Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l'acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Summary

Dans ce travail, nous fournissons un flux de travail expérimental sur la façon dont les amplificateurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement.

Abstract

Le développement embryonnaire est un processus en plusieurs étapes impliquant l'activation et la répression de nombreux gènes. Des éléments amplificateurs dans le génome sont connues pour contribuer à un tissu et un type de cellule spécifique régulation de l'expression génique au cours de la différenciation cellulaire. Ainsi, leur identification et une enquête plus approfondie est important afin de comprendre comment le destin cellulaire est déterminée. L' intégration des données de gènes d'expression (par exemple, microarray ou ARN-Seq) et les résultats de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) à base d' études de l' ensemble du génome (ChIP-seq) permet l' identification à grande échelle de ces régions régulatrices. Cependant, la validation fonctionnelle d'amplificateurs spécifiques du type cellulaire doit être examinée in vitro et dans des procédures expérimentales in vivo. Nous décrivons ici comment exhausteurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement. Ce protocole fournit un flux de travail, étape par étape, qui comprend: 1) l'identification des régions régulatrices par l'analyse, 2) le clonage et exper données ChIP-seqvalidation imental du potentiel réglementaire putatif des séquences génomiques identifiées dans un dosage de rapporteur, et 3) la détermination de l' activité d'activateur in vivo par la mesure du niveau de la transcription de l' ARN d'activateur. Le protocole présenté est suffisamment détaillée pour aider quelqu'un à mettre en place ce flux de travail dans le laboratoire. Surtout, le protocole peut être facilement adapté et utilisé dans un système de modèle cellulaire.

Introduction

Le développement d’un organisme multicellulaire nécessite l’expression précisément régulée de milliers de gènes dans les tissus en développement. La régulation de l’expression des gènes est accomplie en grande partie par des amplificateurs. Les amplificateurs sont de courts éléments d’ADN non codants qui peuvent être liés à des facteurs de transcription (TF) et agir à distance pour activer la transcription d’un gène cible¹. Les amplificateurs sont généralement cis et se trouvent le plus souvent juste en amont du site de début de transcription (TSS), mais des études récentes ont également décrit des exemples où des amplificateurs ont été trouvés beaucoup plus en amont, sur les 3' du gène ou même dans les introns et les exons².

Il existe des centaines de milliers d’amplificateurs potentiels dans les génomes des vertébrés¹. Des méthodes récentes basées sur l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) fournissent des données à haut débit de l’ensemble du génome qui peuvent être utilisées pour l’analyse des amplificateurs^3-9. Bien que les données obtenues par les expériences ChIP-seq augmentent considérablement la probabilité d’identifier des amplificateurs spécifiques aux cellules et aux tissus, il est important de garder à l’esprit que les sites de liaison détectés n’identifient pas nécessairement la liaison directe à l’ADN et/ou les amplificateurs fonctionnels. Par conséquent, une analyse fonctionnelle plus poussée des amplificateurs nouvellement identifiés est indispensable. Dans ce travail, nous présentons un processus de base en trois étapes d’identification et de validation des amplificateurs actifs présumés. Cela comprend : 1) la sélection de sites de liaison présumés du facteur de transcription par l’analyse bio-informatique des données ChIP-seq, 2) le clonage et la validation de ces séquences régulatrices dans les constructions rapporteures, et 3) la mesure de l’ARN amplificateur (eRNA).

L’exposition des cellules souches embryonnaires (ES) à l’acide rétinoïque (RA) est fréquemment utilisée pour favoriser la différenciation neurale des cellules pluripotentes ¹⁰. La PR exerce ses effets en se liant aux récepteurs de la PR (RARα, β, γ) et aux récepteurs X des rétinoïdes (RXRα, β, γ). Les RAR et les RXR sous une forme d’hétérodimère se lient à des motifs d’ADN appelés éléments de réponse à l’AR, qui sont généralement organisés comme des répétitions directes de la séquence AGGTCA (appelée demi-site) et régulent la transcription. Des expériences de traitement par ligands ont permis d’identifier plusieurs gènes régulés par l’acide rétinoïque dans les cellules ES ^11,12. Cependant, les éléments amplificateurs de bon nombre de ces gènes n’ont pas encore été décrits. Pour démontrer comment le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour l’identification et la validation des amplificateurs, nous montrons étape par étape la sélection et la caractérisation de deux amplificateurs dépendants de l’acide rétinoïque dans les cellules souches embryonnaires.

Protocol

1. Enhancer Sélection basée sur l'analyse de Chip-seq

1. Télécharger le fichier fastq de données brutes RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) de http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
2. Télécharger et extraire le fichier d'index BWA requis pour l'alignement (dans notre cas: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   NOTE: Visite https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts pour plus d'informations sur les étapes de l'analyse bioinformatique et pour télécharger les scripts utilisés ci-dessous.
3. Alignez le fichier exemple de fastq au génome de mm10 (utiliser le script: perform_alignment.sh). Cela va créer un dossier avec un fichier .bam et les statistiques de l'alignement. RXR données ChIP-seq alignés (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), et le fichier d'index correspondant (.bai) sont disponibles ici:
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   NOTE: BWA est un logiciel qui aligne relaséquences relativement courtes (par exemple, les résultats de ChIP-seq) à une base de données de séquence, tels que le génome de référence de la souris (par exemple, mm10) ^13.
4. Exécutez le script (callpeaks.sh) pour le pic appelant et de novo analyse de motif. Utilisez le fichier .bam comme entrée. Le script est basé sur Homer findPeaks ^14.
   REMARQUE: Les fichiers de sortie nous donnent des informations sur le nombre total de pics, l' enrichissement des motifs, le pourcentage de l'arrière - plan, et les séquences cibles avec des motifs, etc. (Figure 1). Typiquement plusieurs motifs sont énumérés dans l'ordre de leur importance.
5. Remappez le # 1 motif classé (NR demi `AGGTCA`) (utiliser le script: remap_motif.sh)
   NOTE: Comme résultat, le script génère un fichier .bed qui montrera que CHIP-pics couvrent des régions génomiques qui contiennent le site de liaison canonique du facteur de transcription d'intérêt.
6. Télécharger et visualiser les résultats du RXR lit ChIP-seq alignés (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (également télécharger le .bai)) et les occurrences AGGTCA motifs (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) par intégratif de génomique Viewer (IGV) ¹⁵ pour identifier les RAR putative / sites de liaison RXR (figure 2 et figure 3).
   NOTE: L' intégration des différentes données ChIP-seq permettra de prédire avec précision plus de bons activateurs candidats ^16,17. Des études récentes ont révélé que des amplificateurs actifs sont généralement enrichis en P300 et sont en corrélation avec H3K4me1 et H3K27ac, et sont situées dans des régions de chromatine ouvertes, affichant ainsi DNase I hypersensibilité est également recommandée ^18-21.
7. Utilisez la "Définir une région d'intérêt" dans IGV ¹⁵ pour obtenir 200-400 séquence de pb de la région génomique sélectionnée et utiliser ces séquences pour la conception d'amorces ultérieures.

2. Reporter Assay

NOTE: Le système luciférine / luciférase est utilisécomme un essai rapporteur très sensible pour la régulation transcriptionnelle. En fonction de l'activité de l'activateur de cet enzyme luciférase est produite qui va catalyser l'oxydation de la luciférine à l'oxyluciférine entraînant bioluminescense, qui peut être détectée. Dans un premier temps, des séquences amplificatrices putatives identifiées devraient être sous - clonés dans un vecteur rapporteur (par exemple, TK-luciférase ^22, pGL3 ou NanoLuc).

1. Conception Primer
   1. Amorces Conception PCR pour l' amplification de 200-400 pb de régions amplificatrices putatives par Primer3 (disponible ici: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³
   2. Copiez-collez la séquence génomique de IGV qui comprend le site de liaison putatif en Primer3 (voir étape 1.7). Set gamme de taille de produit à 250-300 pb Primer3.
   3. Valider les amorces de PCR en utilisant le navigateur UCSC Genome est in silico outil PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) ²⁴
      NOTE: Ce protocole dans une étape ultérieure utilise HindIIrestriction I et BamHI enzymes pour le clonage. Vérifier si la séquence amplifiée par PCR , comme prévu par l'outil de PCR UCSC in silico contiendront des sites de restriction ou AAGCTT GGATCC (par exemple http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
   4. Obtenir les amorces nécessaires à partir d'un fournisseur commercial.
2. Amplification PCR de Enhancer séquence d'ADN génomique
   1. Purifier l' ADN génomique modèle à partir de cellules primaires (par exemple, les fibroblastes embryonnaires primaires). Utilisez kit commercial pour ADNg isolement et suivre les instructions du fabricant.
      NOTE: La haute qualité de ADNg est essentiel pour l'amplification de la PCR réussie. Les clones BAC appropriés peuvent être utilisés si la PCR est pas facile de ADNg.
   2. Préparer réaction de PCR de 50 pi contenant 100 ng d' ADNg, 5 pi de 10 x tampon, 3 ul _MgSO4 (25 mM), 5 pi de dNTP (2 mM chacun), 1,5 ul Fwd amorce (10 pM), 1,5 pi de Rev amorce (10 pM) , 1 ul d'ADN polymerase
      NOTE: Utilisez haute fidélité ADN polymérase avec un faible taux d'erreur pour les réactions PCR.
   3. Définir le cycle de PCR (2 minutes 95 ° C (20 sec 95 ° C, 10 secondes 58-65 ° C, 18 sec à 70 ° C) répéter les opérations x25, 2 min 70 ° C, toujours à 4 ° C). Régler la température de recuit de l'examen de l'amorce de valeurs prédites Tm.
   4. Purifier le produit PCR avec un kit de purification PCR commerciale et suivez les instructions du fabricant.
   5. Introduire les sites de restriction pour le clonage en répétant la PCR avec des amorces tel qu'il est utilisé ci - dessus, mais en y ajoutant des surplombs sur leurs extrémités 5 '(par exemple Fwd: 5'-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (Hind III), Rev: 5'-GGATCC TATA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(Bam HI)).
   6. Exécutez 5 ul du produit de PCR sur gel d'agarose pour vérifier les produits de PCR non spécifiques.
      NOTE: Si plusieurs bandes sont détectées, exécutez le produit PCR entier et purifier la bande appropriée par un kit d'extraction de gel commercial.
3. Restriction
   NOTE: Pour cloner insert en amont du promoteur TK ²² le produit purifié PCR et le vecteur (par exemple, TK-Luc) devrait être digéré par HindIII et BamHI.
   1. Préparer un mélange réactionnel de 50 pi contenant 1 ug produit a été purifié par PCR, 1 pl de HindIII (20 U / pl), 1 ul de BamHI (20 U / pl) et 5 pi de tampon 10x.
   2. Préparer un vecteur contenant 250 mélange réactionnel pl de 5 pg (TK Luc ou vecteur rapporteur alternatif), 5 ul Hind III (20 U / pl), 5 ul de BamHI (20 U / pl), 5 ul thermosensibles Phosphatase alcaline (1 U / pl) et 25 ul de 10 x tampon.
      REMARQUE: le traitement AP du vecteur diminue fortement l'auto-ligature du seul vecteur digéré et donc l'arrière-plan.
   3. Incuber les mélanges réactionnels pendant 4 heures à 37 ° C, puis on purifie les produits de PCR digérés et le vecteur avec un kit de purification PCR commerciale.
4. Ligation
   1. Mettre en place la réaction de ligature dans des tubes de PCR comprenant 2 pl 10x T4 tampon de ligase d'ADN, 10 ng TK-Luc vecteur, insérer 50 ng (produit de PCR digéré), 1 ul d'ADN ligase de T4 (400 U / pl) et sans nucléases eau jusqu'à 20 ul.
      NOTE: Préparer un contrôle négatif où la réaction ne contient pas insert.
   2. Mélanger délicatement la réaction par pipetage de haut en bas, centrifuger brièvement les tubes de PCR en utilisant un mini-centrifugeuse puis incuber à température ambiante pendant 10 min.
   3. Heat inactiver à 65 ° C pendant 10 minutes puis refroidir sur la glace et utiliser 5 pi du produit de transformation dans 50 ul de cellules compétentes (par exemple, DH5a).
   4. Utilisez la procédure de choc thermique standard pour transformer des bactéries, ramasser des colonies et isoler l'ADN plasmidique avec un kit commercial. Validez toutes les constructions par séquençage avant les prochaines étapes.
5. La transfection de cellules ES
   1. Utiliser des plaques à 48 puits. Ajouter 200 ul de 0,1% de gélatine solutions / puits 30 min avant le placage des cellules.
   2. Plate souches embryonnaires (ES) cellules par jour avant la transfection. Utiliser des cellules et la plaque ES libre nourricières à une densité de 3 x 10 ⁴ cellules par puits dans 250 ul ES médias / puits.
   3. Préparer les mélanges de plasmides (chaque mélange est calculé pour 8 puits, 4 non traité et 4 traités à l' acide rétinoïque) Mélanger 1:. 1.250 ng TK-Luc Empty (contrôle négatif), 950 ng β-galactosidase vecteur de codage (ßGal), Mix 2 : 1,250 ng TK-Luc HOXA1 enhancer (contrôle positif), 950 ng ßGal, Mix 3: 1,250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (région d'intérêt), 950 ng ßGal.
      NOTE: Les cellules ES expriment les facteurs de transcription souhaités (RAR / RXR). Laisser les puits non transfectées pour déterminer les valeurs de base plus tard au cours de la luciférase et de la β-galactosidase mesures.
   4. Ajouter des médias sériques réduits de qualité de transfection pour chaque plasmide mélanger jusqu'à 106 ul volume total (suffisant pour 8 puits).
   5. Ajouter 4,5 ul transfecter de qualité ESréactif ion, puis mélanger soigneusement par pipetage 15 fois haut et en bas. Laisser incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes à température ambiante.
   6. Ajouter 13 ul du mélange de transfection des cellules par puits, mélanger par pipetage. Placez les cellules de nouveau dans l'incubateur (37 ° C) O / N avant le traitement de ligand.
   7. Retirez le support avec soin par aspiration à partir de cellules et ajouter 250 ul frais media / puits contenant 0,01 - 1 uM all trans-acide rétinoïque (RA) que la concentration finale ou DMSO comme véhicule. Incuber les cellules pendant 24-48 h.
      NOTE: L'acide rétinoïque est sensible à la lumière.
6. Préparation des lysats cellulaires
   1. Diluer Lysis Buffer 5x (1,25 ml Tris 0,5 M pH = 7,8, 1 ml de 1 M de dithiothréitol (DTT) (dans H ₂ O), 10 ml d' EDTA 0,1 M pH = 8,0, 50 ml de glycerol, 5 ml de Triton X-100, stériles de l'eau jusqu'à 100 ml) à l'aide d'eau 1x stérile, ajouter 20 ul de DTT 1 M / 10 ml et équilibrer à la température ambiante avant utilisation. Préparer 10 ml pour une plaque à 48 puits le jour du dosage.
   2. Retirez le support avec soin par aspiration à partir de cellules. Rincer les cellules une fois avec PBS 1x. Ajouter 200 ul de 1 x tampon de lyse / puits directement aux cellules.
   3. Agiter pendant 2 h à RT (lyse chimique). Congeler les lysats cellulaires sur la plaque à -80 ° C (lyse mécanique). Les lysats peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs jours.
   4. Décongeler les lysats. Après décongélation complète, le transfert des lysats cellulaires à une plaque à 96 puits en utilisant une pipette électronique multicanaux. Transfert 80 pi du lysat cellulaire à plaque de 96 puits clair pour le dosage β-galactosidase et 40 pi de lysat cellulaire à une plaque blanche pour la mesure de la luciférase. Éviter la formation des bulles.
7. β-galactosidase Assay
   NOTE: galactosidase Beta ou deuxième journalistes alternatifs devraient être utilisés comme un contrôle interne pour tenir compte des variations expérimentales non spécifiques.
   1. Préparer un tampon de substrat β-galactosidase: 80,0 g Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O,3,8 g de NaH ₂ PO ₄ • H ₂ O, 30,0 g de KCl, 1,0 g MgSO ₄ • 7H ₂ O, font jusqu'à 1000 ml avec de l' eau stérile. Ajuster le pH à 7,4. Filtre Stériliser (0,2 micron) et conserver à 4 ° C
   2. Mélanger le tampon de substrat 1 ml de β-galactosidase avec 4 mg ONPG (o-nitrophényl-β-D-galactosidase). Ajouter 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (ßME) par 1 ml de tampon juste avant utilisation. Ajouter un tampon de substrat de β-galactosidase de 100 pi à 80 pi de lysat cellulaire.
   3. Incuber les réactions à 37 ° C jusqu'à ce qu'une couleur jaune pâle a développé. Lire l'absorbance à DO 420 nm sur un lecteur de plaque et d'exportation des données.
      REMARQUE: La durée varie en fonction de l'efficacité de transfection, généralement pas plus de 30 min.
8. luciférase Assay
   1. Préparer 50 ml luciférine réactif de substrat: 15,1 mg de sel de D-luciférine, 82,7 mg de sel ATP, 185 mg MgSO ₄ • 7H ₂ O, ajouter 50 ml Tube en polypropylène,puis ajouter 1,5 ml de tampon 1 M HEPES, 48,5 ml ATP eau libre, vortex, assurez-vous que tous les composés se dissolvent complètement. Gardez 5 - 10 ml aliquotes à -80 ° C.
   2. Chaud 5 ml substrat luciférine réactif à la température ambiante avant de commencer. Distribuer 100 ul substrat réactif pour chaque puits de la plaque blanche contenant les 40 pi de lysat cellulaire et de mesurer le signal immédiatement en utilisant un luminescent compteur machine.
   3. Obtenir des activités d'au moins trois expériences indépendantes dans des transfections en triple.
   4. Calculer d'abord l'activité de la luciférase normalisée de base et des valeurs normalisées β-galactosidase de base pour chaque puits en soustrayant les valeurs moyennes mesurées pour les cellules non transfectées provenant de chaque valeur mesurée. Calcule ensuite le rapport de l'activité luciférase / β-galactosidase.

3. Caractérisation de l'ARN Enhancer

REMARQUE: Un indicateur plus directe de l'activité d'activateur a émergé de la récente génome wétudes ide qui ont identifié de nombreux ARN non-codants courts, dont la taille varie de 50 à 2000 nt, qui sont transcrits à partir des amplificateurs, et sont appelés ARN enhancer (Ernas) ^16,25,26 (figure 4). erna induction est fortement corrélé à l'induction de gènes codant pour des exons adjacents. Ainsi, l' activité d'activateur dépendant du signal peut être quantifiée in vivo en comparant la production Erna entre les différentes conditions par RT-qPCR.

1. Lignes directrices pour la conception Primer pour la détection Erna par RT-qPCR
   1. Sélectionnez régions génomiques pour des mesures Erna qui sont au moins 1,5 à 2 kb loin des sites de début de transcription annotés.
      NOTE: Il est important, des niveaux élevés de transcription de l'ARNm dans exhausteurs intragéniques prévenir une quantification précise de Erna dans l'orientation sens, Ernas antisens à exhausteurs intragéniques sont détectables et sont semblables dans le niveau de Ernas à exhausteurs extragéniques.
   2. En règle générale, utiliser des régions 200 - 1000 pb from le centre du site d'intérêt pour la conception d'amorce soit sur ​​le sens ou brin antisens (figure 4 et figure 6) liant le facteur de transcription.
      NOTE: Si GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 ou données H3K27ac ChIP-seq sont disponibles à partir des types cellulaires souhaités et les conditions, il peut être utilisé pour la conception d'amorce plus précis. Ernas sont transcrits à partir de régions amplificatrices putatives caractérisées par des niveaux élevés de H3K4me1 et me3. L'expression de Ernas corrélation positive avec l'enrichissement de activé marque activateur de histone H3K27ac.
   3. Amorces Conception PCR pour base de colorant fluorescent mesure RT-qPCR de Ernas par Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³ Générer séquence anti-sens (complément du brin sens inverse) pour la conception d'amorce selon: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Insérez 2-300 pb de séquence sens ou anti-sens pour la conception d'amorce.
2. Mesure de Erna Transcription
   1. Isoler l'ARN total à partir de cellules traitées avec du phénol acide commercial / réactif d'extraction à base de chloroforme selon les recommandations du fabricant.
   2. Utilisez DNaseI pour traiter l'ARN isolé avant de les utiliser dans la réaction de transcription inverse. Inactiver DNase selon les recommandations du fabricant avant la transcription inverse.
   3. Mesurer la concentration d'ARN après traitement à la DNase I et utiliser 1000 ng par réaction RT. Utilisez inverse de haute qualité transcriptase.
      Remarque: Comme un grand nombre de Ernas ne peut pas être polyadénylé, la transcription inverse nécessite l'utilisation d'amorces aléatoires.
   4. Détecter une transcription inverse Erna par RT-qPCR en utilisant la procédure standard. Mesurer un ARNm non-traitement dépendant de la normalisation (par exemple, 36B4, PPIA, Gapdh, ACTB).

Results

Nous avons utilisé un anticorps RXR pan-spécifique afin d'identifier quels gènes RA réglementés de l'ensemble du génome ont l'enrichissement des récepteurs dans leur proximité. Analyse bio - informatique des données de RXR copeau suivants obtenus à partir de cellules ES traitées à l' acide rétinoïque a révélé l'enrichissement du demi - site du récepteur nucléaire (AGGTCA) sous le RXR sites occupés (figure 1). En utilisant un algorithme de bio - informatique , nous avons ...

Discussion

Ces dernières années, les progrès de la technologie de séquençage ont permis de prédire à grande échelle les amplificateurs dans de nombreux types de cellules et de tissus ^7-9. Le flux de travail décrit ci-dessus permet d’effectuer une caractérisation primaire des amplificateurs candidats choisis sur la base des données ChIP-seq. Les étapes détaillées et les notes aideront toute personne à mettre en place une validation d’amplificateur de routine en laboratoire.

L’étape la plus crit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD ADN polymérase	Merck Millipore	71085-3	pour l’amplification PCR de l’amplificateur à partir de l’ADNg
DNeasy Blood & Kit de mouchoirs  ;	Qiagen	69504	pour l’isolement de l’ADN génomique
QIAquick PCR Kit de purification	Qiagen	28106	pour la purification de produits PCR
Kit d’extraction de gel  ;	Qiagen	28706	pour l’extraction sur gel s’il y a plus de produit PCR
HindIII	NEB	R3104L	enzyme de restriction
BamHI	NEB	R3136L	FastAP
	Thermo Scientific	EF0651	libération de groupes 5'- et 3'-phosphate à partir de l’ADN
T4 ADN ligase	NEB	M0202	pour la ligature
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	pour l’isolement plasmidique
DMEM	Gibco	31966-021	ES media
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES media
MEM Non-Essential Amino Acid	Sigma	M7145	ES media
Pénicilline-Streptomycine	Sigma	P4333	ES media
Beta Mercaptoethanol	Sigma	M6250	ES media
FuGENE HD  ;	Promega	E2311	réactif de transfection
Opti-MEM® ; I Sérum réduit à	durée de vie moyenne Technologies	31985-062	pour la transfection
Sigma	R2625	l’acide rétinoïque tout-trans	, pour l’activation de RAR/RXR
à plaque transparente à 96 puits	Greiner	655101	pour le dosage de la bêta-galactosidase
Plaque blanche à 96 puits	Greiner	655075	pour le dosage de la luciférase
D-luciférine, sel de potassium	Goldbio.com	115144-35-9	luciférase ATP
sel	Sigma	A7699-1G	pour le dosage de la luciférase
MgSO4• ; 7H2O	Sigma	230391-25G	pour le dosage de la luciférase
HEPES	Sigma	H3375-25G	pour le dosage de la luciférase
Na2HPO4 • ; 7H2O	Sigma	431478-50G	pour le dosage de la bêta-galactosidase
NaH2PO4 • ; H2O	Sigma	S9638-25G	pour le dosage de la bêta-galactosidase
MgSO4• ; 7H2O	Sigma	230391-25G	bêta-galactosidase
KCl	Sigma	P9541-500G	bêta-galactosidase
ONPG (o-nitrophényl-&beta ;-D-galactosidase)	Sigma	N1127-1G	pour le dosage de la bêta-galactosidase
TRIzol® ;	Life Technologies	15596-026	Isolement de l’ARN
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité Life Technologies		4368814	de la transcription inverse de l’ARNe
Dnase sans Rnase	Promega	M6101	Traitement de la dnase
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR
mastermix CFX384 Touch&trade ; Système de détection PCR en temps réel	Machine BioRad		qPCR
Lecteur de microplaques BioTek Synergy 4	Compteur luminescent BioTek