Développement d'un In vitro Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

Summary

Ici, nous décrivons le développement et l’application d’un test de contraction de gel pour évaluer la fonction contractile dans les cellules mésenchymateuses qui ont subi une transition épithéliale-mésenchymateuse.

Abstract

La fibrose est souvent impliquée dans la pathogenèse de diverses maladies chroniques progressives telles que la bronchopneumopathie interstitielle. La caractéristique pathologique est la formation de foyers fibroblastiques, qui est associée à la gravité de la maladie. Il est proposé que les cellules mésenchymateuses constituées des foyers fibroblastiques proviennent de plusieurs sources cellulaires, y compris des fibroblastes intrapulmonaires résidents à l’origine et des fibrocytes circulants de la moelle osseuse. Récemment, les cellules mésenchymateuses qui ont subi une transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) ont également été supposées contribuer à la pathogenèse de la fibrose. De plus, l’EMT peut être induite par la transformation du facteur de croissance β, et l’EMT peut être renforcée par des cytokines pro-inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale α. Le test de contraction du gel est un modèle in vitro idéal pour l’évaluation de la contractilité, qui est l’une des fonctions caractéristiques des fibroblastes et contribue à la réparation des plaies et à la fibrose. Ici, la mise au point d’un test de contraction du gel est démontrée pour évaluer la capacité contractile des cellules mésenchymateuses qui ont subi une EMT.

Introduction

La fibrose est impliquée dans la pathogenèse de diverses maladies chroniques évolutives telles que la maladie pulmonaire interstitielle, la fibrose cardiaque, la cirrhose du foie, une insuffisance rénale terminale, la sclérose systémique, la maladie auto - immune et ^1. Parmi les maladies pulmonaires interstitielles, fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie chronique progressive et montre un mauvais pronostic. caractéristique pathologique du IPF est le développement de foyers fibroblastique constitué par les fibroblastes et les myofibroblastes activés qui sont associées au pronostic. Les origines de ces fibroblastes pulmonaires sont proposés po....

Protocol

1. Préparations et culture de cellules épithéliales du poumon

1. les cellules épithéliales de poumon humain de la culture A549 (lignée de cellules adhérentes) dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 100 UI / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
2. Retirer et jeter les milieux de culture cellulaire à partir de la boîte de culture, et laver une fois avec 5 - 10 ml de tampon phosphate salin (PBS). Après le lavage, aspirer immédiatement le PBS.
3. Ajouter 2 ml de Trypsine / acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,05%) et on incube à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendan....

Results

Au cours de l' EMT, les cellules épithéliales perdent marqueurs épithéliaux, tels que la E-cadhérine et le gain de l'expression des marqueurs de mésenchymateuses, comme la vimentine et α-actine du muscle lisse ^4,5. L'incubation des cellules épithéliales du poumon A549 humain avec du TGF-β1 et de TNF-α induit EMT. L'apparition de cellules A549 normales sont en pierre de galets comme la forme et la forme de triangle qui est une caractéristique des cellules épithéliales (.......

Discussion

Le protocole mis au point dans la présente étude comprend deux étapes. La première étape est réalisée pour induire EMT, tandis que la deuxième étape est l'essai de contraction du gel. Comme il est important de confirmer que les cellules ont subi EMT, l'étape 2 fournit un excellent complément aux changements d'expression morphologiques et génétiques. Des études antérieures ont montré que des cellules EMT A549 a été induite par le TGF-β1 seulement ^24; Cependant, comme nous l' avons signalé précé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	Pour A549 moyen
FBS	GIBCO	10437
Facteur de croissance transformant-&beta ; 1, Humain, recombinant	Wako Produits chimiques de laboratoire	209-16544
TNF-&alpha humain recombinant ;	R& D systems	210-TA/CF
E-Cadhérine (24E10) Technologie	de signalisation cellulaire	#3195	Dilution 1:3 000
Vimentine (D21H3) Technologie	de signalisation cellulaire	#5741	Dilution 1:3 000
Anti-&alpha ;-Tubuline	anticorps sigma aldrich	T9026	dilution 1:10 000
Anti-actine monoclonale, &alpha ;-Anticorps musculaire lisse& nbsp ;	sigma aldrich	A5228	dilution 1:10 000
Anticorps anti-N-cadhérine	BD Transduction Laboratories	#610920	dilution 1:1 000
IgG anti-souris, HRP-Linked Whole Ab Sheep (anticorps secondaire)	GE Healthcare	NA931-100UL	dilution 1:20 000
Anti-Rabbit IgG, HRP Linked Whole Ab Donkey (anticorps secondaire)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20 000 dilution
Réactif bloquant	GE Healthcare	RPN418	2 % dans TBS-T
6 puits Transparent Fond plat TC-Treated TC-Cell Culture Plate Plate Plaque de culture cellulaire, avec couvercle	corning	#353046
100 mm Boîte de culture cellulaire	TPP	#93100
DMEM,	technologies de vie	en poudre 12100-046	Pour 4× ; DMEM
Gel de collagène de type 1	Gélatine Nitta	Cellmatrix type I-A
Plaque de culture cellulaire à 24 puits	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Système de documentation sur gel  ;	ATTO	AE-6911FXN	Imageur gel
Logiciel d’analyse de gel	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	logiciel d’analyse fourni avec AE-6911FXN
Trypsine-EDTA (0,05	technologies de vie	25300054
24 plaques de puits, non traitées	IWAKI	1820-024
Solution de bleu de trypan, 0,4	technologies de vie	15250-061
Kit d’extraction d’ARN	Qiagen	74106
Transcriptase inverse	life technologies	18080044
Système de PCR en temps réel	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green Kit PCR	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
Membrane	PVDFATTO	2392390
Kit de dosage des protéines	bio-rad	5000006JA
Gel de polyacrylamide	ATTO	2331810
Réactif de détection Western blot	GE Healthcare	RPN2232
Caméra CCD froide	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Inhibiteur de la trypsine	sigma aldrich	T9003-100MG
Polyoxyéthylène (20)Monolaurate de sorbitan	Wako Produits chimiques de laboratoire	163-11512
Polyoxyéthylène (9) octyiphényléther	Wako Produits chimiques de laboratoire	141-08321