Multi-enzyme préalable au moyen d'un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

Summary

Ce travail présente une méthode de criblage à haut débit utilisant un système universel de criblage enzymatique génétique qui peut théoriquement être appliqué à plus de 200 enzymes. Ici, le système de criblage unique identifie trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline) en changeant simplement le substrat utilisé (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle).

Abstract

Le développement récent d’une technique de dosage unicellulaire à haut débit permet le criblage de nouvelles enzymes basées sur les activités fonctionnelles d’une banque métagénomique à grande échelle¹. Nous avons précédemment proposé un système de criblage enzymatique génétique (GESS) qui utilise un régulateur de diméthylphénol activé par le phénol ou le p-nitrophénol. Étant donné qu’une grande quantité de réactions enzymatiques naturelles produisent ces composés phénoliques à partir de substrats dérivés du phénol, ce système de criblage génétique unique peut théoriquement être appliqué pour cribler plus de 200 enzymes différentes dans la base de données BRENDA. Malgré l’applicabilité générale du GESS, l’application du processus de dépistage nécessite une procédure spécifique pour atteindre les signaux de cytométrie en flux maximum. Nous détaillons ici le processus de criblage développé, qui comprend le prétraitement du métagénome avec GESS et l’utilisation d’un trieur par cytométrie en flux. Trois substrats phénoliques différents (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle) avec GESS ont été utilisés pour cribler et identifier trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline), respectivement. Les activités enzymatiques métagénomiques sélectionnées n’ont été confirmées qu’avec la cytométrie en flux, mais le séquençage de l’ADN et diverses analyses in vitro peuvent être utilisés pour une identification plus poussée des gènes.

Introduction

Un haut-débit technique de dosage unique cellule récemment développée permet de nouvelles enzymes destinées à être projetées à partir d' une bibliothèque génétique à grande échelle sur la base de leurs activités fonctionnelles ^1. Au niveau d'une seule cellule, les protéines régulatrices de la transcription sont utilisées pour déclencher l'expression du gène rapporteur par la détection de petites molécules qui sont produites par suite d'une activité de l'enzyme cible. Une première approche implique l'isolement d'un opéron phénol dégradant de Ralstonia eutropha E2 en utilisant l'expression génique induite par le subst....

Protocol

1. Préparation de la bibliothèque métagénomique avec pNP-GESS

1. Construire une bibliothèque métagénomique dans E. coli avec un vecteur fosmide en utilisant un kit de production de bibliothèques fosmide selon le protocole du fabricant ^5.
2. Aliquote de 100 ul de la bibliothèque pour le stockage à -70 ° C, ce qui est une source de cellules de la bibliothèque metagénomiques.
   Note: La densité optique d'un échantillon mesuré à une longueur d'onde de 600 nm (DO ₆₀₀₎ de cette bibliothèque disponible est d' environ 100.
3. Décongeler 100 pl du stock bibliothèque métagénomique sur la glace et inoculer da....

Results

Les trois substrats phénoliques ont été examinés afin d'identifier de nouvelles enzymes métagénomiques d'une bibliothèque de métagénome des sédiments océaniques plates-marée dans Taean, la Corée du Sud en suivant le protocole proposé. Pour la construction de la bibliothèque, en moyenne 30 - séquences de métagénome 40 kb ont été insérés dans fosmides, qui sont basés sur le E. coli F facteur réplicon et présenté comme un seul exemplaire dans une cellule. A noter que fosmides ont é.......

Discussion

Accroître l' efficacité de biocatalyseurs de production est une clé pour le succès de la bio-chimique à base industrie ⁹ et métagénome est considéré comme l' un des meilleurs source d'enzyme naturelle. En ce sens, il est essentiel de criblage de nouvelles enzymes du métagénome où la majorité des ressources génétiques n'a pas été explorée ^10. Plusieurs méthodes de criblage ont été développés , qui détectent directement des produits enzymatiques utilisant des activateurs de transcript.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Kit de production de la bibliothèque Fosmid  ;
CopyControl Induction Solution	Epicentré	CCIS125	Fosmid copy
solution EPI300	Epicentre	EC300110	Cellule électrocompétente
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid
vector Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette et système d’électroporat
FACSAria III	Becton Dickinson		Cytométrie en flux (machine FACS)
Nikon		AZ100M	;
UltraSlim  ;	Illuminateur LED	Maestrogen
50 ml tube conique	BD Falcon
14 ml tube à fond rond	BD Falcon
Tube à fond rond de 5 ml	BD Falcon
p-nitrophényl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-nitrophényle &beta ;-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
p-butylate de nitrophényle	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp ;	substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10 g/L, Extrait de levure 5 g/L, Chlorure de sodium 10 g/L
Bouillon Super Optimal (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20 g/L, Extrait de levure 5 g/L, Chlorure de sodium 0,5 g/L, Sulfate de magnésium 2,4 g/L, Chlorure de potassium 186 mg/L
Bouillon super optimal avec répression des catabolites (SOC)		SOB, 0,4 % de glucose
2x Extrait de levure Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Digestion pancréatique de la caséine 16 g/L, Extrait de levure 10 g/L, Extrait de levure 5 g/L
Milieu			2x bouillon YT, 15 % Glycérol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			Vecteur d’ADN contenant des gènes dmpR, egfp avec leurs promoteurs appropriés, RBS et terminator. Voir la référence 5 dans le manuscrit pour Plus de détails.
Chloramphénicol	Sigma	C0378
Ampicilline	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Logiciel de cytométrie en flux Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4