Article de méthode

Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

DOI :

10.3791/54077

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2 juillet 2016

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1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

Dans cet article

Résumé

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Un protocole établissant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées du liquide synovial et de la moelle osseuse de miniporcs et collectées de manière non invasive par aspiration à la seringue est présenté. Le phénotypage cellulaire a été effectué à l’aide de la cytométrie en flux après isolement cellulaire et culture in vitro de la moelle osseuse et de liquides synoviaux dérivés de CSM.

Résumé

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cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été établies après isolement à partir de diverses sources tissulaires, y compris la moelle osseuse et le liquide synovial. Récemment, il a été rapporté que les CSM dérivées du liquide synovial avaient un potentiel de différenciation multi-lignées et des caractéristiques immunomodulatrices, ce qui indique que ces cellules peuvent être utilisées pour l’ingénierie tissulaire et les traitements systémiques. Cette étude présente un protocole d’isolement simple et non invasif de CSM dérivées de la moelle osseuse et du liquide synovial de miniporcs afin d’analyser les marqueurs de surface cellulaire pour le phénotypage cellulaire et la culture in vitro. À l’aide de miniporcs sexuellement matures âgés de six mois, la moelle osseuse a été extraite de l’os de la crête iliaque à l’aide d’un extracteur de moelle osseuse, et le liquide synovial a été aspiré de l’articulation fémoro-tibiale. Les procédures de prélèvement d’échantillons des deux sources n’étaient pas invasives. Les protocoles pour l’isolement efficace des CSM à partir de sources cellulaires récoltées et pour la création de conditions de culture in vitro afin d’étendre les CSM stables à partir de miniporcs et l’application de traitements autologues systémiques sont fournis. Pour le phénotypage cellulaire, les marqueurs de surface cellulaire des deux cellules ont été analysés à l’aide de la cytométrie en flux. Dans les résultats, les CSM ont été isolées du liquide synovial des miniporcs et ont montré que les CSM dérivées du liquide synovial ont une morphologie et un phénotype cellulaire similaires à ceux des CSM dérivées de la moelle osseuse. Par conséquent, le liquide synovial obtenu de manière non invasive est une source précieuse de CSM.

Introduction

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Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) multipotentes peuvent être classées en lignées cellulaires mésenchymateuses, et les CSM ont été établies et isolées à partir de diverses sources tissulaires, telles que la moelle osseuse, les cordons ombilicaux, les placentas, le tissu adipeux, la peau dermique, les muscles squelettiques, les follicules pileux, les membranes synoviales et les dents1 à 5. À l’heure actuelle, une attention particulière a été accordée aux CSM dérivées de synoviales parce que ces cellules peuvent aider à traiter les maladies articulaires, telles que la fraction osseuse, l’arthrose et la polyarthrite rhumatoïde (PR), et en raison du potentiel régénérateur des CSM dans le cartilage ou l’os endommagés, elles peuvent également aider à traiter la modulation immunitaire ou les maladies auto-immunes6-8. La majorité des recherches sur les CSM dérivées de sources synoviales ont utilisé des CSM de la membrane synoviale plutôt que du liquide synovial2,9 ; ainsi, la compréhension biologique des CSM dérivées du liquide synovial est limitée.

Le liquide synovial est une source facilement accessible de CSM, qui peuvent être aspirées lors des diagnostics ou des traitements des patients et lors des confirmations diagnostiques de diverses affections arthritiques qui ne nécessitent pas de procédures invasives, telles que l’arthrose ou la PR. La population de CSM dérivées du liquide synovial dans la cavité synoviale est significativement augmentée chez les patients arthritiques par rapport aux patients non arthritiques10-12. Par conséquent, le liquide synovial est une excellente source candidate pour les CSM, en particulier pour la thérapie par cellules souches autologues chez les patients dont les articulations sont enflammées ou blessées. De plus, les CSM dérivées du liquide synovial ont une capacité chondrogénique, des capacités d’immunomodulation et un taux élevé de prolifération. Cette étude a permis d’établir des protocoles pour l’extraction de la moelle osseuse et l’aspiration du liquide synovial chez les miniporcs à l’aide de méthodes non invasives, ainsi que pour l’expansion in vitro de cellules isolées et l’analyse des phénotypes cellulaires.

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Protocole

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Les expérimentations animales ont été autorisées par l'Animal Center for Biomedical Expérimentation à l'Université nationale de Gyeongsang.

1. Préparatifs de la procédure animale

  1. Préparer minicochons l'adulte femelle pour la collecte non invasif des cellules souches mésenchymateuses à partir de la moelle osseuse et du liquide synovial. Effectuer l'examen clinique des miniporcs un jour avant l'anesthésie et le prélèvement d'échantillons.
    1. Fournir des animaux cliniquement normaux pour des examens physiques, qui comprennent la température du corps, la fréquence respiratoire, et la fréquence cardiaque, et pour l'observation des comportements et des hémopathies les statuts des porcs, à l'aide de tests complets de comptage de sang.
      Remarque: Les intervalles de paramètres pour minipigs cliniquement sains sont 11-29 / min pour le taux de respiration, 68-98 / min pour la fréquence cardiaque, et 37-38 ° C pour la température du corps.
  2. Enlevez toute la literie comestible de la cage au cours de la période de jeûne préopératoire de 6-12 h prior à l'administration de l'anesthésie pour les jeunes et les adultes miniporcs, 3 heures de jeûne doit être observé pour les nouveau-nés. Fournir de l'eau potable jusqu'à ce que le temps de l'anesthésie.

2. Préparation des animaux pour l'anesthésie

  1. Medicate les miniporcs avant l'administration de l'anesthésie avec de l'acépromazine (0,1 mg / kg), médétomidine (0,03 mg / kg), et de l'atropine (0,04 mg / kg).
    1. Injecter tous les médicaments par voie intramusculaire (IM) en utilisant une aiguille 21 G avec une longueur d'au moins 30 mm pour minipigs adultes. Effectuer l'injection IM 1-3 cm derrière l'oreille dans le muscle cervical latéral ou dans le muscle de la cuisse.
      Remarque: Effectuez toutes les procédures sans susciter la peur ou le stress chez les animaux ou nécessitant une manipulation brutale pour injecter en toute sécurité la prémédication.
  2. Placez les miniporcs dans une position dorsale-allongée.
  3. Quinze minutes après l'administration de la prémédication, initier une anesthésie à l'aide de 1,5% d'isoflurane administrationenre- par inhalation.
    1. Continuer l'inhalation d'isoflurane (1,5%) à travers un tube endotracheal, suivi d'une augmentation de la concentration de 2,5%, avec de l'oxygène (1,5 L / min) en tant que gaz porteur.
  4. Surveiller en permanence le rythme cardiaque, la température corporelle, et percutanée saturation en oxygène du sang (SpO 2) des miniporcs pendant l' anesthésie. Utiliser une couverture à circulation d'eau à une température de 38-39 ° C pour maintenir la température corporelle. Appliquer une pommade ophtalmologique pour protéger les yeux de sécher pendant l'anesthésie.
  5. Suivez la classification de Guedel pour évaluer la profondeur de l' anesthésie 13.

3. Préparation de cellules d'isolement et de culture

  1. Cultiver les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse et du liquide synovial, de préparer 500 ml de milieu Eagle modifié de pointe Dulbecco (à ADMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de Glutamax, 10 ng / ml de croissance des fibroblastes basique faitr (bFGF), et 1,0% de pénicilline-streptomycine (10000 UI et 10.000 pg / ml, respectivement, de Pen-Strep).
    1. Incuber la ADMEM à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 dans un incubateur à CO2.
  2. Préparer 500 ml de tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS) en suivant les instructions du fabricant pour l'isolement de cellules et de lavage.

4. La collecte de moelle osseuse de la Minipigs

  1. Sélectionnez une zone d' environ 15 x 15 cm en taille sur la crête iliaque (Figure 1), et enlever les poils de cette zone à l' aide de rasoirs de sécurité stérilisés ou tondeuses électriques. Une fois que le porc miniature est positionnée, alternativement frotter le site de procédure à trois reprises avec des agents de stérilisation suivants: povidone iode et 70% d'éthanol. Après la zone est complètement sec, appliquer des champs stériles.
  2. Prérevêtement la seringue de 10 ml avec 100 U / ml d'héparine par rinçage avec 3 - 4 ml d'héparine avant ejecting l'agent anti-coagulant.
    Remarque: Effectuez cette étape pour éviter la coagulation dans la seringue lors de l'aspiration de la moelle osseuse.
  3. Extraire un minimum de 5 ml de la moelle osseuse de l'os iliaque du porc miniature, sous anesthésie, à l'aide d'un extracteur de moelle osseuse (3,0 x 100 mm) fermement fixé à l'héparine prérevêtu seringue de 10 ml.

5. Isolement des cellules extraites de la moelle osseuse et de la culture in vitro

  1. Isoler les cellules de la moelle osseuse extraite.
    1. Diluer la moelle osseuse extraite avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 ml à la température ambiante.
    2. Ajouter 3 ml de milieu de centrifugation de densité (Ficoll-Paque) pour le tube conique de 15 ml.
    3. Diluer une couche de 4 ml de la moelle osseuse avec du DPBS, qui est placé sur le support de centrifugation par densité, sans mélange et on centrifuge à 400 x g pendant 40 min à température ambiante.
    4. Récolter la couche de cellules mononucléaires(EMN) à partir de la couche leucocytaire entre les deux couches contenant le plasma (couche supérieure) et le support de centrifugation de densité (couche inférieure), et transférer les PTM dans un tube de 15 ml conique.
    5. Diluer les multinationales transférés avec 7 - 8 ml de DPBS et centrifuger eux à 500 × g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules deux fois avec DPBS.
    6. Suspendre le culot de cellules dans 2 ml de ADMEM et le transférer dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm. Incuber la boîte de culture à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2.
  2. La culture in vitro de cellules isolées à partir de moelle osseuse.
    1. Au bout de 48 h, aspirer le milieu avec les cellules qui ne sont pas attachées à la cuvette, et remplacer 2 ml de la ADMEM et incuber à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Changer le milieu tous les jours tiers.
    2. À 70 - 80% de confluence, laver les cellules avec du DPBS, les dissocier avec 1 ml de 0,25%trypsine / EDTA, et incuber à 37 ° C pendant 3 - 5 min jusqu'à ce que les cellules se détachent.
    3. Récolter les cellules en utilisant 10 ml de ADMEM, de les transférer dans un tube conique de 15 ml, et on les centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant.
    4. Suspendre les cellules récoltées dans 1 ml de ADMEM frais et les compter en utilisant un hémocytomètre.
    5. Placer les cellules dans un 5 - 5 x 10 / 25T fiole contenant 7,5 ml de 4 ADMEM et incuber à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Changer le support tous les trois jours.

6. Collection de liquide synovial des Minipigs

  1. Semblable à la procédure d'aspiration de la moelle osseuse, sélectionnez une zone appropriée d'environ 15 x 10 cm (longueur / largeur) sur l'articulation du fémur, et enlever les poils à l'aide des rasoirs de sécurité stérilisés ou tondeuses électriques, suivre des procédures de désinfection (étape 4.1).
  2. Insérer une seringue de 3 ml avec une 23 Gaiguille dans l'articulation après les repères de palpation (rotule et le tibia crête).
    1. Appliquer une aspiration douce aux seringues pour l'aspiration du liquide synovial dans l'articulation. Le volume approximatif de liquide synovial prélevé chez un joint est de 0,5 - 1 ml, mais cela varie en fonction de la taille du porc miniature ou l'articulation. Rincer par du DPBS dans la cavité synoviale si le volume recueilli du liquide synovial est trop petit.
    2. Retirer immédiatement la seringue pour éviter la contamination par le sang.

7. Cellule d' isolement du liquide synovial Collectées et culture in vitro

  1. Isoler les cellules à partir du liquide synovial aspiré.
    1. On dilue le liquide synovial aspiration avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 ml à la température ambiante.
    2. Pour éliminer les débris, filtrer le liquide synovial dilué en utilisant une cellule de nylon tamis de 40 um.
    3. Ajouter 10 ml de DPBS dans le tube contenant la synoviale filtréefluide et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules deux fois avec DPBS.
    4. Suspendre le culot de cellules dans 2 ml de ADMEM, placer les cellules sur une 2 - boîte de culture tissulaire de 3 x 10 5 cellules / 35 mm avec 2 ml de ADMEM et incuber à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 .
  2. Répétez l' étape 5.2 pour la culture in vitro des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial isolées.

8. Post-procédure de soins des Minipigs

  1. Si nécessaire, fermez la peau au niveau du site d'injection d'extraction de moelle osseuse avec une seule suture à l'aide d'une agrafeuse de la peau, après la collecte de la moelle osseuse.
  2. Une fois la procédure terminée, administrer une injection intramusculaire d'enrofloxacine (5 mg / kg) et le méloxicam (0,2 mg / kg) aux miniporcs une fois par jour pendant 3 jours.
  3. Après la procédure est terminée, désinfecter la moelle osseuse et synovial site de collecte de fluideavec 0,1% de povidone iodée une fois par jour pendant 3 jours. Observer attentivement tous les jours pour surveiller les signes de complications (par exemple, de l' enflure, du pus, ou rougeur).

9. Cellule phénotypage par cytométrie en flux

  1. Lorsque les cellules souches mésenchymateuses sont de 70 - 80% confluentes à passages 3 - 5, laver les cellules avec du DPBS et les traiter avec 1 ml de 0,25% (v / v) trypsine / EDTA. Ensuite, les incuber à 37 ° C pendant 3 à 5 min jusqu'à ce que les cellules sont décollées.
  2. Récolter les cellules en utilisant 10 ml de DPBS, de les transférer dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger eux à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Jeter la solution surnageante.
  3. Pour fixer les cellules, suspension le culot cellulaire dans 10 ml d'une solution de formaldéhyde à 3,7%, et les conserver à 4 ° C pendant un jour avant l'analyse.
    1. Un jour après la fixation, laver les cellules deux fois avec du DPBS en utilisant une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à chaque fois. Jeter la solution surnageante.
    2. Suspension le culot cellulaire dans 4 mlde DPBS, qui est additionné de 1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA), et incuber le culot pendant 1 heure à 4 ° C pour bloquer les interactions à médiation de Fc non spécifique.
    3. Distribuer des aliquotes de 500 ul de la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 ml.
    4. Pour les anticorps non conjugués (CD29 et Vimentin), laver les cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min. Jeter la solution surnageante.
    5. Suspension le culot cellulaire dans 500 pi d'une dilution 1: 100 de l'anticorps primaire, et incuber pendant 1 heure à 4 ° C.
    6. Laver les cellules deux fois avec 1% de sérum-albumine bovine par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à chaque fois. Jeter la solution surnageante.
    7. Suspension le culot cellulaire dans 500 pi d'une dilution 1: 100 de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et un anticorps secondaire incuber pendant 1 heure dans l'obscurité à 4 ° C.
  4. Pour les anticorps conjugués au FITC (Isotype, CD34, CD44 et CD45), laver les cellules par centrifution à 300 × g pendant 3 min. Jeter la solution surnageante.
    1. Suspension le culot cellulaire dans 500 pi de 1: 100 d'anticorps conjugué au FITC et on incube pendant 1 heure dans l'obscurité à 4 ° C.
    2. Pour les deux conditions de coloration, laver les cellules deux fois avec DPBS par centrifugation à 300 g pendant 5 min à chaque fois. Jeter la solution surnageante.
    3. Suspendre les cellules dans 500 ul de DPBS, de les transférer dans un 5 ml tube rond-bas, et d' analyser les résultats en utilisant un cytomètre de flux 8.

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Résultats

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Mise en place des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse et le liquide synovial de Minipigs

MSCs ont été isolés avec succès à partir de l'os articulations synoviales articulaires des miniporcs osseuse et élargis et in vitro (Figure 2). Seringue d' aspiration du liquide synovial est simple, et il est possible d'obtenir des cell...

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Discussion

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Minipigs ont été utilisés pour établir des MSCs l'isolement de la moelle osseuse et le liquide synovial. Pour éliminer diverses conditions physiologiques, telles que l'âge, le sexe et la maladie, minipigs de donneurs de fond isogéniques ont été choisis pour évaluer avec précision la caractérisation dépend de la source de la cellule. Les porcs sont connus pour être anatomiquement, physiologiquement et génétiquement semblables aux humains, et en particulier, minipigs peuvent produire des organes de taille appariés...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Nous sommes reconnaissants du soutien financier fourni par le programme BioGreen 21 de nouvelle génération (No. PJ007969), l’Administration du développement rural et la Fondation nationale de la recherche (subvention n° NRF-2015R1D1A1A01056639) de la République de Corée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco' avancé s milieu Eagle modifié (ADMEM)Gibco12491-023Milieu de culture MSC
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)Gibco14190-144Milieu de lavage cellulaire, exempt de Ca2+/Mg2+
de veau fœtal (FBS)Gibco16000-044Composant des CSM moyen
GlutamaxGibco35050-061Composant des CSM moyenne
Pénicilline/streptomycineGibco10378-016Composant des CSM milieu
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)SimgaF0291Composant des CSM moyennes
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA6003Composant des CSM moyennes
Trypsine-EDTAGibco25200-072Réactif de dissociation cellulaire  ;
&bêta ;-mercaptoéthanolSigmaM7522Composant des CSM Anticorps isotype moyen
BD PharmingenBD 550616Contrôle des isotypes
Anticorps CD29BD PharmingenBD 552369Intégrine bêta-1 Marqueur des CSM
Anticorps CD44BD PharmingenBD 553133Glycoprotéine de surface cellulaire Marqueur MSCs
Anticorps CD45BD PharmingenBD 340664Marqueur des cellules souches hématopoïétiques
Anticorps CD34BD PharmingenBD 555821Marqueur des cellules souches hématopoïétiques
Anticorps CD90BD PharmingenBD 555595Thy-1 Glycoprotéine membranaire Marqueur MSCs
CMH Anticorps de classe IISanta CruzSC-32247Marqueur de cellules présentatrices d’antigène
Anticorps VimentinSigmaSigma-S6389Filament intermédiaire de type III Marqueur MSCs
Phosphatase alcalinePromegaS3841Mélange de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) et de nitro blue tétrazolium (NBT)
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Centrifugation à gradient de
densité Crépine de celluleBD Falcon35234040 µ ; m Filtre cellulaire en nylon
Tube conique en polystyrène 15 mlBD Falcon351095Collecte d’échantillons et isolement cellulaire
Boîtes de 35 mmNunc153066 Boîte de culture cellulaire
Extracteur de moelle osseuseGmbH Medizintechnologie, Allemagne1145-1W010TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Chambre d’hématocriteMarinfeld640130Chambre de comptage
AtropineJeil Pharmaceutical Co, CoréeSulfate d’atropine Hydrate
AcépromazineSamu Median, CoréeMédicament sédatif et antiémétique pré-anesthésique
MédétomidinePfizerAnesthésique et analgésique
EnrofloxacineBayer Healthcare, AllemagneAntibiotiques
MéloxicamSur la médecine vétérinaire, Anti-inflammatoire et analgésique
IsofluraneHana pharm, CoréeAnesthésie par inhalation
Povidone iode  ;Korea Pharma, CoréeAgent de stérilisation
ÉthanolSigmaE7023Agent de stérilisation
HéparineSigmaH3393Agent anticoagulant
FormaldéhydeSigmaF8775Agent de fixation cellulaire
Pommade ophtalmologique  ;PfizerOxytétracycline HCl avec sulfate de polymyxine B
Couverture d’eau circulanteGaymar IndustriesSystème de réchauffement pendant et après l’anesthésie
Agrafeusecutanée Covidien, USASuture fermeture cutanée
CO2 IncubateurThermo Forma3111Équipement de culture cellulaire
Cytomètre en fluxBD BiosciencesAnalyseur de cellules
MinipigPWG Genetics Korea, Ltd.Porc miniaturede type T
sérum cellulaire du Sud du Sud Argentine du Sud du Sud

Références

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Mots-clés

Synovial Fluid MSCsBone Marrow MSCsMinipig MSC IsolationCell Surface MarkersFlow CytometryDensity CentrifugationIn Vitro CultureAutologous TherapyJoint Disease Models

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