Vérification rapide de Terminators Utilisation du pgr-Blue plasmidique et Golden Assemblée Porte

Résumé

Ce protocole utilise l’assemblage Golden Gate et le plasmide pGR-blue pour quantifier rapidement la force des terminateurs trouvés in silico.

Résumé

L’objectif de ce protocole est de permettre la vérification rapide des terminateurs identifiés bioinformatiquement. De plus, le plasmide (pGR-Blue) est conçu spécifiquement pour ce protocole et permet de quantifier l’efficacité du terminateur. À titre de preuve de concept, six terminateurs ont été identifiés par bioinformatique dans le mycobactériophage Bernal13. Une fois identifiés, les terminateurs ont ensuite été fabriqués sous forme d’oligonucléotides avec les extrémités collantes appropriées et recuits ensemble. À l’aide du Golden Gate Assembly (GGA), les terminaisons ont ensuite été clonées dans pGR-Blue. Sous la lumière visible, les colonies faussement positives apparaissent bleues et les colonies transformées positivement sont blanches/jaunes. Après l’induction d’un promoteur inductible par l’arabinose (pBad) avec l’arabinose, la force de la colonie peut être déterminée en mesurant le rapport entre la protéine fluorescente verte (GFP) produite et la protéine fluorescente rouge (RFP) produite. Avec pGR-Blue, le protocole peut être complété en aussi peu que trois jours et est idéal dans un cadre éducatif. De plus, les résultats montrent que ce protocole est utile comme moyen de comprendre les prédictions in silico de l’efficacité du terminateur liées à la régulation de la transcription.

Introduction

Les grands projets de biologie synthétique nécessitent l’utilisation de terminateurs de transcription très efficaces pour aider à réguler l’expression des gènes. L’identification de nouveaux terminateurs nécessite une analyse bioinformatique de nouveaux génomes. Cependant, à mesure que de plus en plus de logiciels bioinformatiques sont développés, chacun avec un algorithme unique utilisé pour la prédiction, plus d’écart entre les résultats présumés se produit. Parce que ce processus est quelque peu subjectif et qu’il est effectué in silico, ces prédictions doivent être confirmées biologiquement. ¹ De plus, le volume de terminateurs présumés identif....

Protocole

1. Conception et Commande Oligonucleotides avec les collants appropriés Ends

1. Identifier terminateurs rho-indépendant potentiels par le biais de l' analyse génomique en utilisant des programmes qui sont disponibles gratuitement en ligne. ⁷
2. Lorsque l'on travaille avec de l' ADN double brin, déterminer l'orientation du terminateur à tester. ⁷ Le plasmide pgr-Blue ne vérifie terminateurs ligaturées dans le 5 'à 3' sur le dessus (brin avant).
   1. Convertir un fond (arrière) brin de terminaison à son complément inversé pour réorienter la séquence pour les tests en pgr-Blue en utilisant un logiciel gratuit en ligne, par ex....

Résultats

Ce protocole va produire des cellules contenant pgr-bleu avec un terminateur ligaturé entre GFP et RFP à l' aide d' or Assemblée Porte (figure 2). Les colonies positives contenant insert ligaturé peuvent être choisis en fonction de la couleur. À la lumière visible colonies positives seront blanc / jaune et faux positifs vont produire des colonies bleues après 18-20 heures d'incubation à 37 ° C (figure 3).

Discussion

L'étape la plus importante dans ce protocole est la conception d'oligonucléotides appropriée avant de commander. Les oligonucléotides doivent avoir des extrémités cohésives appropriées ajoutées aux extrémités 5 'des deux brins du haut et du bas pour faire en sorte que l'incorporation GGA est possible. En outre, il est important de changer l'orientation de terminateurs tourné vers la gauche (terminateurs qui empêchent la transcription sur le brin inférieur) à celui de droite face (termine la transcrip.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
pGR-Blue Plasmid	Addgene	68374
pGR-Plasmid	Addgene	46002
AeraSeal-(Feuilles stériles)	Excel Scientific	BS-25	Feuilles stériles uniquement
10x T4 DNA ligase Buffer	NEB
BsaI-HF	NEB	R3535S	L’enzyme non HF fonctionnera mais est moins stable à la chaleur.  ;
NEB Golden Gate Assembly Mix	NEB	E1600S	Commerial Master Mix mentionné dans le protocole.
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Microcentrifugeuse ronde Rack flottant	Nova Tech International	F18875-6401
Ampicilline sel sodique	Sigma Aldrich	A9518
L-(+)-Arabinose	Sigma Aldrich	A-3256	D-Arabinose n’induira pas le promoteur pBAD
Luria Base (LB) - Bouillon, Miller	Sigma Aldrich	L1900
Luria Base (LB) - Agar, Miller	Sigma Aldrich	L2025
Tecan-Infinite M200 Lecteur de plaques	Tecan
Mix & Go Competent Cells - Souche JM109	Zymo Research	T3005	Utiliser le protocole de transformation recommandé par l’entreprise
ApE : Un logiciel d’édition de plasmides	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Chlorure	Promega	H5121
(cristallin/biologique, certifié)	Fisher Chemical	S671
Synthèse d’oligonucléotides commerciaux	Integrated DNA Technologies (IDT)		http://www.idtdna.com/site
Microtest Plaques de culture tissulaire - 96 puits (stérile)	Falcon	35-3072
mycobactériophage « Bernal13"	Banque de gènes	KJ510413
Eau libre de nucléases	Integrated DNA Technologies (IDT)	IDT004
Stérile, en forme de L Hockey-Stick Cell	Life Science Products	6444-S1
Nano-Drop 2000c Spectromètre UV-Vis	Thermo Scientific	2000c
ARNold : un outil web pour la prédiction des terminateurs de transcription Rho-indépendants.