Un exemple de thérapie génique adénovirale dans les cornées cultivées d’organes diabétiques humains est présenté vers la normalisation du retard de cicatrisation des plaies et une expression nettement réduite des marqueurs des cellules souches épithéliales dans ces cornées. Il décrit également l’optimisation de ce processus dans les cultures épithéliales limbiques enrichies en cellules souches.
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Article de méthode
Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'objectif de ce protocole est de décrire les altérations moléculaires dans les cornées diabétiques humains et démontrer comment ils peuvent être atténués par la thérapie génique adénovirale dans cornées d'organes en culture. La maladie de la cornée diabétique est une complication du diabète avec des anomalies fréquentes des nerfs de la cornée et de la cicatrisation de l'épithélium. Nous avons également documenté l'expression modifiée de façon significative de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains. Pour pallier ces changements, la thérapie génique adénovirale a été réalisé avec succès en utilisant la régulation positive de c-met l'expression du proto-oncogène et / ou la régulation négative de la matrice de protéinases métalloprotéinase-10 (MMP-10) et de la cathepsine F. Cette thérapie a accéléré la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques même lorsque seul le compartiment des cellules souches limbiques a été transduite. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un traitement combiné. Pour la transplantation possible du patient des cellules souches normalisées, par exemple, est également présenté de l'optimizatisur la transduction de gènes dans des cultures enrichies de cellules souches en utilisant des amplificateurs polycationiques. Cette approche peut être utile non seulement pour les gènes sélectionnés, mais aussi pour les autres médiateurs de la cornée cicatrisation épithéliale et endiguer la fonction cellulaire.
Introduction
La maladie de la cornée diabétique résulte principalement dans l'épithélium dégénératif (kératopathie) et nerveux (neuropathie) changements. Il se manifeste souvent par les anomalies de la cicatrisation des plaies épithéliales et la cornée réduction du nerf 1-4. On estime que 60-70% des diabétiques ont divers problèmes de la cornée 1,3. Nos études ont identifié plusieurs protéines de marquage avec une expression altérée dans les cornées diabétiques humains , y compris la régulation négative de (récepteur du facteur de croissance des hépatocytes) proto-oncogène c-met et la régulation positive de la métalloprotéinase matricielle 10 (MMP-10) et....
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Protocole
Maladie national de recherches Interchange (NDRI, Philadelphie, PA) fourni post-mortem des yeux humains sains et diabétiques un consentement et cornées. protocole de collecte de tissus humains de NDRI est approuvé par le comité de gestion et sous réserve de National Institutes of Health contrôle. Cette recherche a été menée dans le cadre du Conseil approuvé Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review (CISR) protocole exempté EX-1055. La collaboration des chirurgiens ophtalmologistes, les Drs. E. Maguen et Y. Rabinowitz, fournis jantes cornéo défausse pour l'isolement des souches épithéliales cornéennes cultures enrichis en cellules. Cette recherche a été menée dans le cadre du p....
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Résultats
Nous avons montré précédemment que , dans les cultures d'organe cornéen, les différences dans l'expression des marqueurs du diabète (par exemple, des protéines de membrane basale et l' intégrine α3β1) et la cicatrisation entre les cornées normales et diabétiques sont conservés. Ce système de culture a été soumis à la thérapie génique visant à normaliser les niveaux des marqueurs de diabète modifié, c-Met, MMP-10, et de la cathepsine F.
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Discussion
La cornée semble être un tissu idéal pour la thérapie génique en raison de son emplacement de surface où la livraison de gènes, ainsi que l'évaluation de l'efficacité et les effets secondaires, sont faciles. Toutefois, une traduction clinique de cette approche puissante est encore lente en raison de peu d' informations sur les causes génétiques des maladies de la cornée et les cibles de thérapie génique 24. Les complications diabétiques , y compris des modifications de la cornée peuvent être en gr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier.
Remerciements
Nous remercions le soutien financier du NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), de la subvention CTSI UL 1RR033176 (AVL) et des subventions du Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| support essentiel minimum | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS ; | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM mélange d’antibiotiques et d’antimycosiques | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| collagène de peau de veau ; | Sigma-Aldrich ; | Gélose C9791 | |
| , qualité culture tissulaire | Sigma-Aldrich ; | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich ; | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. composé ; | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II ; | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| milieu sans sérum de kératinocytes (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| milieu EpiLife avec calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 supplément moyen, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| supplément de milieu B27, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| supplément de croissance de kératinocytes humains, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsine 0,25 % - EDTA 0,02 % avec du rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsine 0,25 % avec du rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| inhibiteur de la trypsine de soja ; | Sigma-Aldrich ; | T6414 | |
| sérum fœtal bovin | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| (ITS) | Sigma-Aldrich ; | I3146-5ML | |
| anticorps contre la kératine 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| anticorps contre la kératine 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| anticorps contre la kératine 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| anticorps contre &Delta ; Np63&alpha ; | Anticorps Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| contre PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| anticorps contre nidogen-1 | R& D Systems | MAB2570 | |
| anticorps contre l’intégrine et l’alpha ; 3&bêta ; 1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| fibronectine humaine | BD Biosciences | 354008 | |
| laminine humaine | Sigma-Aldrich ; | L4445 | |
| collagène humain de type IV | Sigma-Aldrich ; | C6745-1ML | |
| Adénovirus exprimant MMP-10 shRNA | Adénovirus | sur | |
| exprimant la cathepsine F shRN | BioSciences | sur | |
| exprimant shRNA brouillé et GFP | Capital BioSciences | Adénovirus sur | |
| exprimant c-met | OriGene (plasmide | )SC323278 | |
| adénovirus exprimant la GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| citrate de sildénafil, 25 mg | Pfizer | de la pharmacie | |
| facteur de croissance épidermique ; | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich ; | P4707 | |
| polybrène | Sigma-Aldrich ; | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Allemagne | 50301 | |
| solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Spatule à bout rond Corning ; | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Boîtes de Pétri | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II lames de chambre multipuits ; | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 &mu ; l pointes de pipette | Bioexpress | P-1233-200 | autres fournisseurs disponibles |
| microscope inversé ; | Nikon | Diaphot | autres fournisseurs/modèles disponibles |
| Incubateur < COsub>2 humidifié ; | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | autres fournisseurs/modèles disponibles |
| microscope fluorescent | Olympus, Japon | BX-40 | autres fournisseurs/modèles disponibles |
| Stéréomicroscope de dissection | Leica, Allemagne | S4 E | autres fournisseurs/modèles disponibles |
Références
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2....
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Réimpressions et autorisations
