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Article de méthode

Génération des médias et applications Organ-conditionnés pour l'étude Influences spécifiques d'organes sur le cancer du sein métastatique Comportement

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DOI :

10.3791/54037

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13 juin 2016

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1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un système modèle ex vivo composé de milieux conditionnés par des organes dérivés des ganglions lymphatiques, des os, des poumons et du cerveau de souris. Ce système modèle peut être utilisé pour identifier et étudier les facteurs solubles dérivés d’organes et leurs effets sur le tropisme des organes et le comportement métastatique des cellules cancéreuses.

Résumé

Le cancer du sein métastase préférentiellement aux ganglions lymphatiques, aux os, aux poumons, au cerveau et au foie chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Les efforts de recherche antérieurs se sont concentrés sur l’identification des facteurs inhérents aux cellules cancéreuses du sein qui sont responsables de ce modèle métastatique observé (appelé tropisme d’organe), mais on en sait beaucoup moins sur les facteurs présents dans des organes spécifiques qui contribuent à ce processus. Cela est dû en partie à l’absence de systèmes modèles in vitro qui récapitulent avec précision le microenvironnement des organes. Pour y remédier, un système modèle ex vivo a été établi qui permet d’étudier les facteurs solubles présents dans différents microenvironnements d’organes. Ce modèle consiste à générer des milieux conditionnés à partir d’organes (ganglions lymphatiques, os, poumons et cerveau) isolés de souris nues athymiques normales. Le système modèle a été validé en démontrant que différentes lignées cellulaires de cancer du sein présentent un comportement malin spécifique à la lignée cellulaire et à l’organe en réponse à des milieux conditionnés par un organe qui correspond à leur potentiel métastatique in vivo. Ce système modèle peut être utilisé pour identifier et évaluer des facteurs solubles spécifiques dérivés d’organes qui peuvent jouer un rôle dans le comportement métastatique des cellules cancéreuses du sein et d’autres types de cellules cancéreuses, y compris les influences sur la croissance, la migration, le comportement de type souche et l’expression des gènes, ainsi que l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer. Il s’agit du premier système modèle ex vivo qui peut être utilisé pour étudier en détail le comportement métastatique spécifique à un organe et évaluer le rôle de facteurs solubles dérivés d’organes spécifiques dans le processus de métastases cancéreuses.

Introduction

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième principale cause de décès liés au cancer 1. taux de mortalité élevé de cancer du sein est principalement due à l'échec de la thérapie conventionnelle pour atténuer et éliminer la maladie métastatique; environ 90% des décès liés au cancer sont dus à des métastases 2. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la cascade métastatique est primordiale pour le développement de thérapies efficaces à la fois précoce et le cancer du sein à un stade avancé.

Des recherches antérieures ont permis d' élucider la nature multi - étapes des métastases du cancer du sein et il est émis l' hypothèse que le résultat à la fois la progression du cancer et des métastases dépend en grande partie des interactions entre les cellules cancéreuses et l'environnement hôte 3. Les observations cliniques indiquent que de nombreux cancers présentent un tropisme d'organe, ie., La tendance à métastaser préférentiellement à particulier organs.In le TASe de cancer du sein, la maladie d'un patient se propage habituellement ou des métastases à 5 sites principaux, y compris les os, les poumons, les ganglions lymphatiques, le foie et le cerveau 4-6. De nombreuses théories ont été développées pour expliquer ce processus, mais seulement quelques-uns ont résisté à l'épreuve du temps. La théorie de Ewing de métastases, proposée dans les années 1920, l'hypothèse quela distribution des métastases était strictement due à des facteurs mécaniques; dans lequel les cellules tumorales sont réalisées dans le corps par des schémas d'écoulement de sang physiologique normal défini et simplement arrêter dans le premier lit capillaire ils rencontrent 7. En revanche, 1889 "semences et le sol" hypothèse de Stephen Paget a suggéré que les interactions moléculaires supplémentaires étaient responsables de la survie et la croissance des métastases, de sorte que les cellules cancéreuses ( «graines») ne peuvent se mettre en place et microenvironnements d'organes proliferatein qui produisent des facteurs moléculaires appropriés ( «sol ») 8. Presque un siècle plus tard, Leonard Weiss sousa pris une méta-analyse des données d'autopsie publiés précédemment et confirmé la prédiction de Ewing que de nombreuses tumeurs métastatiques détectées au moment de l'autopsie ont été trouvés dans les proportions prévues qui seraient attendus si le tropisme d'organe métastatique a été déterminée par des modèles d'écoulement de sang seul. Cependant, dans manyinstances il y avait plus ou moins de métastases formées sur certains sites alors seraient attendus par des facteurs mécaniques proposées d'Ewing 9. Ces comptes et théories suggèrent que microenvironnements d'organes spécifiques jouent un rôle essentiel dans les modèles de diffusion et la croissance ultérieure et la survie de nombreux cancers, notamment le cancer du sein.

Les efforts de recherche antérieurs ont porté principalement sur ​​les facteurs dérivés de cellules tumorales et leur contribution à l'tropisme organe observé dans les métastases du cancer du sein 10-12, facteurs mais peu de recherches ont exploré dérivées du microenvironnement organe qui peuvent fournir un créneau favorable pour la mise en placedes métastases du cancer du sein. Cela est en grande partie attribuable aux difficultés techniques de l' étude des composants du microenvironnement d'organes in vitro.

Le présent article décrit un système ex vivo du modèle global pour étudier l'influence des composants solubles du ganglion lymphatique, des os, du poumon et du cerveau sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses du sein humain. Des études antérieures ont permis de valider ce système modèle en démontrant que les différentes lignées cellulaires de cancer du sein présentent un comportement malin spécifique organe spécifique lignée de cellules et en réponse aux moyens d'organes conditionné qui correspond à leur potentiel métastatique in vivo 13. Ce système de modèle peut être utilisé pour identifier et évaluer les facteurs solubles spécifiques organes dérivés qui peuvent jouer un rôle dans le comportement métastatique du sein et d'autres types de cellules cancéreuses, y compris les influences sur la croissance, la migration, la tige-comme le comportement, et l'expression des gènes, ainsi que l'identification dede nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer. Ceci est le premier ex vivo système modèle qui peut être utilisé pour étudier le comportement métastatique spécifique d'organe en détail et d'évaluer le rôle des facteurs solubles organes dérivés dans la conduite du processus de métastase du cancer.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux recommandations du Conseil canadien de protection des animaux, en vertu de protocoles approuvés par le Sous-comité des animaux Utiliser l'Université Western.

1. Isolement d'organes (poumon, cerveau, os, ganglions lymphatiques)

  1. Préparer quatre tubes de 50 ml stériles coniques (un pour chaque organe à isoler) contenant environ 30 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Pré-peser chaque tube de PBS en utilisant une balance électronique.
  2. Euthanasier 6-12 semaine vieille souris par inhalation de CO 2. Les souris doivent être laissés dans la chambre de CO 2 pendant environ 1 - 2 min ou jusqu'à ce que la souris cesse de bouger et de respirer. l'euthanasie réussie peut être confirmée par un manque de rythme cardiaque lors d'un contrôle manuellement à l'aide d'un doigt. Évitez la dislocation cervicale que cette méthode peut se rompre les vaisseaux sanguins du cou conduisant à des difficultés à retirer les ganglions lymphatiques axillaires.
    Remarque: Des travaux antérieurs ont spécifiquement utilisésouris nues femelles en bonne santé, Hsd: athymiques Nude- Foxn1 nu 13.
  3. Dans une hotte de culture de tissus stériles, placer la souris sur le dos sur un matelas en mousse de polystyrène, répartir les membres et utiliser des broches pour les maintenir en place.
  4. En utilisant des pinces et des ciseaux stériles, couper la peau abdominale à la ligne médiane au niveau des organes génitaux et couper vers le haut vers la bouche. Tirez doucement la peau abdominale des muscles abdominaux et la broche en place sur le coussin de mousse de polystyrène.
  5. Localisez le axillaire, brachial, et les ganglions lymphatiques inguinaux.
    Note: Les ganglions lymphatiques sont habituellement entourées par le tissu adipeux. Les ganglions inguinaux sont les plus faciles à trouver car ils se trouvent en surface à la jonction de deux vaisseaux sanguins sur la peau abdominale tiré vers l'arrière. ganglions axillaires et lymphatiques brachial sont situés plus profondément dans le tissu et nécessitent des manœuvres en douceur des tissus.
    1. Après avoir localisé les ganglions lymphatiques, utilisez les ciseaux pour couper doucement et soigneusement la lymphe pasdes de la peau, la graisse et les vaisseaux et les retirer de la souris. Pour confirmer la dissection correcte, rouler la pince sur le tissu enlevé. Si une boule dure existe en roulant la pince sur le tissu, puis un ganglion lymphatique a probablement été enlevé avec succès.
    2. Placez les ganglions lymphatiques prélevés dans le froid de la glace PBS.
  6. À l'aide des pinces et ciseaux, ouvrir la cavité abdominale en coupant à travers la paroi abdominale exposée dans un mouvement ascendant vers la poitrine. Découpez soigneusement à travers le sternum, l'exposition de la cavité thoracique.
  7. Localisez le diaphragme sous les poumons et couper le diaphragme. Il faut tirer vers les côtes en raison de la tension.
  8. Soulevez les poumons par le dessous et couper le tissu sous-jacent vers la trachée. Cela permet aux poumons d'être enlevés librement de la cavité thoracique. Retirez le cœur et les poumons en bloc et dans le froid de la glace PBS. Le cœur peut être retiré des poumons ici ou juste avant le pesage dans l'étape 2.
  9. Retirer leépingles, en gardant la souris en place sur le coussin de mousse de polystyrène. Retournez la souris et couper la peau du tout le chemin du bas du dos en face de flanc à flanc.
  10. En utilisant un morceau de gaze stérile pour maintenir le torse de la souris, peler la peau du dos de la souris sur les jambes et les pieds de la souris.
  11. En utilisant le même morceau de gaze stérile, tenir la jambe en place, soigneusement briser l'articulation de la cheville du pied de la souris et peler la peau sur l'articulation proximale vers l'articulation du genou.
  12. Avec des ciseaux, enlever le tibia libre de l'articulation du genou et dans le froid de la glace PBS.
  13. Répétez les étapes 1.11) à 1,12) avec membre opposé.
  14. En utilisant des pinces, maintenez le fémur en place, couper entourant le tissu musculaire à l'aide des ciseaux et enlever le fémur, le plaçant dans du PBS glacé.
  15. Répétez l'étape 1.14) avec membre opposé.
  16. L'utilisation d'un nouveau morceau de gaze stérile, maintenir la tête de la souris en place. En utilisant des pinces et ciseaux, retirez délicatement la peau pour exposer les skull. Avec des ciseaux, découpez soigneusement le crâne occipitale du centre haut en ligne droite et vers le bas pour exposer le cerveau postérieur.
  17. En utilisant des pinces, scoop sous le cerveau vers l'antérieur et retirer l'ensemble du cerveau. Placez le cerveau dans le froid de la glace PBS.
  18. Répéter les étapes 1.1) à 1,17) pendant au moins quatre souris.

2. Organe de pesée

  1. Après l'isolement d'organes, peser chaque tube PBS contenant du poumon et les tissus du cerveau en utilisant une balance électronique.
  2. Calculer la différence de poids en soustrayant le poids de pré-isolement (PBS uniquement) à partir du poids du tube PBS + organes (poumon et cerveau).
  3. Déterminer la quantité de support nécessaire pour remettre en suspension des fragments de tissus provenant de la différence de poids calculée.
    Note: Lung et les tissus du cerveau sont le poids normalisé par resuspension dans un 4: 1 des médias: rapport de tissu (vol / poids).

3. Génération de médias Lung- et conditionné Un cerveau

  1. Dans un t stérilequestion culture capot, inverser les tubes PBS contenant du poumon ou du cerveau trois fois pour éliminer le sang résiduel à partir d'organes et Aspirer PBS contenant du sang. Répéter avec le froid PBS frais jusqu'à ce que la solution semble claire avec aucune preuve de sang.
  2. Placez les poumons et le cerveau de 60 mm 2 boîtes de Pétri en verre séparés. L' utilisation de deux lames de scalpel stériles, les poumons émincer ou cerveaux par tranchage à plusieurs reprises avant et en arrière jusqu'à ce que des fragments de tissus sont d' environ ~ 1 mm 3 dans la taille.
  3. des fragments de tissus Remettre en suspension dans un volume approprié (déterminé précédemment à l'étape 2.3) de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM): milieu F12 supplémenté avec 1x concentré complément mitogene et de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml).
  4. Ajouter des fragments de poumon ou de tissus du cerveau remis en suspension pour un puits d'une plaque à 6 puits.
  5. Incuber les fragments de tissus dans un milieu pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Après incubation, collecter des milieux conditionnés pour chaque tissu et futres dilué en ajoutant trois volumes équivalents de milieu frais dans un tube conique de 50 ml.
  6. Centrifuger à 1000 xg dans un milieu conditionné dilué pour chaque organe à 4 ° C pendant 15 min pour éliminer les gros débris de tissu. Recueillir surnageant des médias et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 um.
  7. Piscine climatisée médias de chaque organe (ie., Du poumon avec des poumons et du cerveau avec le cerveau) de souris multiples pour tenir compte de la variabilité souris à la souris. Aliquoter et stocker milieux conditionnés à -80 ° C jusqu'à utilisation.

4. Génération des médias Bone Marrow conditionné

  1. Dans une culture de tissu hotte stérile, couper l'excès de tissu de l'os et retirer épiphyses (pièces d'extrémité) des os avec des ciseaux.
  2. L'utilisation d'un 27 ½ aiguille G, cavité médullaire au ras des os en poussant 1 ml de PBS à travers le centre de chaque os. Cela vous permettra de recueillir des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) dans un nouveau tube contenant du PBS.
  3. Centrifugeuse à 1,000 xg pendant 5 min à 4 ° C et laver BMSC deux fois avec PBS. Remettre en suspension les cellules stromales de la moelle osseuse dans 20 ml de milieu de croissance des cellules du stroma osseux (DMEM: F12 complémenté avec 1 x concentré mitogene supplément, de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml) et 10% de sérum de boven fœtal (FBS) ).
  4. Plaque de 10 ml de cellules stromales de moelle osseuse en suspension dans un flacon T75.
    Remarque: Combiner et cellules de la plaque de tous les 2 souris dans chaque flacon T75; pour quatre souris, deux flacons T75 sont nécessaires (environ 1 x 10 7 cellules / flacon).
  5. Incuber les cellules osseuses stromales de la moelle osseuse dans le stroma des milieux de croissance cellulaire pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Après incubation, retirer les supports des deux flacons T75 et de mettre dans le nouveau flacon T75, étiqueter ce flacon comme "Floater Flask". Ajouter un milieu de croissance de cellules fraîches de stroma os précédentes 2 flacons et incuber les 3 flacons à 37 ° C et 5% de CO 2.
  6. Après que les cellules atteignent environ 70% de confluence (environ 5-7jours) de cellules de passage. Pour ce faire, éliminer le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS (3 ml à chaque lavage). Retirer PBS et ajouter 3 ml d'une solution de trypsine / EDTA, en veillant à ce que la trypsine couvre toute la surface du flacon. Après que les cellules se soulèvent le ballon (~ 2 - 3 min), arrêtez trypsinisation réaction en ajoutant 3 ml d'os stromal milieux de croissance cellulaire). Centrifugeuse 900 g pendant 5 min à 4 ° C, jeter les médias, et remettre les cellules dans 10 ml de milieu de croissance de cellules fraîches stromale osseuse.
  7. Les cellules de la piscine de tous les flacons et passage 1: 5 en trois nouveaux flacons T75 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Après que les cellules une fois atteint à nouveau 70%, répétez l'étape 4.6 et de la piscine et de passage toutes les cellules adhérentes une seconde fois. Re-plaque toutes les cellules à quatre flacons T75 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. les milieux de croissance des cellules du stroma osseux doit être utilisé pour toutes les étapes.
  8. media F12 + 1x mitogène concentré su: Laisser les cellules atteignent la confluence, laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter os stromal collection media cellulaire (DMEMpplement + pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml); 10 ml / T75), en veillant à ce que ce média est libre de FBS. Collecter les médias de la moelle osseuse conditionné 72 heures plus tard, filtrer à travers un filtre de 0,22 um, piscine, aliquote, et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  9. Si l'on désire confirmer le phénotype des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) isolées en utilisant des anticorps contre la souris Sca-1, CD105, CD29, et CD73, CD44, en utilisant des techniques de cytométrie débit standard comme décrit précédemment 13.

5. Génération des médias ganglionnaire conditionné

  1. Dans une hotte de culture de tissus stériles, inverser le tube PBS contenant des ganglions lymphatiques trois fois pour éliminer le sang résiduel des ganglions lymphatiques et aspirée sanglante PBS. Répéter avec le froid PBS frais jusqu'à ce que la solution semble claire avec aucune preuve de sang.
  2. Placez les ganglions lymphatiques dans des boîtes de Pétri en verre de 60 mm 2. L'utilisation de deux lames de scalpel stériles, les ganglions lymphatiques hachis par tranchage à plusieurs reprises avant et en arrière jusqu'à ce tissufragments e sont d' environ 1 mm 3 dans la taille.
  3. Dans un tube conique, les fragments de tissu de remise en suspension dans 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) milieu supplémenté avec de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml), 5 x 10 -5 M β-mercaptoéthanol stérile ( 1,75 ul / 500 ml de milieu) et 10% de FBS.
  4. Centrifuger à 900 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension toutes les cellules dans 30 ml de milieu. Ajouter 5 ml de milieu / puits dans une plaque à 6 puits et incuber pendant 7 jours à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Après l'incubation de 7 jours, jeter les médias, laver les cellules adhérentes avec 5 ml PBS chaud et ajoutez 5 ml de milieu frais dans chaque puits. Permettre aux cellules de croître jusqu'à la confluence (environ 5 - 7 jours), trypsiniser, piscine toutes les cellules, et le passage comme décrit à l'étape 4.6. cellules Re-plaque à plaque de 6 puits. Répétez cette étape trois fois.
  6. Après trois passages, permettent aux cellules de croître jusqu'à la confluence, laver les puits trois fois avec du PBS et ajouter 2 ml / puits de DMEM: F12 + 1xSupplément concentré mitogene et de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml), en veillant à ce que ce support est dépourvu de FBS. Collecter les médias de nœuds lymphatiques conditionné après 72 heures, piscine, aliquote, et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  7. Si l'on désire confirmer le phénotype des cellules des ganglions lymphatiques de stroma isolées (LNSC) en utilisant des anticorps dirigés contre le CD45 et gp38 de souris, en utilisant des techniques de cytométrie en flux standards comme décrit précédemment 13.

6. Utilisation d'Organ conditionné médias pour dosages en aval liés à Métastases Comportement des cellules cancéreuses

  1. Une fois que les médias d'organes conditionné a été généré comme décrit dans les étapes 1 - 5, de l'utiliser pour effectuer différentes cellules en aval et des analyses de biologie moléculaire afin de déterminer l'influence des facteurs d'organes dérivés solubles sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses. Des exemples d'analyses classiques (décrits par ailleurs dans la littérature) comprennent des réseaux de protéines 13, les dosages de croissance cellulaire 13, la migration cellulaire Dosages 13, tumorsphere formation 14 et RT-PCR 15. Les milieux de base originaux utilisés pour générer les médias d'organe-conditionné (ie, DMEM inconditionnée:. F12 supplémenté avec 1x concentré supplément de mitogène et de la pénicilline (50 pg / ml) / streptomycine (50 pg / ml) doit être utilisé comme témoin négatif .

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Résultats

Génération des médias Organ-conditionné

Une vue d' ensemble diagramme / schématique du procédé d'isolement d'organes et de génération de milieu conditionné est présenté à la figure 1, avec des images photographiques représentatives de la procédure représentée sur la figure 2. Il convient de noter que , lorsque ce protocole a d' abord été en cours d' élabora...

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Discussion

Métastase est un processus complexe par lequel une série d'événements cellulaires sont ultimement responsables de l' invasion des tissus et de la tumeur lointaine création 4,30,31. L'ex vivo système de modèle présenté ici peut être utilisé pour étudier deux aspects importants de la progression métastatique: le cancer homing des cellules ou de migration à un organe spécifique ( "y arriver") et la croissance de cet organe ( «il y en croissance»). De nombreuses études ont déjà mis ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation canadienne du cancer du sein de la région de l’Ontario, de la Fondation canadienne pour l’innovation (n° 13199) et par l’intermédiaire de John et Donna Bristol par l’intermédiaire de la London Health Sciences Foundation (à A.L.A.). Le Programme de bourses d’études supérieures de l’Ontario (province de l’Ontario, G.M.P. et J.E.C.), le Programme de bourses d’études supérieures du Canada au niveau de la maîtrise (M.M.P.), le Programme de formation stratégique des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (M.M.P., G.M.P et J.E.C.) et l’Unité de recherche translationnelle sur le cancer du sein Pamela Greenaway-Kohlmeier du Programme régional de cancérologie de London (M.M.P., G.M.P., J.E.C. et Y.X.). A.L.A. est financée par une bourse de nouveau chercheur des IRSC et une bourse de nouveau chercheur du ministère de la Recherche et de l’Innovation de l’Ontario.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes coniques de 50 mlThermo Scientific (Nunc)339652Maintenir stérile
1x solution saline tamponnée au phosphateThermoFisher Scientific10010-023Garder stérile
Souris nuesHarlan LaboratoriesHsd :Athymic Nude-Foxn1nuUtiliser à l’âge de 6 à 12 semaines Tampon en mousse de
polystyrèneN/A/ALe couvercle mis au rebut (~ 4 x 8 pouces ou plus) d’un conteneur d’expédition en mousse de polystyrène peut être utilisé à cette fin. Stériliser en essuyant avec de l’éthanol.
PinceOutils pour les sciences fines11050-10Garder stériles
Ciseaux pour lessciences fines14058-11Garder stériles
Compresses de gazeFisher Scientific22-246069Garder stériles
60 mm2 boîtes de Pétri en verreSigma-AldrichCLS7016560Garder
stériles Lames de scalpelFisher ScientificS95937AGarder stérile
DMEM :F12Life Technologies21331-020Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation, maintenir stérile  ;
1x Mito + Serum ExtenderBD Biosciences355006Appelé « supplément de mitogène concentré » dans le manuscrit. Rester stérile
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)Life Technologies15140-122Garder stérile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)Life Technologies11875-093Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation, maintenir stérile  ;
Sérum fœtal bovinSigma-AldrichF1051-500MLMaintenir stérile
Solution de trypsine/EDTAThermoFisher ScientificR-001-100Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation, maintenir stérile  ;
Plaques de culture tissulaire à 6 puitsThermo Scientific (Nunc)140675Maintenir stérile
0,22 &mu ; Filtres à seringueSigma-AldrichZ359904Conserver stériles
les flacons de culture tissulaire T75Thermo Scientific (Nunc)178905Garder
stériles TranswellsSigma-AldrichCLS3464Conserver stérile, à utiliser pour les tests
de migration Anti-souris Sca-1R& D SystemsFAB1226Putilisation à 10 & micro ; l/106cellules
Anti-souris CD105R& D SystemsFAB1320Putilisation à 10 & micro ; l/106cellules
Anti-souris CD29R& D SystemsFAB2405P-025utilisation à 10 & micro ; l/106cellules
anti-souris CD73R& D SystemsFAB4488Putilisation chez 10 & micro ; l/106cellules
anti-souris CD44R& D SystemsMAB6127-SPutilisation à 0,25 & micro ; g/106 cellules
anti-souris CD45eBioscience11-0451-81utilisation à 5 µ ; l/106 cellules
Anti-souris gp38eBioscience12-5381-80utilisation à 10 µ ; L/106 cellules
&bêta ;-mercaptoéthanol  ;Sigma-AldrichM6250  ;Conserver stérile
Réseaux de protéinesRayBiotech Inc.AAM-BLM-1-2Utilisation d’une matrice par condition de support (y compris le contrôle négatif), en trois exemplaires
N

Références

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