Multi-enzyme préalable au moyen d'un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

Résumé

Ce travail présente une méthode de criblage à haut débit utilisant un système universel de criblage enzymatique génétique qui peut théoriquement être appliqué à plus de 200 enzymes. Ici, le système de criblage unique identifie trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline) en changeant simplement le substrat utilisé (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle).

Résumé

Le développement récent d’une technique de dosage unicellulaire à haut débit permet le criblage de nouvelles enzymes basées sur les activités fonctionnelles d’une banque métagénomique à grande échelle¹. Nous avons précédemment proposé un système de criblage enzymatique génétique (GESS) qui utilise un régulateur de diméthylphénol activé par le phénol ou le p-nitrophénol. Étant donné qu’une grande quantité de réactions enzymatiques naturelles produisent ces composés phénoliques à partir de substrats dérivés du phénol, ce système de criblage génétique unique peut théoriquement être appliqué pour cribler plus de 200 enzymes différentes dans la base de données BRENDA. Malgré l’applicabilité générale du GESS, l’application du processus de dépistage nécessite une procédure spécifique pour atteindre les signaux de cytométrie en flux maximum. Nous détaillons ici le processus de criblage développé, qui comprend le prétraitement du métagénome avec GESS et l’utilisation d’un trieur par cytométrie en flux. Trois substrats phénoliques différents (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle) avec GESS ont été utilisés pour cribler et identifier trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline), respectivement. Les activités enzymatiques métagénomiques sélectionnées n’ont été confirmées qu’avec la cytométrie en flux, mais le séquençage de l’ADN et diverses analyses in vitro peuvent être utilisés pour une identification plus poussée des gènes.

Introduction

Un haut-débit technique de dosage unique cellule récemment développée permet de nouvelles enzymes destinées à être projetées à partir d' une bibliothèque génétique à grande échelle sur la base de leurs activités fonctionnelles ^1. Au niveau d'une seule cellule, les protéines régulatrices de la transcription sont utilisées pour déclencher l'expression du gène rapporteur par la détection de petites molécules qui sont produites par suite d'une activité de l'enzyme cible. Une première approche implique l'isolement d'un opéron phénol dégradant de Ralstonia eutropha E2 en utilisant l'expression génique induite par le substrat procédé de criblage (SIGEX), dans lequel le substrat induit l'expression d'une protéine rapporteur ^2. Nhar de Pseudomonas putida a été utilisé pour sélectionner benzaldéhyde déshydrogénase ³ et lysG de Corynebacterium glutamicum a été utilisée pour le criblage à haut débit d'une nouvelle souche L-lysine-production de diverses bibliothèques de mutants ^4.

Auparavant, une enzyme génétique screenisystème ng (GESS) a été proposé comme une plate - forme de criblage généralement applicable ^5. Ce système utilise le régulateur de diméthylphénol phénol-reconnaissant, DmpR, de P. putida. DmpR (E135K), et un mutant de DmpR, peuvent également être utilisés dans GESS (PnP-GESS) pour la détection de p - nitrophénol (PnP). En présence d'enzymes cibles produisant des composés phénoliques, dans SSES E. cellules de E. coli , émet un signal de fluorescence, ce qui permet l'isolement rapide des cellules individuelles en utilisant un trieur de cellules activées par fluorescence (FACS). Mais l'expression de l'enzyme metagénomique semble être plus faible que celle des enzymes recombinantes classiques; Par conséquent, SSES a été conçu pour détecter des composés phénoliques avec un maximum de sensibilité en recherchant la combinaison d' un site de liaison au ribosome (RBS) et les séquences de terminaison ainsi que des conditions de fonctionnement optimales ^5.

L'un des avantages fondamentaux de GESS est que cette méthode unique permet théoriquement la projection de over de 200 types différents d'enzymes dans la base de données BRENDA (tableau 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) en utilisant simplement différents substrats. Il a été montré que la cellulase, la lipase, et parathion-méthyl - hydrolase (MSP) peut être détectée à l' aide pnp SSES avec des substrats appropriés de p - nitrophényl butyrate de p - nitrophényle-cellotrioside et le parathion de méthyle, respectivement ^5. Récemment, il a été prouvé qu'une phosphatase alcaline (AP), qui est l' une des nouvelles enzymes identifiées à l' aide pnp SSES, est le premier point d' accès trouvée dans thermolabile métagénomes marines adaptées au froid ^6.

Ici, les détails du processus de sélection est présenté avec pNP-GESS détecter les activités de trois types de lipase enzymes-, cellulase, et la phosphatase alcaline différentes -et rapidement identifier de nouvelles enzymes candidats à partir d' une bibliothèque métagénomique ^5,6. Les procédés comprennent métagénome prétraiter avec pNP-GESS et l'exploitation d'un flow cytométrie trieuse. Bien que les résultats obtenus devront être séquencés pour une identification plus poussée, ce protocole couvre la procédure jusqu'à les étapes de confirmation de l'activité enzymatique par cytométrie en flux.

Protocole

1. Préparation de la bibliothèque métagénomique avec pNP-GESS

1. Construire une bibliothèque métagénomique dans E. coli avec un vecteur fosmide en utilisant un kit de production de bibliothèques fosmide selon le protocole du fabricant ^5.
2. Aliquote de 100 ul de la bibliothèque pour le stockage à -70 ° C, ce qui est une source de cellules de la bibliothèque metagénomiques.
   Note: La densité optique d'un échantillon mesuré à une longueur d'onde de 600 nm (DO ₆₀₀₎ de cette bibliothèque disponible est d' environ 100.
3. Décongeler 100 pl du stock bibliothèque métagénomique sur la glace et inoculer dans un flacon de 500 ml contenant 50 ml de Luria-Bertani (LB) et 12,5 pg / ml de chloramphenicol suivi par 37 ° C pendant 2 heures d'incubation.
4. Récolter les cellules dans un 50 ml tube conique par centrifugation à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
5. Reprendre le culot rapidement dans 50 ml d'eau glacée distillée (DW) et centrifuger à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C à nouveau.
6. Resuspend le culot dans 50 ul DW glacé avec 10% (v / v) de glycérol. Utilisez 50 pi de cette aliquote de cellules pour l'électroporation.
7. Placer le mélange de cellules électrocompétentes 50 pi et PGES (E135K) ⁵ ADN (100 ng) dans une cuvette d' électroporation et l' électroporation (1,8 kV / cm, 25 pF) , le mélange refroidi à la glace.
8. Rapidement ajouter 1 ml super bouillon optimal avec la répression catabolique (SOC) moyenne et resuspendre doucement les cellules.
9. Transférer les cellules dans un tube de 14 ml à fond rond à l'aide d'une pipette et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
10. Étaler 500 pi des cellules récupérées sur un 20 x 20 cm plaque carrée LB contenant 12,5 pg / ml de chloramphenicol et 50 pg / ml d'ampicilline. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 12 heures.
11. Grattez les colonies en utilisant un grattoir à cellules et recueillir des cellules dans un tube conique de 50 ml en utilisant des supports de stockage de cellules glacée.
12. Centrifuger à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de stockage de cellules glacéespour atteindre une DO ₆₀₀ de 100.
13. Aliquoter 20 pi des cellules pour le stockage à -70 ° C.

2. Retrait de faux positifs de la Bibliothèque métagénomique

1. Décongeler les actions des cellules de bibliothèque métagénomique (de l'étape 1.13) contenant fosmide d'ADN métagénomique et PGES (E135K) sur la glace.
2. Inoculer 10 ul de cellules dans 2 ml de LB contenant 50 pg / ml d'ampicilline et 12,5 pg / ml de chloramphenicol dans un tube à fond rond de 14 ml. Incuber à 37 ° C sous agitation à 200 tpm pendant 4 heures.
3. Pendant ce temps, mettez la machine FACS et ouvrez le logiciel FACS par défaut. Utilisez les paramètres suivants: diamètre de la pointe de buse, 70 pm; Forward Scatter Area (FSC-A) sensibilité, 300 amplification V-logarithmique; Side Scatter Area (SSC-A) sensibilité, 350 amplification V-logarithmique; Isothiocyanate de fluorescéine Area (FITC-A) sensibilité, 450 amplification V-logarithmique; paramètre de seuil, FSC Une valeur 5.
   Remarque: Les paramètres typiques sont donnéspour le dispositif FACS mentionné dans le tableau des matériaux. Réglez les paramètres pour d'autres appareils de FACS.
4. Diluer les cellules de la bibliothèque de l'étape metagénomiques 2,2 en ajoutant 5 ul de l'échantillon dans un tube à fond rond de 5 ml contenant 1 ml de PBS.
5. Placer l'échantillon de la bibliothèque diluée sur le port de chargement de l'instrument FACS et cliquez sur le bouton de charge sur le tableau de bord d'acquisition du logiciel FACS.
6. Réglez le taux 1000 d'événement - 1500 événements / s en cliquant et en contrôlant les boutons sur le débit sur le tableau de bord.
7. Créer journal escaladèrent FSC-A vs log échelle SSC-Un nuage de points sur une feuille de calcul globale en cliquant sur ​​le bouton Plot Dot dans la barre d'outils. Ajustez la porte de dispersion R1 pour englober les événements singulets (population bactérienne) en utilisant le bouton Polygon Gate dans la barre d'outils.
8. Tracer un histogramme avec le nombre de cellules en fonction de log échelle FITC-A sur la feuille de calcul en cliquant sur ​​le bouton Histogramme. Ensuite, régler la tension de la FITC Cytomeonglet Paramètres ter sur la fenêtre de contrôle inspecteur de telle sorte que le pic de la distribution en forme de cloche est inférieure à 10 ² de FITC-A.
9. Créer un journal à l' échelle FSC-A vs. le journal FITC Une parcelle en cliquant sur le bouton Plot Dot sur la feuille de calcul global. Définir un tri porte R2 sur le terrain en utilisant le bouton Polygon porte sur la barre d'outil de sorte que la porte est située entre + 5% et -5% de cellules du centre de la distribution (total des cellules de 10% autour du sommet de la cloche courbe en forme).
10. Placer un tube contenant 1,2 ml de LB contenant 50 pg / ml d' ampicilline et 12,5 pg / ml de chloramphenicol à la sortie de l'instrument FACS et de trier les cellules 10 ⁶ satisfaisant à la fois R1 et R2 portes.
11. Retirer le tube de collecte, casquette, et doucement vortex.

3. métagénomique Enzyme Screening

1. Incuber les cellules triées (étape 2.11) à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute jusqu'à ce que la _DO600 atteigne 0,5.
2. Ajouter 1 pl copie solution d'induction pour amplifier le nombre de copies fosmide intracellulaire. Incuber les cellules pendant une 3 heures supplémentaires à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
3. Pour préparer des cellules pour le tri, on ajoute 0,5 ml des cellules cultivées et un substrat approprié (p d'acétate de nitrophényle, p - nitrophényle-β-D-cellobioside ou le phosphate de phényle) dans un tube de 14 ml à fond rond à une concentration finale de 100 pm.
   1. Pour un échantillon de contrôle, ajouter 0,5 ml de cellules cultivées à l'étape 3.2 dans un tube à fond rond de 14 ml. Ajouter le même volume de PBS au volume de substrat à l'étape 3.3.
4. Incuber les deux échantillons à 37 ° C sous agitation à 200 tpm pendant 3 h.
5. Pendant ce temps, préparer la machine FACS avec les mêmes configurations que l'étape 2.3.
6. Ajouter 5 ul de cellules (de tri) et des cellules de contrôle à deux tubes de 5 ml à fond rond contenant 1 ml de PBS, respectivement.
7. Placer le tube contenant des cellules de commande sur til port de chargement des FACS et cliquez sur le bouton Charger sur Dashboard Acquisition du logiciel FACS. Réglez l'événement Taux 1000 - 3000 événements / s en contrôlant le débit de boutons sur le tableau de bord.
8. Créer journal échelle FSC-A vs log échelle SSC-Un nuage de points en cliquant sur ​​le bouton Plot Dot sur ​​la feuille de calcul globale du logiciel et d' ajuster la grille de diffusion R1 pour englober les événements singulets (population bactérienne) en utilisant le bouton Polygon porte sur la barre d'outils.
9. Créer journal échelle FSC-A vs log échelle FITC Un nuage de points en cliquant sur ​​le bouton Plot Point sur ​​la feuille de calcul et définir un tri porte R2 sur le terrain en utilisant le bouton Polygon porte sur la barre d'outils de sorte que moins de 0,1% de cellules négatives sont détectées dans la porte R2.
10. Remplacer le tube d'échantillon de contrôle avec le tube de tri des échantillons, et d'ajuster le taux d'événements pour 1000 - 3000 événements / s en contrôlant les boutons sur le débit sur le tableau de bord.
11. Placer un tube contenant 0,5ml LB à la sortie de l'instrument FACS et sort sur ​​10 ⁴ cellules répondant à la fois aux portes R1 et R2.
    Remarque: le critère de tri peut varier de 0,1% supérieure à 5% de FITC-A dans la grille R2. Dans ce protocole, les meilleures cellules 1% ont été collectées comme positifs.
12. Retirer le tube de collecte, casquette, et doucement vortex.
13. Répartir les 0,5 ml d'échantillons prélevés sur deux plaques de gélose (90 mm) des boîtes de Petri contenant du milieu LB, 50 pg / ml d'ampicilline, 12,5 pg / ml de chloramphenicol et on incube la plaque à 37 ° C pendant une nuit.
14. Si nécessaire, effectuer des tours supplémentaires de tri pour FITC-A enrichissement en répétant les étapes 3.1-3.14.

4. Hit Sélection et l'activité enzymatique Confirmation

1. Analyse par cytométrie de flux
   1. De la plaque a été incubée à l'étape 3.14, sélectionnez une colonie montrant aucune fluorescence à l'aide d'un sélecteur de colonie sous l'observation de 488 nm de longueur d'onde d'un illuminateur LED.
   2. Inoculer la colonie sélectionnée dans un 14 ml round fond tube contenant 2 ml de LB contenant 50 pg / ml d' ampicilline et 12,5 pg / ml de chloramphenicol à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute jusqu'à ce que la _DO600 atteigne 0,5.
   3. Ajouter 2 ul copier solution d'induction pour amplifier le nombre de copies fosmide intracellulaire. Incuber les cellules pendant une 3 heures supplémentaires à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
   4. Préparer un tube à fond rond de 14 ml et ajouter 1 ml des cellules cultivées (étape 4.1.3). Ajouter un substrat approprié (acétate de p - nitrophényle, p -nitrophenyl- β - D-cellobioside ou le phosphate de phényle) à une concentration finale de 100 uM.
      1. Pour un contrôle, ajouter les 1 ml de cellules cultivées à l'étape 4.1.3 dans un 14 ml de tube à fond rond et ajouter le même volume de PBS que le volume de substrat à l'étape 4.1.4.
   5. Incuber les deux échantillons à 37 ° C sous agitation à 200 tpm pendant 3 h.
   6. Pendant ce temps, préparer la machine FACS avec les mêmes configurations que l'étape 2.3.
   7. Ajouter 5 ul de cellules témoins et de substrat traité pour tubes de 5 ml à fond rond contenant 1 ml de PBS, respectivement.
   8. Placez les cellules de contrôle du tube contenant sur le port de chargement de l'appareil FACS et cliquez sur le bouton Charger sur Dashboard Acquisition du logiciel FACS. Réglez le taux 1000 d'événement - 3000 événements / s à l'aide des boutons sur le débit sur le tableau de bord.
   9. Cliquez sur le bouton Acquisition pour mesurer FITC-A.
   10. Remplacer le tube d'échantillon de contrôle avec le tube d'échantillon de substrat traité. Réglez le taux 1000 d'événement - 3000 événements / s à l'aide des boutons sur le débit sur le tableau de bord.
   11. Cliquez sur le bouton Acquisition pour mesurer FITC-A.
   12. Comparer la fluorescence des deux groupes de cellules en traçant un histogramme du nombre de cellules par rapport à l'échelle log-A FITC.
2. D'autres essais pour confirmer l'activité enzymatique
   1. Pour plus d'identification des candidats d'enzymes sélectionnées, extraire l'ADN fosmide utilisant pro extraction normecédures des kits commerciaux d'extraction et d' analyser la séquence nucléotidique, ou tester l'activité enzymatique in vitro ^6,7.

Résultats

Les trois substrats phénoliques ont été examinés afin d'identifier de nouvelles enzymes métagénomiques d'une bibliothèque de métagénome des sédiments océaniques plates-marée dans Taean, la Corée du Sud en suivant le protocole proposé. Pour la construction de la bibliothèque, en moyenne 30 - séquences de métagénome 40 kb ont été insérés dans fosmides, qui sont basés sur le E. coli F facteur réplicon et présenté comme un seul exemplaire dans une cellule. A noter que fosmides ont é...

Discussion

Accroître l' efficacité de biocatalyseurs de production est une clé pour le succès de la bio-chimique à base industrie ⁹ et métagénome est considéré comme l' un des meilleurs source d'enzyme naturelle. En ce sens, il est essentiel de criblage de nouvelles enzymes du métagénome où la majorité des ressources génétiques n'a pas été explorée ^10. Plusieurs méthodes de criblage ont été développés , qui détectent directement des produits enzymatiques utilisant des activateurs de transcript...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Kit de production de la bibliothèque Fosmid  ;
CopyControl Induction Solution	Epicentré	CCIS125	Fosmid copy
solution EPI300	Epicentre	EC300110	Cellule électrocompétente
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid
vector Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette et système d’électroporat
FACSAria III	Becton Dickinson		Cytométrie en flux (machine FACS)
Nikon		AZ100M	;
UltraSlim  ;	Illuminateur LED	Maestrogen
50 ml tube conique	BD Falcon
14 ml tube à fond rond	BD Falcon
Tube à fond rond de 5 ml	BD Falcon
p-nitrophényl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-nitrophényle &beta ;-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
p-butylate de nitrophényle	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp ;	substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10 g/L, Extrait de levure 5 g/L, Chlorure de sodium 10 g/L
Bouillon Super Optimal (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20 g/L, Extrait de levure 5 g/L, Chlorure de sodium 0,5 g/L, Sulfate de magnésium 2,4 g/L, Chlorure de potassium 186 mg/L
Bouillon super optimal avec répression des catabolites (SOC)		SOB, 0,4 % de glucose
2x Extrait de levure Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Digestion pancréatique de la caséine 16 g/L, Extrait de levure 10 g/L, Extrait de levure 5 g/L
Milieu			2x bouillon YT, 15 % Glycérol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			Vecteur d’ADN contenant des gènes dmpR, egfp avec leurs promoteurs appropriés, RBS et terminator. Voir la référence 5 dans le manuscrit pour Plus de détails.
Chloramphénicol	Sigma	C0378
Ampicilline	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Logiciel de cytométrie en flux Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4