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Article de méthode

Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

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DOI :

10.3791/54058

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7 avril 2016

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1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Un exemple de thérapie génique adénovirale dans les cornées cultivées d’organes diabétiques humains est présenté vers la normalisation du retard de cicatrisation des plaies et une expression nettement réduite des marqueurs des cellules souches épithéliales dans ces cornées. Il décrit également l’optimisation de ce processus dans les cultures épithéliales limbiques enrichies en cellules souches.

Résumé

L'objectif de ce protocole est de décrire les altérations moléculaires dans les cornées diabétiques humains et démontrer comment ils peuvent être atténués par la thérapie génique adénovirale dans cornées d'organes en culture. La maladie de la cornée diabétique est une complication du diabète avec des anomalies fréquentes des nerfs de la cornée et de la cicatrisation de l'épithélium. Nous avons également documenté l'expression modifiée de façon significative de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains. Pour pallier ces changements, la thérapie génique adénovirale a été réalisé avec succès en utilisant la régulation positive de c-met l'expression du proto-oncogène et / ou la régulation négative de la matrice de protéinases métalloprotéinase-10 (MMP-10) et de la cathepsine F. Cette thérapie a accéléré la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques même lorsque seul le compartiment des cellules souches limbiques a été transduite. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un traitement combiné. Pour la transplantation possible du patient des cellules souches normalisées, par exemple, est également présenté de l'optimizatisur la transduction de gènes dans des cultures enrichies de cellules souches en utilisant des amplificateurs polycationiques. Cette approche peut être utile non seulement pour les gènes sélectionnés, mais aussi pour les autres médiateurs de la cornée cicatrisation épithéliale et endiguer la fonction cellulaire.

Introduction

La maladie de la cornée diabétique résulte principalement dans l'épithélium dégénératif (kératopathie) et nerveux (neuropathie) changements. Il se manifeste souvent par les anomalies de la cicatrisation des plaies épithéliales et la cornée réduction du nerf 1-4. On estime que 60-70% des diabétiques ont divers problèmes de la cornée 1,3. Nos études ont identifié plusieurs protéines de marquage avec une expression altérée dans les cornées diabétiques humains , y compris la régulation négative de (récepteur du facteur de croissance des hépatocytes) proto-oncogène c-met et la régulation positive de la métalloprotéinase matricielle 10 (MMP-10) et de la cathepsine F 5, 6. nous avons aussi documenté diminué de manière significative l'expression de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains.

Dans les études précédentes, nous avons mis au point une thérapie génique à base adénovirale pour normaliser les niveaux des marqueurs du diabète altéré en utilisant le système humain diabétique de cornée de culture d'organe, ce qui montre une cicatrisation lente des plaies, diabétiquechangements de position, et la tige marqueur cellulaire réduction d'expression similaire aux ex vivo cornées 7,8. Cette persistance des variations semble être due à l'existence de la mémoire métabolique 9 épigénétique. Ce système de culture a été en outre utilisé pour la thérapie génique. Les objectifs de cette thérapie ont été choisis parmi les marqueurs avec soit une expression réduite dans les cornées diabétiques (c-met proto-oncogène), ou une augmentation de l' expression (MMP-10 et de la cathepsine F).

Le (AV) la thérapie adénovirale a été utilisé dans les cornées d'organes en culture entiers ou le compartiment limbique périphérique cornéo seulement. Ce compartiment abrite les cellules souches épithéliales qui renouvellent l'épithélium cornéen et participent activement à la cicatrisation des plaies 4,10-15. Ici, les protocoles sont prévus pour la culture normale de la cornée humaine diabétique organe, la cicatrisation des plaies epitheliales, l'isolement et la caractérisation des cultures cellulaires limbique enrichis en cellules souches et de cellules et la transduction adénovirale de la cornée. notreles résultats montrent la faisabilité de cette thérapie pour normaliser l'expression du marqueur et la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques pour une éventuelle transplantation future. Ils suggèrent également que la thérapie de combinaison est le moyen le plus efficace pour restaurer motif marqueur normal et la guérison épithéliales de la cornée diabétique 16-18.

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Protocole

Maladie national de recherches Interchange (NDRI, Philadelphie, PA) fourni post-mortem des yeux humains sains et diabétiques un consentement et cornées. protocole de collecte de tissus humains de NDRI est approuvé par le comité de gestion et sous réserve de National Institutes of Health contrôle. Cette recherche a été menée dans le cadre du Conseil approuvé Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review (CISR) protocole exempté EX-1055. La collaboration des chirurgiens ophtalmologistes, les Drs. E. Maguen et Y. Rabinowitz, fournis jantes cornéo défausse pour l'isolement des souches épithéliales cornéennes cultures enrichis en cellules. Cette recherche a été menée dans le cadre du protocole IRB approuvé Pro00019393.

1. Human cornéenne Organ Culture

Remarque: les cornées normales et diabétiques ou les yeux entiers sont reçus dans un milieu de stockage réfrigéré cornéenne (par exemple, Optisol GS) dans les 48 heures après la mort du fournisseur national NDRI.

  1. Retirez les cornées de conteneur de stockage avec des pinces et les laver deux fois in le mélange antibiotique-antimycosique (ABAM). En cas d'yeux entiers, couper les cornées sur des globes avec des ciseaux courbes. Laissez au moins un rebord conjonctivale de 5 mm et laver aussi les cornées en ABAM.
  2. Préparer le mélange pour être placé dans la concavité de la cornée. Il se compose d'un milieu sans sérum minimum essentiel (MEM) contenant ABAM, 1 mg / ml de veau peau collagène (fabriqué à partir d'une solution mère de 10 mg / ml dans de l'acide 0,1 N de acétique), 1% d'agar, et de l'insuline-transferrine-sélénite compléter 7.
  3. Micro-ondes de ce mélange à l'ébullition pour la stérilisation et la dissolution de gélose. Il peut prendre jusqu'à 1 min pour tout dissoudre. Laissez le bouchon du tube partiellement ouvert parce que le mélange déborde facilement quand il bout. Pour cette raison, plusieurs cycles d'ébullition peuvent être nécessaires pour chacun de 10 à 15 secondes. Refroidir le mélange à 37-39 ° C.
  4. Placez les cornées côté épithélial dans stériles 60 mm plats. Remplir la concavité de la cornée avec environ 0,5 ml du mélange décrit en 1.2. lemélange se solidifie sur les cornées dans les 2 min.
  5. Placez les cornées côté agar dans des boites stériles de 60 mm et d' ajouter le support complet contenant du MEM avec ABAM, et de l' insuline-transferrine-sélénite Supplément 7 (37 ° C) pour garder son niveau à peu près au limbe pour la culture de l' interface air-liquide. Le volume moyen est de 7-8 ml par boîte.
  6. Placez les plats avec les cornées dans un incubateur à CO 2 de 5% humidifié avec une casserole d'eau ( de cette façon, le niveau d'humidité est maintenu à ou au- dessus de 95%) à 35 ° C (température de la cornée normale). Ajouter 100 ul de milieu (deux gouttes) par jour sur l'épithélium pour humidifier les cornées.
  7. Surveiller la morphologie de la cornée et de la viabilité des cellules épithéliales au microscope sous lumière transmise au moyen d'un microscope standard avec un objectif 4X. Faites-le une fois par jour.
  8. Changer le milieu tous les trois jours. Les cornées peuvent être cultivées pendant au moins trois semaines. Pour les expériences de thérapie génique, les cornées culture pendant 3-5 jours, puis TRANSDUCe avec des gènes d'intérêt (4.1-4.4), laisser pendant 3-5 jours en fonction du transgène et sous réserve du protocole de cicatrisation (2.1-2.4).

2. La guérison des plaies épithéliales

Remarque: Dans les cornées diabétiques, le débridement épithélial par raclage mécanique est pas possible parce que la membrane basale épithéliale fragile est détaché dans le processus, ce qui ne se produit pas dans les cornées normales. Ainsi, pour conserver les cornées normales et diabétiques dans les mêmes conditions de cicatrisation de la plaie, l' enlèvement chimique de l'épithélium avec du n-heptanol est utilisé 19. Cette procédure supprime l'épithélium, mais laisse derrière une membrane basale intacte dans les deux cornées normales et diabétiques.

  1. Pour effectuer épithéliale centrale débridement 20, placer un disque de 5 mm de papier filtre trempé dans du n-heptanol sur la surface cornéenne centrale antérieure pendant 75 secondes.
  2. Retirer le filtre et laver les cornées en plein milieu. Remplir la concavité avec 0,5 ml d'agar-collagènele mélange et la culture comme dans 1.4. Après débridement, les cellules épithéliales meurent habituellement et dépouiller de laisser derrière la membrane basale microscopiquement intacte 7.
  3. Utiliser des disques de 8,5 mm pour créer des grandes plaies epitheliales dans les expériences avec seulement la thérapie génique limbique. Cela permettra d'assurer l'implication des cellules souches limbiques dans le processus de guérison.
  4. Surveiller microscopiquement la cicatrisation de la cornée. Faire des photos à 4X et 10X tous les jours jusqu'à ce que le défaut épithélial est complètement guérie. Le processus de guérison peut prendre de 2 à 15 jours en fonction de l'état (normal ou diabétique) et la taille de la plaie.
    Note: Pendant le processus de guérison, des cellules ressemblant à des araignées noires sont observées au niveau du plan focal haut. Ces cellules sont kératocytes stromales apoptotiques qui sont morts après le retrait de l' épithélium 4. La guérison est jugée complète lorsque ces cellules mortes sont envahies par l'épithélium de guérison et ne sont plus visibles (Figure 2, encadré).
  5. Après la guérisonachèvement, coupé les cornées dans la moitié, les intégrer dans le composé et le processus octobre pour immunofluorescence indirecte sur des coupes cryostat ou Western blots 16,21.

3. Isolement des cellules limbiques et entretien des souches de cultures de cellules enrichi

Note: Préparer la cellule primaire limbique épithéliale souches (LESC) cultures enrichies des jantes cornéo. Les jantes provenant de donneurs sains et mis au rebut après la transplantation de la cornée sont reçues des chirurgiens collaborateurs dans le support de stockage de la cornée standard (par exemple, Optisol). Dans le cas contraire, les cultures enrichies Lesc peuvent être obtenus à partir des rebords excisés de cornées entiers normaux et diabétiques ou des globes NDRI reçues dans le support de stockage de la cornée.

  1. Si les cornées ou globes entiers sont utilisés, d'abord isoler les zones limbiques. Pour ce faire, placez la cornée sur un plat en plastique stérile avec le côté épithélial et enlever la zone centrale avec un trépan de 9 mm (couteau circulaire de la cornée).Jeter cette partie centrale. Puis exciser la zone limbique en utilisant un 13 mm trépan et jeter la partie conjonctivale extérieure. Pour isoler les cellules utilisent la jante limbique bagel-like. Avant l'isolement cellulaire, éliminer les cellules endothéliales et les restes adhérents de l'iris de la face interne de la cornée en face de l'épithélium de surface avec un tampon de coton stérile.
  2. Isoler feuilles de cellules limbiques en utilisant un traitement dispase. Incuber chaque jante cornéosclérale avec 2,4 U / ml de dispase II à 1,5 milieu sans sérum ml kératinocytaire (KSFM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) à 37 ° C pendant 2 heures 22.
  3. soulager doucement la feuille de cellules épithéliales limbiques de la jante sous un microscope binoculaire stéréo avec une pince et dissocier les cellules dans 1 ml de trypsine à 0,25% - solution d'EDTA 0,02% pendant 30 min à température ambiante.
  4. Laver les cellules dans 10 ml de milieu (par exemple, Epilife) et un culot eux à 300 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à température ambiante.
  5. e Resuspendree cellules dans un milieu de culture: milieu avec du N2, B27 et les suppléments de croissance des kératinocytes humains et 10 ml de facteur de croissance épidermique / ng (EGF).
  6. Ensemencer les cellules à 3000-5000 cellules / ml dans des flacons ou des boîtes de 60 mm recouverts d'un mélange de protéines de la membrane basale humaine , y compris la fibronectine, collagène de type IV et la laminine (FCL), à 0,5 à 1 ug / cm2, dans la KSFM moyen.
  7. La culture des cellules dans un humidifiée CO 2 de l' incubateur (95% ou à une humidité élevée) à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils forment des monocouches confluentes complètement. Cela peut prendre 1-2 semaines.
    Remarque: confirmer régulièrement l'identité cellulaire par coloration immunocytochimique positive pour les marqueurs Lesc putatifs dont PAX6, la kératine (K) 14, K15, K17 et ΔNp63α. Les détails de coloration , y compris les anticorps primaires ont été publiés 8,16-18,22.
  8. Pour le passage des cellules confluentes, traitez-les avec une solution 1 ml de 0,05% de trypsine (1: 5 de dilution de la solution à 0,25%) pendant 10 min à 37 ° C. Ajouter 5 ml de soja trSolution d'inhibiteur de ypsin (10 mg / ml) dilué à 1: 4 dans un milieu et centrifuger les cellules comme au point 3.5.
  9. Laver le culot cellulaire dans 3 ml d'une solution d'inhibiteur de trypsine de soja dilué. Plaque les cellules sur LCM-couché (voir 3.7) des plats ou des diapositives de chambre de verre à 2 x 10 4 cellules / ml.

4. transduction adénovirale de cornées Organ-culture

Remarque: Les adénovirus recombinants (AV) comprennent AV-vecteur (pas de gène inséré), AV-ÉÉGC (avec le gène cadre de lecture ouvert c-met), AV-shM10 (avec shRNA à MMP-10), et AV-SHCF ( avec des shRNA de la cathepsine F). Ils sont E1 / E3-deleted type 5 AV exprimant des gènes sous le contrôle du promoteur majeur immédiat précoce du cytomégalovirus. Les virus AV-ÉÉGC sont générées en utilisant vecteur AV pAd / CMV / V5-DEST 16. Les virus AV-shRNA sont personnalisés générés par sous-clonage de séquences shRNA avec HH1 promoteur et la séquence d'étiquette GFP de iLenti-EGFP vecteur dans une réplication incompétent (-E1 / -E3) human type AV 5 du génome en utilisant Adeno-4 système d'expression 17.

  1. Transduire une cornée d'organes en culture de chaque paire avec AV-vecteur et une autre cornée, avec un AV expression des gènes modulant. Utilisez le AV-ÉÉGC à 0,8 à 1,25 x 10 8 unités (pfu) formant des plaques par la cornée dans un milieu de culture pendant 48 heures à 37 ° C en gardant les cornées sous la surface moyenne chacun dans un puits d'une plaque de 24 puits. Utilisez les virus AV-shRNA à 1-2 x 10 8 pfu par cornée.
  2. Utilisez les virus pour la transduction en plein milieu additionné de 75 pg / ml de citrate de sildénafil. Ce réactif active le transport caveolin facilitant l' absorption virale par les cellules épithéliales 21. En raison de la demi-vie courte de sildénafil dans des solutions aqueuses, ajoutez de nouveau le même montant au milieu 4-5 heures plus tard. Le traitement standard est pendant 48 heures.
  3. Transfert cornées à de nouveaux plats avec une spatule stérile bout rond et de la culture dans le milieu sans AV maintenir le niveau moyen au niveau du limbe. Après l'additional 4-8 jours à l'interface liquide-air, processus cornées AV-traitée pour diverses analyses ou tests pour la cicatrisation des plaies épithéliales (voir ci-dessus). humecter de façon routinière les cornées pendant la culture en ajoutant 100 ul de milieu (deux gouttes) au-dessus de la cornée.
  4. Pour la transduction des cellules limbiques seulement, incuber les virus avec les cornées à l'interface air-liquide avec un niveau moyen au niveau du limbe, afin d'éviter la transduction de l'épithélium central.

5. transduction adénovirale de cellules Cultured limbiques

  1. Maintenir les cultures LESC enrichies dans le milieu avec 10 ng / ml d' EGF (voir 3.5) sur la vaisselle en plastique revêtues du mélange FCL à 0,5 ug / cm2.
  2. Transduire des cellules en culture qui ont atteint 70-80% de confluence avec l'AV hébergeant le gène de la protéine fluorescente verte (GFP-AV) ou l'AV-brouillée shRNA-GFP dans une gamme de multiplicité d'infection (MOI: 1 à 300 pfu / cellule) dans le milieu avec 2 ng / ml d'EGF. Effectuer la transduction pendant 4 heures à 37 ° C dans un volume minimum (0,2 ml), suivie de 20 heures dans 0,5 ml de milieu. La cavéoline activateur du transport du sildénafil est pas nécessaire pour la transduction de la culture cellulaire.
  3. Utiliser l'un des réactifs suivants qui facilitent la liaison à la surface cellulaire AV pour améliorer l'efficacité de transduction AV: soit des polycations (1 pg / ml de poly-L-lysine ou de 5 ug / ml de polybrène) ou 6 ul / ml de réactif de transduction ( par exemple ViraDuctin) ou 20 ul / ml d' activateur de transduction (par exemple ibiBoost).
  4. Après avoir remplacé le milieu pour l'un sans l'AV, incuber les cellules en culture pendant 4 jours dans l'incubateur à CO2 humidifiée et à évaluer le niveau d'expression de la GFP en utilisant un microscope à fluorescence inversée.
  5. Utilisez le test de cicatrisation de zéro pour évaluer la migration des cellules dans les cultures AV-transduction. Cultiver les cellules dans les coulisses de la chambre multipuits. Faire les blessures dans une monocouche en grattant les cellules dans un mouvement linéaire droite avec une pi 200 pipointe pette. Après blessant, changer le milieu pour une fraîche pour éliminer les cellules individuelles.
  6. Photographier les blessures tous les jours avec un appareil photo numérique attaché à un microscope inversé à 4X grossissement. Enregistrer le moment où la guérison est complète (les bords de la plaie sont en contact le long de la totalité de la plaie).

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Résultats

Nous avons montré précédemment que , dans les cultures d'organe cornéen, les différences dans l'expression des marqueurs du diabète (par exemple, des protéines de membrane basale et l' intégrine α3β1) et la cicatrisation entre les cornées normales et diabétiques sont conservés. Ce système de culture a été soumis à la thérapie génique visant à normaliser les niveaux des marqueurs de diabète modifié, c-Met, MMP-10, et de la cathepsine F.

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Discussion

La cornée semble être un tissu idéal pour la thérapie génique en raison de son emplacement de surface où la livraison de gènes, ainsi que l'évaluation de l'efficacité et les effets secondaires, sont faciles. Toutefois, une traduction clinique de cette approche puissante est encore lente en raison de peu d' informations sur les causes génétiques des maladies de la cornée et les cibles de thérapie génique 24. Les complications diabétiques , y compris des modifications de la cornée peuvent être en gr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier.

Remerciements

Nous remercions le soutien financier du NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), de la subvention CTSI UL 1RR033176 (AVL) et des subventions du Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
support essentiel minimumThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS  ;Bausch & Lomb50006-OPT
ABAM mélange d’antibiotiques et d’antimycosiquesThermo Fisher Scientific15240062
collagène de peau de veau  ;Sigma-Aldrich  ;Gélose C9791
, qualité culture tissulaireSigma-Aldrich  ;A1296
n-heptanolSigma-Aldrich  ;72954-5ML-F
O.C.T. composé  ;VWR International25608-930
Dispase II  ;Roche Applied Science4942078001
milieu sans sérum de kératinocytes (KSFM)Thermo Fisher Scientific17005042
milieu EpiLife avec calciumThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 supplément moyen, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
supplément de milieu B27, 50xThermo Fisher Scientific17504-044
supplément de croissance de kératinocytes humains, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
trypsine 0,25 % - EDTA 0,02 % avec du rouge de phénolThermo Fisher Scientific25200056
trypsine 0,25 % avec du rouge de phénolThermo Fisher Scientific15050065
inhibiteur de la trypsine de soja  ;Sigma-Aldrich  ;T6414
sérum fœtal bovinThermo Fisher Scientific26140079
(ITS)Sigma-Aldrich  ;I3146-5ML
anticorps contre la kératine 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253
anticorps contre la kératine 15Santa Cruz Biotechnologysc-47697
anticorps contre la kératine 17Santa Cruz BiotechnologySC-58726
anticorps contre &Delta ; Np63&alpha ;Anticorps Santa Cruz Biotechnologysc-8609
contre PAX6BioLegendPRB-278P-100
anticorps contre nidogen-1R& D SystemsMAB2570
anticorps contre l’intégrine et l’alpha ; 3&bêta ; 1EMD MilliporeMAB1992
fibronectine humaineBD Biosciences354008
laminine humaineSigma-Aldrich  ;L4445
collagène humain de type IVSigma-Aldrich  ;C6745-1ML
Adénovirus exprimant MMP-10 shRNAAdénovirussur
exprimant la cathepsine F shRNBioSciencessur
exprimant shRNA brouillé et GFPCapital BioSciencesAdénovirus sur
exprimant c-metOriGene (plasmide)SC323278
adénovirus exprimant la GFPKeraFASTFVQ002
citrate de sildénafil, 25 mgPfizerde la pharmacie
facteur de croissance épidermique  ;Thermo Fisher ScientificPHG0311
poly-L-lysineSigma-Aldrich  ;P4707
polybrèneSigma-Aldrich  ;107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Allemagne50301
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Spatule à bout rond Corning  ;Dow Corning3005
60 mm Boîtes de PétriThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II lames de chambre multipuits  ;Sigma-AldrichC6807
200 &mu ; l pointes de pipetteBioexpressP-1233-200autres fournisseurs disponibles
microscope inversé  ;NikonDiaphotautres fournisseurs/modèles disponibles
Incubateur < COsub>2 humidifié  ;Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)autres fournisseurs/modèles disponibles
microscope fluorescentOlympus, JaponBX-40autres fournisseurs/modèles disponibles
Stéréomicroscope de dissectionLeica, AllemagneS4 Eautres fournisseurs/modèles disponibles
supplément d’insuline-transferrine-sélénite mesure Capital BioSciences Capital Adénovirus mesuremesure

Références

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