBS), et de garder la plaque dans une norme CO ₂ incubateur à 37 ° C pendant 2 heures.
   3. Supprimer la MRP4 ^{- / -} et MRP4 ^{+ / +} souris fibroblaste embryonnaire (FAE) ont été cultivés dans 25 cm² culture cellulaire flacons de l'incubateur, lavage 1 fois avec du PBS et trypsiniser les cellules pendant 5 minutes en utilisant 1 ml de 4x solution de trypsine-EDTA.
   4. Laver les cellules avec du milieu complet (DMEM contenant 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine) et les remettre en suspension dans 5 ml de milieu complet.
   5. Aspirer la solution de fibronectine dans les puits. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et de semences de 30.000 cellules (nombre de cellules doit être optimisé en fonction du type de cellules) dans chaque puits.
   6. Cultiver les cellules à 100% de confluence dans une normeIncubateur à _CO2 à 37 ° C pendant 24 heures.
2. Wound Création
   1. Vérifiez que tous les puits sont remplis de solution. Remplir les puits inutilisés avec du PBS pour éviter d' endommager l'outil de la plaie faire (par exemple., WoundMaker).
   2. Après confirmation de 100% de confluence cellulaire, placez la plaque à 96 puits à l'intérieur de l'outil de la plaie faisant sur la plaque de base métallique et appuyez sur le bloc de broche 96 puits vers le bas.
   3. Laver les cellules trois fois avec du PBS pour éliminer toutes les cellules délogées et ajouter 100 ul de milieu complet.
   4. Ajouter les composés d'essai - H-89 (50 uM; 1: 1000 dilution avec un milieu complet en utilisant 50 mM dans du DMSO) ou latrunculine B (1 uM; 1: 1000 dilution avec un milieu complet en utilisant 1 mM dans du DMSO) à ce stade .
   5. Placer la plaque d'essai à l'intérieur du lecteur à 37 ° C et de surveiller la migration au cours de la période expérimentale.
3. Surveillance de la migration cellulaire
   Remarque: La migration cellulaire a été contrôlée à l'aide du microscope et le logiciel provided à haute teneur en système de microscopie. L'utilisation de microplaques de 96 puits assure que les blessures sont automatiquement contrôlées par le microscope et enregistrés par le logiciel.
   1. Réglez le logiciel pour scanner la plaque d'essai toutes les heures pour les essais de migration en utilisant l'onglet de balayage horaire. Sélectionnez une heure de début au moins 15 minutes après avoir placé la plaque d'essai à l'intérieur du lecteur pour permettre l'équilibration avant l'imagerie.
   2. Sélectionnez le magasin et choisir le type de navire (microplaque à 96 puits) et le type d'expérience (Scratch Wound).
   3. Sélectionnez objectif 10X et choisissez les paramètres d'imagerie à contraste de phase. Sélectionnez les puits qui doivent être numérisés en utilisant l'option de balayage de motif d'édition.
   4. Spécifiez les groupes de traitements et des répétitions en sélectionnant l'onglet des propriétés et la mise en place d'une carte de plaque. L'analyse peut être arrêtée à tout moment en fonction de la condition expérimentale.
4. L'analyse des données
   1. Après le balayage est effectué, sélectionnez l'onglet Affichage de la cuve pour la plaque d'essai. go les services publics d'emploi d'analyse et sélectionnez le lancement de nouvelles analyses emploi.
   2. Régler zéro blessure comme type de travail et sélectionnez l'intervalle de temps pour le (point à 24 h Point de 0 Temps de temps) analyse.
   3. Sélectionnez les puits pour être choisis pour l'analyse par un simple clic sur le puits et cliquez sur 'OK' pour lancer l'analyse. Une fois l'analyse effectuée, de visualiser graphiquement les données par rapport densité de la plaie (RWD) pour chaque puits à chaque point de temps en utilisant l'exportation vers l'option graphique.
   4. Voir le contraste de phase série d'images de chaque puits correspondant à différents points de temps en utilisant l'onglet affichage de l'image. Sélectionnez un puits spécifique en cliquant sur la carte de la plaque, sélectionnez un point de temps spécifique dans l'onglet plage de temps et cliquez sur l'onglet affichage de l'image.

3. Transfert Förster Resonance Energy (FRET)

1. Préparation de cellules
   1. Manteau plats à fond de verre de 35 mm avec 100 pi de solution de fibronectine 1% (comme décrit dans la section 2.1) et les conserver dansun incubateur à _CO2 standard à 37 ° C pendant 2 heures.
   2. Aspirer la solution de fibronectine à partir des plaques et des semences un nombre égal de cellules HEK293 (10000 cellules / plaque) dans un milieu complet.
   3. Cultiver les cellules à 60-70% de confluence dans les plats à fond de verre enduites de fibronectine dans une norme CO ₂ incubateur à 37 ° C pendant 24 heures.
2. transfection
   1. Effectuer toutes les transfections transitoires en utilisant un réactif de transfection du commerce, selon les instructions du fabricant.
   2. Aliquote de 250 ul de milieu complet en deux tubes de 1,5 ml de centrifugeuse stériles séparés pour chaque boîte de 35 mm.
   3. Ajouter 2 ug d'ADN (ou pmAKAR3 pmAKAR3-TA) dans un tube et 5 ul (2,5 fois la concentration d'ADN) d'un réactif de transfection dans un autre tube.
   4. Incuber les tubes pendant 20 minutes à la température ambiante, puis transférer l'ADN dilué dans le tube contenant le réactif de transfection.
   5. Bien mélanger et incuber à 37° C pendant encore 30 min.
   6. Aspirer le milieu hors les cellules et les laver une fois avec PBS. Ajouter 1 ml de DMEM sans antibiotique F-12 contenant 10% de SVF aux cellules.
   7. Ajouter 507 pi de conjugué d'ADN-lipide avec les médias pour les cellules dans chaque assiette, mélanger doucement et garder dans le CO ₂ incubateur à 37 ° C pendant 48 heures. Utilisez 2 pg d'ADN (1 pg / pl de stocks) et 5 pi de lipides pour 10,000-50,000 cellules dans chaque plaque.
3. Imagerie des cellules vivantes
   1. Après 48 heures de transfection, retirer le milieu de croissance et laver les cellules 2 fois avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, pré-chauffé à 37 ° C). Ajouter un volume final de 1,9 ml de HBSS les cellules ont été lavées et les monter sur un système de microscope à champ large inversé pour l'imagerie FRET à l'intérieur d'un sur mesure 37 ° C enceinte maintenue.
      Remarque: Dans ce système, la lumière d'excitation est fournie par une lampe de 300 W Xenon atténuée avec un filtre de densité neutre avec 50% transmiss de lumièreion.
   2. Utilisez objectif 60X. mise au point manuellement sur les cellules et définir un champ de vision optimal à l'aide du microscope. Activez le champ de vue sélectionné sur l'écran d'ordinateur en utilisant l'option de mise au point "F" sur le logiciel. Pour effectuer des mesures de FRET, sélectionnez l'ensemble approprié de filtre (filtre CFP / YFP sertie d'un 430/25 filtre nm d'excitation, un double diviseur de faisceau dichroïque, et deux filtres d'émission (470/30 nm pour la PCP et 535/30 nm pour FRET) manuellement.
   3. Visualisez la fluorescence en vérifiant d'abord sur l'option de canal CFP / YFP / FRET suivi en cliquant sur l'onglet Fluor ouvert. Améliorer l'intensité du signal à l'aide de l'outil d'intensification dans l'onglet de la caméra.
   4. Sélectionnez les cellules exprimant pmAKAR3 ou pmAKAR3-TA en évitant la saturation de l'intensité du signal. Utilisez la fenêtre de capture pour lancer la mesure FRET.
   5. Sélectionnez l'option time-lapse et la configuration d'un temps de balayage pendant 30 min avec un intervalle de 30 secondes. Cochez l'option FRET et régler le temps d'exposition à 100 msec. Entrez le une étiquette d'imaged Appuyez sur Start pour lancer la mesure.
   6. Après cinq points de temps et mise en place d'une ligne de base, ajouter 25 uM de forskoline (5 pi de 10 uM stock en éthanol, dilué avec 100 pi de HBSS) aux cellules sans perturber la plaque et de surveiller les cellules pour un total de 30 min.
4. L'analyse des données
   Remarque: Utilisez le module ratiométrique de calcul pour l'analyse des données.
   1. Cliquez sur l'outil de sélection sur le côté gauche de la fenêtre d'image et choisissez un rectangle solide à partir du menu déroulant. Faites glisser le rectangle sur le champ de l'image dans une zone exempte de cellules et cliquez droit sur elle pour la définir comme fond dans le but de soustraction de fond.
   2. Accédez au masque et utiliser «créer un nouveau masque 'option. Aller à l'outil de sélection et de choisir un stylo dans le menu déroulant pour dessiner manuellement un masque autour de la cellule pour la sélectionner pour une mesure. Sélectionnez au moins 4-6 cellules par condition.
   3. Sélectionnez l'onglet Masque et effectuer des statistiques de masque.
   4. Vérifiez 'masque entier', l'option cross-canal et sélectionnez donneur FRET normalisée (N-FRET) (FRET / CFP) élargir. La valeur de N-FRET est représentatif de l'activité PKA dans la membrane plasmique.
   5. Ajouter horodatage, look-up table et barre d'échelle en utilisant les annotations.

Résultats

Pour étudier l'effet de MRP4 sur la migration des fibroblastes, nous avons utilisé un test de cicatrisation en utilisant la microscopie à haute teneur en ^14. Plaies précises ont été réalisées sur des monocouches confluentes de FAE soit isolées à partir MRP4 ^{- / -} ou MRP4 des souris ^{+ / +,} et les images ont été prises à des intervalles de 1 h à 24 h. Nous avons observé un taux de migration plus élevé pour MRP4 <...

Discussion

La migration cellulaire est un processus complexe qui joue un rôle indispensable dans de nombreux événements physiologiques importants, notamment la cicatrisation des plaies^1,2. Les migrations cellulaires aberrantes peuvent provoquer des événements catastrophiques, tels que des métastases tumorales et l’angiogenèse^24,25. Par conséquent, une régulation fine de la migration cellulaire est nécessaire pour maintenir un fonctionnement normal de l’organisme.

À l’aide de la micr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lipofectamine 2000	Invitrogen(Carlsbad, CA)  ;	11668-027
DMEM	Invitrogen (Carlsbad, Californie)  ;	11965-092
IncuCyte Zoom	Essen BioScience
96 puits IncuCyte Image-Lock microplaques  ;	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	L5288	Stock en DMSO
H-89	Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)	BML-EI196	Stock en
DMSO 35 mm Plats à fond de verre  ;	(MatTek Corporation ; Ashland, MA)	P35G-1.5-20-C  ;
Fibronectine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media	Invitrogen (Carlsbad, CA)  ;	31985-088
Système de microscopie FRET	Microscope inversé Olympus (IX51)
Caméra CCD  ;	Hamamatsu, Japon	ORCA285
Logiciel SlideBook 5.5	Innovation en imagerie intelligente (Denver, CO)
Logiciel d’analyse de parcours d’ingéniosité	IPA, QIAGEN Redwood City,Forskolin
	Tocris (Ellisville, MO).  ;	1099	Stock en 100 % EtOH
DMEM F-12  ;   ;	Invitrogen (Carlsbad, CA)  ;	11330-057
HBSS	Invitrogen (Carlsbad, Californie)  ;	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen(Carlsbad, CA)  ;	10010-023
Solution de trypsine/EDTA (TE)	Invitrogen (Carlsbad, CA)  ;	R-001-100
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen (Carlsbad, CA)  ;	Référence 15140-122