Promotion 3-D agrégation de cellules FACS purifiées thymique épithéliales avec EAK 16-II / EAKIIH6 auto-assemblage Hydrogel

Résumé

Cette vidéo présente un protocole permettant d’enrichir les cellules épithéliales thymiques (TEC) avec un gradient de densité pour l’isolation FACS. Il montre également l’utilisation des peptides EAK16-II/EAKIIH6 pour favoriser la formation d’agrégats TEC. Les microenvironnements de l’hydrogel EAK16-II/EAKIIH6 fournissent la configuration 3D nécessaire pour maintenir la survie et la fonction des TEC.

Résumé

L’involution du thymus, associée au vieillissement ou à des agressions pathologiques, entraîne une diminution de la production de lymphocytes T matures. La restauration de la fonction d’un thymus défaillant est cruciale pour maintenir une réponse immunitaire acquise efficace médiée par les lymphocytes T contre les agents pathogènes envahissants. Cependant, la régénération et la revitalisation du thymus se sont avérées difficiles, en grande partie en raison des difficultés à reproduire le microenvironnement 3D unique du stroma thymique qui est essentiel à la survie et à la fonction des cellules épithéliales thymiques (TEC). Nous avons développé un nouveau système d’hydrogel pour favoriser la formation d’agrégats TEC, basé sur la propriété d’auto-assemblage des oligopeptides amphiphiles EAK16-II et de son analogue histidinylé EAKIIH6. Les TEC ont été enrichis à partir de cellules thymiques isolées à gradient de densité, triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et marquées avec des anticorps anti-molécules d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM) ancrés, avec des IgG anti-HIS, sur les complexes adaptateurs de la protéine A/G. La formation d’agrégats cellulaires a été favorisée par l’incubation de TEC avec des oligopeptides EAKIIH6 et EAK16-II, puis par l’augmentation de la concentration ionique du milieu pour initier la gélification. Les agrégats TEC intégrés dans l’hydrogel EAK peuvent favoriser efficacement le développement de lymphocytes T fonctionnels in vivo lorsqu’ils sont transplantés chez des souris nude athymiques.

Introduction

Le thymus est l'organe lymphoïde primaire responsable de la génération d'une population diverse de cellules T auto-réactives tolérant pathogènes qui est essentiel à la fonction du système immunitaire acquise. Il est un organe dynamique, où les thymocytes en voie de développement, ont émigré de la moelle osseuse en tant que cellules souches des lymphocytes, migrent à travers les trois dimensions (3-D), la matrice de type éponge du stroma thymique, subir une lignée spécification et de différenciation, et éventuellement émigrer matures T-cellules. Le succès de ce processus bien programmé dépend largement de la diaphonie entre les thymocytes migrateurs et les cel....

Protocole

Tous les animaux utilisés dans les expériences ont été logés dans l'animalerie de l'Institut de recherche Allegheny-Singer dans le cadre du protocole révisé et approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du / Allegheny Institut de recherche Chanteur Réseau de santé Allegheny.

1. Digérer les Thymus avec collagénase

1. Récolte thymus.
   1. Euthanasier 3-5 semaines d'âge des souris C57BL6 / J dans un dioxyde de carbone (CO ₂₎ chambre pour récolter thymus. Dans le détail, placer les souris dans la chambre sous CO ₂ induction pendant 3-5 min et confirmer la mor....

Résultats

Pour examiner l'efficacité de l'utilisation de la densité protocole de séparation par gradient pour enrichir les cellules stromales CD45-, les cellules récoltées à partir de l'interface et les pastilles de lymphocytes précipités ont été colorées avec des anticorps anti-EpCAM anti-CD45 et. Les deux anti-Ulex europaeus agglutinine 1 (UEA1) et des anticorps anti-CMH de classe II ont également été inclus dans le cocktail de coloration pour mieux identifier les sous-ensembles cTEC et MTEC. Co.......

Discussion

Alors que les TEC sont la population majoritaire du stroma thymique et jouent un rôle essentiel pour la structure et la fonction des glandes de thymus, ils représentent seulement environ 0,1-0,5% de la cellularité thymique totale. Ils sont également des cellules fragiles comme un pourcentage élevé de mort cellulaire sont parfois observée après digestion par la collagénase, à savoir le traitement de dissocier TECs de la matrice extracellulaire (ECM). Leur rareté (~ 200.000 par thymus de la souris) et la fragilit.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
TEC Isolation
70 % d’éthanol	Decon Laboratories	2701(1 gallon)	Éthanol 200 proof, eau déminéralisée
Ciseaux de dissection, droit	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Pince Graefe, droite	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Pince Graefe, incurvée	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Solution			1x PBS, 0,1 % BSA, 2  ; mM EDTA
1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Gibco	10010-023
BSA (albumine sérique bovine)	Sigma	A1470-100G
EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique)	Invitrogen	15575-038
Solution de digestion			9 ml RPMI-1640, 0,025  ; mg/ml Liberase TM Note de recherche, 10  ; mM HEPES, 0,2  ; mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	appelée « collagénase purifiée »
1  ; M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50  ; ml Tube à centrifuger	Corning	430290
60  ; mm boîte de culture tissulaire	Falcon	353002
1/2  ; cc U-100 Seringue à insuline 28  ; 1/2  ; G	Becton Dickinson	329461
5 ml Tube en polystyrène à fond rond	Falcon	352058
5  ; ml pipette en verre	Fisher Healthcare	13-678-27E	Utiliser pour rincer les fragments thymiques. Les fragments thymiques ont tendance à coller à la paroi avec des pipettes en plastique.
Rotateur de tube MACSmix	Miltenyi	130-090-753
100  ; et micro ; m Crépine à cellules	Falcon	352360
Gradient de densité moyen : OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5  ; ml Tube en polypropylène à fond rond	Falcon	352063
Anti-souris CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Utilisation non diluée, 2  ; et micro ; l par échantillon
Anti-souris CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Utilisation à 1:150, 10  ; et micro ; l par échantillon
Anti-souris CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Utilisation à 1:100, 10  ; et micro ; l par échantillon
BD Influx	BD Biosciences
Logiciel d’analyse de cellule unique	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Protéine recombinante A/G	Pierce Biotechnology
1,5   ; ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	dénommé « 1.5  ; ml microtube de centrifugation"
96 puits, Plaque de culture tissulaire, Fond rond avec couvercle à faible évaporation	BD Falcon	353917
Plate-forme basculante : Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10 % saccharose	Sigma	S0389	Préparer avec de l’eau distillée stérile
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company& nbsp ;		synthétisé sur mesure, 10  ; mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company  ;		synthétisé sur mesure, 7,5  ; mg/ml
Support			RPMI-1640, 10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % L-glutamine, 1 % NEAA, 5  ; mM HEPES, 50  ; et micro ; M 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Sérum de veau fœtal)	Atlanta Biologicals	S11150	Chaleur inactivée avant utilisation
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200  ; mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (acide aminé non essentiel) 100x	Gibco	11140-050
1  ; M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoéthanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Agitateur de plate-forme : The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	modèle : USBDbo

de lavage complet