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Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d'enquêter sur l'Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

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DOI :

10.3791/54091

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3 juillet 2016

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1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

Dans cet article

Résumé

La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Un protocole est présenté à recueillir et à décontaminer les carottes de pergélisol des sols et de la glace. L'absence de colonies exogènes et de l'ADN suggèrent que les micro-organismes détectés représentent la matière, plutôt que la contamination par le forage ou le traitement.

Résumé

La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. En fait, ces matériaux congelés pourraient refléter les conditions sur de vastes périodes de temps et l’étude des matériaux biologiques hébergés à l’intérieur pourrait donner un aperçu des environnements anciens. Pour analyser correctement ces écosystèmes et extraire des informations biologiques significatives des sols gelés et de la glace, il est nécessaire de collecter et de traiter correctement les échantillons congelés. Ceci est particulièrement critique pour les analyses microbiennes et d’ADN, car les communautés présentes peuvent être si uniques et différentes des communautés modernes. Ici, un protocole est présenté pour réussir à collecter et décontaminer les carottes congelées. L’absence de colonies utilisées pour doper la surface externe et l’ADN exogène suggèrent que nous avons réussi à décontaminer les carottes congelées et que les micro-organismes détectés provenaient du matériau, plutôt que de la contamination provenant du forage ou du traitement des carottes.

Introduction

La cryosphère (par exemple, les sols du pergélisol, les caractéristiques de la glace, la neige glaciaire, névé et glace) offre un aperçu de ce que les types d'organismes persisté dans des conditions environnementales passées. Étant donné que ces substrats peuvent être des dizaines à des centaines de milliers d'années, leurs communautés microbiennes, lorsque conservés, congelés depuis le dépôt, tenir compte des conditions environnementales anciennes. Pour analyser correctement ces écosystèmes et d'extraire l'information biologique significative des sols gelés et de la glace, une bonne collecte et le traitement des échantillons congelés est nécessaire. Ceci est d'une importance capitale que les projections climatiques pour le 21 ème siècle , indiquent la possibilité d'un réchauffement prononcé dans les régions arctiques et subarctiques 1. Plus précisément, l' intérieur de l' Alaska et le Groenland devraient se réchauffer à environ 5 ° C et 7 ° C, respectivement en 2100 2,3. Cela devrait avoir un impact significatif sol et les communautés microbiennes aquatiques et, par conséquent, liéles processus biogéochimiques. On prévoit que les températures plus chaudes et régime des précipitations modifié pour initier la dégradation du pergélisol dans de nombreux domaines 2-5 conduisant potentiellement à un plus épais, décongelé saisonnièrement (actif) couche 6,7, la fonte des sols gelés, et la fonte des masses de glace massifs tels que glace au sol, des coins de glace, et la ségrégation de la glace 8. Cela changerait radicalement les attributs biogéochimiques en plus de la biodiversité des plantes et des animaux dans ces écosystèmes.

glaciaires et du pergélisol sédiments et de glace caractéristiques syngénétiques ont piégé chimique et des preuves biologiques d'un environnement qui représente ce qui y vivait au moment où les caractéristiques formées. Par exemple, dans l'intérieur de l'Alaska, à la fois Illinoisan et le Wisconsin permafrost âgés sont présents et ce pergélisol, en particulier fournit des endroits uniques datant de moderne à 150.000 ans avant le présent (YBP) qui contiennent des preuves biologiques et géochimiques de l'impact des changements climatiques passés sur la biodiversité. Par conséquent, ces sédiments fournissent un enregistrement de la biogéochimie et de la biodiversité sur plusieurs milliers d'années. Étant donné que la région a faibles taux de sédimentation et n'a jamais été englacée, des échantillons intacts sont accessibles pour la collecte et l'analyse, soit le forage verticalement dans le profil du sol ou de forage horizontal dans les tunnels. Plus important encore , nombreux documents existent qui en particulier mettre en évidence les caractéristiques biogéochimiques uniques du pergélisol dans cette région 9-14. Plus précisément, l'application de l'analyse d'ADN pour estimer la présence et l'étendue de la biodiversité dans les deux échantillons de glace et pergélisol existants et anciens permet l'exploration du lien entre les conditions environnementales anciennes et de l'habitat à l'occupation par des organismes spécifiques.

Des études précédentes ont identifié des impacts climatiques sur les mammifères, les plantes et les micro - organismes à partir d' échantillons datant de 50k YBP 11, 15-19, bien que chaque étude a utilisé un differeméthodologie nt à recueillir et à décontaminer les pergélisol ou les carottes de glace. Dans certains cas, les carottes de forage ont été stérilisées 16, 20-21, bien que la méthodologie spécifique n'a pas précisé si les acides nucléiques étrangers ont également été éliminés des échantillons. Dans d' autres études, 15 isolats bactériens (par exemple, Serratia marcescens), ainsi que des microsphères fluorescentes 22 ont été utilisées pour mesurer l'efficacité des procédures de décontamination.

Cette expérience faisait partie d'une étude plus vaste enquête sur les communautés microbiennes à partir d'échantillons de pergélisol remontant à environ 40k YBP. L'objectif spécifique de cette partie de l'étude était de décontaminer avec succès la glace et pergélisol noyaux. À notre connaissance, aucune méthodologie a intégré l'utilisation de solutions conçues pour éliminer les acides nucléiques étrangers et nucléases associés de la partie extérieure des noyaux congelés. Ceci en dépit du fait que ces solutions sont commonly utilisée pour décontaminer l'équipement de laboratoire pour des expériences moléculaires.

Une fois que les noyaux ont été décontaminés, l' ADN génomique a été extrait en utilisant les protocoles mis au point par Griffiths et al. , Et 23 Töwe et al. , 24, quantifié en utilisant un spectrophotomètre, et dilué avec de l' eau stérile, exempte d' ADN pour obtenir 20 ng par réaction. Bactériennes gènes 16S ARNr ont été amplifiés avec des amorces 331F et 797R et sonde BacTaq 25 et 16S archées gènes ARNr ont été amplifiés avec des amorces Arc 349F et Arch 806R sonde et TM Arche 516F 26 dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 600 secondes , suivie de 45 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 57 ° C pendant 60 s et 72 ° C pendant 25 secondes avec une extension finale à 40 ° C pendant 30 secondes. Toutes les réactions de qPCR ont été réalisées en double. Les 20 volumes de réaction de 20 ul inclus ng d'ADN, 10 uM d'amorces, 5 pM de la sonde, et 10 pi de mélange réactionnel de PCR quantitative. normes for qPCR bactérienne et Archaea ont été préparés en utilisant l' ADN génomique de Pseudomonas fluorescens et Halobacterium salinarum, respectivement. Les deux ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique. Chiffres de plaques ont été réalisées et l'ADN a été isolé à partir des cultures. L' ADN génomique a été quantifiée avec un spectrophotomètre avec l'hypothèse d'une et six copies du gène de l' ARNr 16S par génome de H. salinarum et P. fluorescens, respectivement 27-28. le nombre de copies des gènes bactériens et archées ont été calculées sur la base de la courbe standard, log-transformées pour tenir compte des variances inégales entre les traitements, et évalués par ANOVA.

Composition de la Communauté a été déterminée par séquençage du gène de l' ARNr 16S en utilisant des cellules d'écoulement et les technologies d'amplification en pont et en analysant les collectivités 'connaissances quantitatives en écologie microbienne »(29) QIIME. Avant et arrière se lit ont été jointes ensemble et ensuite séquences ont été filtrés, indexés,et des représentants de haute qualité ont été sélectionnés pour l'attribution de novo unités taxonomiques opérationnelles (OTU) par l'alignement de séquence avec une base de données de référence. séquences alignés ont été comparés à une base de données de référence séparée pour l'affectation taxonomique. Une table de OTU niveau phylum a été créé pour déterminer la composition de la communauté générale.

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Protocole

Équipement 1. Préparation et Permafrost Core Collection

  1. préparation de l'équipement et le prélèvement d'échantillons sur le terrain et des engins de conservation
    1. Assembler tarière pour le prélèvement d'échantillons en insérant l'adaptateur d'entraînement dans la partie supérieure du corps et tourner le levier pour le verrouiller en place. Pin le tube adaptateur sur l'adaptateur d'entraînement et la broche du moteur sur le tube de l'adaptateur. Insérer les éléments de coupe sur le canon.
    2. Porter des costumes utilitaires légers, des gants en nitrile, et des masques pour réduire toute contamination des échantillons. Porter une protection auditive et un casque pour la sécurité à l' entrée du tunnel Permafrost (figure 1).
    3. Entrez dans le tunnel et sélectionnez un emplacement pour recueillir les échantillons (figure 1B).
      Remarque: Pour l' emplacement vertical ou horizontal de forage, sélectionnez une zone où il est connu preuve que le matériel est congelé (par exemple, la glace ou pergélisol), il n'y a pas de systèmes à grande racine connus, et il n'y a pas de gravier connue. Enlever toutmatériel végétal vivant de la région avant de recueillir un échantillon. Si le forage verticalement ou horizontalement, sélectionnez une zone qui est relativement plat et accessible avec la vis sans fin.
    4. Préparer un poste de travail en superposant le sol avec une matière plastique qui a été stérilisé à l'isopropanol à 70%, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    5. Placez un 10 cm de chlorure diamètre de polyvinyle (PVC) coupé en deux sur la longueur sur le poste de travail pour fournir un bac pour contenir les noyaux car ils sont retirés de la vis sans fin. Décontaminer le tuyau en PVC avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    6. Près de la station de travail, décontaminer la tarière par pulvérisation avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase. Retirer les solutions de la vis sans fin avec une lingette.
  2. Ice et le pergélisol collecte et le stockage de base
    1. Sélectionnez une zone de la paroi de l'échantillon (voir 1.2.1Remarque).
    2. Décontaminer environ 10 cm de diamètre de la zone de la paroi gelée en l'essuyant avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    3. Surélever la tarière décontaminé à la zone d'intérêt de telle sorte qu'elle est perpendiculaire à la surface de l' échantillon et de commencer le forage dans le visage nettoyé de la paroi (figure 1C, D).
    4. Retirez délicatement la vis sans fin de la zone de prélèvement d'échantillon. Débrancher la vis du moteur et placer la vis au-dessus du tuyau en PVC stérile dans la station de travail propre. Inclinez doucement tarière de telle sorte que les noyaux congelés coulissent sur ​​le tuyau de PVC stérile (figure 1E).
    5. Décontaminer les gants avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    6. Ramassez la glace et pergélisol noyaux avec des gants stériles et de les placer dans des sacs stériles.
    7. Placer les carottes dans une chambre froide ou froide jusqu'à ce qu'ils soient expédiés ou transformés.
    8. ship les noyaux congelés à l'aide de glace sèche pour les maintenir à une température inférieure à 0 ° C.
    9. stocker immédiatement les noyaux à -80 ° C.

2. Permafrost and Ice traitement de base

  1. Préparation du matériel
    1. Préparer, sans feuille stérile d'acide nucléique robuste en aluminium, étagères métalliques, verrerie, pinces métalliques, et de la laine de verre par cuisson dans un four à 450 ° C pendant 4 heures. Mettez de côté ces matériaux jusqu'à leur utilisation.
    2. Stériliser 95% d'éthanol et de l'eau ultrapure en faisant passer les solutions à travers un filtre de 0,22 um.
    3. solution d'éthanol de magasin à -20 ° C et de l'eau à 4 ° C.
    4. Stériliser une règle en plastique par pulvérisation avec 70% d'éthanol, une solution d'ADN de décontamination et la solution de décontamination RNase et en essuyant immédiatement après chaque solution.
  2. Culture bactérienne Préparation
    1. Préparer le bouillon et les plaques à croître Serratia marcescens.
      1. Pour le bouillon, mélanger 5 g essayerptone, 1 g de glucose, 5 g d'extrait de levure et 1 g de phosphate de potassium dibasique et de l'eau puis distillée pour atteindre add 1 L. Pour fabriquer des plaques, ajouter 15 g d'agar au mélange ci-dessus. Pour bouillon et plaques, ajuster le pH à 7 et autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
    2. Préparer 1x solution saline de phosphate meulé (PBS) en combinant 8 g de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potassium, 1,44 g de phosphate dibasique de sodium et 0,24 g de phosphate de potassium monobasique et d'ajouter de l'eau distillée pour atteindre 800 ml. Ajuster le pH à 7,4 et ajouter de l'eau distillée pour atteindre 1 L. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
    3. Ensemencer le bouillon avec une boucle stérile en plongeant dans la S. culture marcescens qui a déjà été stocké congelé à -80 ° C. Dans des conditions aseptiques, la culture diluée en série en ajoutant 1 ml de la culture à 9 ml de PBS et inverser manuellement la solution. Ajouter 1 ml de cette dilution dans 9 ml de PBS et inverser manuellement la solution. Répétez huit autres fois jusqu'à ce qu'une dilu 10 -9tion est atteinte.
    4. Répartir les 10 -6, -7 10, 10 -8 et 10 -9 solutions sur des plaques de gélose en distribuant 1 ml de bouillon sur la plaque et la diffusion avec un épandeur cellulaire. Pour ce faire, en triple exemplaire par dilution. Conserver la culture d'origine à 4 ° C.
    5. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 heures. Compter le nombre de colonies pour calculer le nombre de cellules dans la culture d'origine. Note: Le nombre de colonies dans la culture d'origine dépendra du taux de bactéries de croissance.
    6. Pipet 250 ul de la culture d'origine dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile. Diluer la culture d' origine en ajoutant un volume suffisant du 1 x PBS pour obtenir environ 10 9 cellules / ml , comme déterminé par comptage des colonies dans l'étape précédente. Sédimenter les cellules dans un tube de microcentrifugation par centrifugation à 2500 xg pendant 10 min.
      Remarque: Le volume de PBS 1x variera en fonction du taux de bactéries de croissance.
    7. Dans un biohood stérile, Pipeter hors du bouillon et remettre les cellules dans 1 ml 1x tampon PBS. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation ou environ deux mois.
    8. Le jour du traitement, on dilue le S. la culture de l' étape 2.2.7 marcescens par addition de 1 ml de S. originale marcescens culture à 39 ml de PBS 1x tampon dans un tube de centrifugation de 50 ml.
  3. Préparer l'espace de chambre froide pour le traitement de base et du matériel de conservation
    1. Avant de refroidissement de la chambre froide, nettoyer les murs, les planchers, et table en métal avec une solution d'eau de Javel à 1%.
    2. Réglez la température de la chambre froide à environ -11 ° C.
    3. Une fois que la chambre froide a atteint la température désirée, porter des vêtements légers de service, des gants en nitrile, et des masques pour réduire toute contamination de la chambre froide et les échantillons.
      Note: Deux individus bien habillés sont nécessaires pour cette procédure.
    4. Apportez les matériaux stériles (par exemple, une feuille d'aluminium, étagères métalliques, verrerie, plateau, S. marcescens culture et milame crotome) et des échantillons dans la chambre froide et les placer sur la table stérile.
  4. Permafrost et de la glace de traitement de base dans une installation de chambre froide
    1. Placer un noyau de pergélisol sur la libre une feuille stérile, d'acide nucléique de papier d'aluminium.
    2. Légèrement inoculer à l'extérieur du noyau avec la culture diluée de S. marcescens en utilisant un bouchon de mousse stérile (figure 2B).
    3. Placer le noyau sur la grille métallique stérile qui se trouve au-dessus d'un bac.
    4. Stériliser la lame de microtome en acier avec 70% d'éthanol, une solution d'ADN de décontamination et la solution de décontamination RNase.
    5. Avoir un nitrile individuel propre gants avec 70% d'éthanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase et maintenez-core à un angle de 45 ° au-dessus du plateau.
    6. Avoir individuel B gratter doucement environ 5 mm de l'extérieur de l'ensemble de base, y compris les extrémités, en utilisant la lame stérile tandis que la personne A transforme le noyau après chaque scrape ( Figures 2C et 3A, B). Essuyer la lame avec 70% d'éthanol, une solution d'ADN de décontamination et la solution de décontamination RNase selon les besoins.
    7. Avoir individuel B verser stérilisée par filtration éthanol à 95% sur le noyau soigneusement et rapidement, tandis que la personne A transforme le noyau que la solution est versée (Figures 2D, 3C).
    8. Avoir individuel B laver immédiatement le noyau avec de l'eau stérilisée par filtration.
    9. Remettre la grille en métal utilisé sur le plateau avec un nouveau support métallique stérile.
    10. Avoir individuel A nettoyer ses gants en nitrile avec 70% d'éthanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase et maintenir le noyau à un angle de 45 ° au-dessus du plateau.
    11. Avoir individuel B pulvériser l'ensemble du noyau avec une solution d'ADN de décontamination.
    12. Avoir individuel B laver immédiatement le noyau avec de l'eau stérilisée par filtration.
    13. Avoir individuel B pulvériser l'ensemble du noyau avec une solution de décontamination RNase.
    14. Avoir Individual B laver immédiatement le noyau avec de l'eau stérilisée par filtration.
    15. Placez le noyau sur une feuille stérile de papier d'aluminium et envelopper légèrement.
  5. noyau externe Thaw
    1. Placer une grille stérile métallique sur un récipient en verre stérile dans un biohood stérile à flux laminaire.
    2. Placer deux plaques d' agar spécifiques à S. marcescens dans le plat en verre au- dessous du support stérile pour recueillir le liquide du noyau (Figure 2F).
    3. Placez le noyau sur la grille métallique stérile.
    4. Laisser environ 2-5 mm de la surface externe du noyau décongeler à 23 ° C (en moyenne, cela aura lieu dans environ 10 min). Tournez le noyau d'environ 90 ° toutes les 2 min.
    5. Swab surface entière du noyau à l' aide de pinces stériles et laine de verre stérile et inoculer deux plaques de gélose spécifique à S. marcescens par écouvillonnage ces matériaux sur la surface des plaques. Inoculer deux nouvelles plaques avec la culture d'origine utilisé pour doper l'extérieur de lanoyau qui a été exposée aux basses températures de la chambre froide.
    6. Mesurer les dimensions extérieures du noyau cylindrique décongelés en plaçant une règle stérile près, mais ne pas toucher le noyau.
    7. Placez le noyau dans un grand sac stérile et le stocker à -80 ° C.
  6. Vérifiez la croissance
    1. Incuber les plaques de gélose à 23 ° C pendant une semaine.
    2. Examiner des plaques d' agar pour la croissance de S. colonies marcescens.
      1. S'il n'y a pas de colonies visibles sur la plaque, passez à l'étape 2.5.3.
      2. Si les colonies apparaissent sur la plaque, répétez l'étape 2.1.1 dans la section 2 "Permafrost et de la glace de traitement de base».
    3. Obtenir le noyau du congélateur et aseptique transférer à un sac stérile.
    4. Conserver le noyau dans un sac stérile à 4 ° C pendant environ 24-48 heures pour dégeler le noyau entier.

3. Obtenir sous-échantillon pour l'extraction des acides nucléiques à partir de carottes de glace et pergélisol

  1. Extraction des acides nucléiques à partir des carottes de glace
    1. Mélanger le matériau décongelé de la carotte de glace en agitant doucement le sac (figure 2G).
    2. Verser le produit décongelé dans un récipient stérile avec un filtre de 0,22 um sous vide pour recueillir les micro-organismes.
    3. retirer le filtre aseptique avec des pinces stériles et placez-le dans un 2 ml tube de perles en céramique stérile (1,4 mm).
    4. Conservez le filtre à -80 ° C.
  2. Extraction des acides nucléiques à partir des carottes de pergélisol
    1. Mélanger le matériau décongelé à partir du noyau de pergélisol en malaxant doucement le sac.
    2. Après le pergélisol a été bien mélangé, obtenir un sous-échantillon d'environ 0,5 g de sol en vrac avec un scoopula stérile et le placer dans un stérile 2 ml tube de perles à vis de capuchon en céramique taré (1,4 mm) qui se trouve à la verticale sur un équilibre.
    3. souséchantillons Conserver à -80 ° C.
    4. Obtenir le contenu d'échantillons d'eau gravimétrique.
      1. Mesurer 10 g du pergélisol avec un sterile scoopula et les placer dans une boîte taré sur une balance. Mesurer la masse humide de pergélisol et de l'étain.
      2. Incuber permafrost dans un four réglé à 105 ° C pendant 24 heures. Mesurer la masse sèche du pergélisol et de l'étain.
      3. Calculer la teneur en eau gravimétrique en soustrayant la masse humide du pergélisol par la masse sèche du pergélisol et en divisant par la masse sèche du pergélisol.
    5. permafrost de magasin à -80 ° C.

4. Extrayez Nucleic Acids de Permafrost and Ice Cores

  1. préparation du matériel
    1. Préparer des fioles ambrées pour maintenir des solutions par traitement avec 0,1% de diéthyle (DEPC), incubation O / N à 37 ° C, et autoclavage.
    2. Préparer une solution de tampon phosphate de potassium 240 mM. 2. ajouter 5 g de phosphate de potassium monobasique et 38,7 g de phosphate de potassium dibasique. Ajuster le volume final à 500 ml par addition d'eau stérile.
    3. Préparer le bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB) extraction buffer par dissolution de 4,1 g de chlorure de sodium dans 80 ml d'eau, et en ajoutant lentement 10 g de CTAB tout en chauffant et en agitant. Ajuster le volume final à 100 ml par addition d'eau stérile.
    4. Ajouter des volumes égaux de solution de tampon phosphate et le tampon CTAB et stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 um. Couvrir la bouteille avec du papier d'aluminium et conserver à la température ambiante.
    5. Préparer une solution 1,6 M de chlorure de sodium (NaCl) en combinant de l'eau stérile, 9,35 g de NaCl et 100 ml. Ajouter 10 g de polyéthylèneglycol 8000 à la solution et stériliser par filtration 1,6 M de NaCl. Conserver à 4 ° C.
  2. L' extraction d'acide nucléique selon une version modifiée de Griffiths et al. , Et 22 Töwe et al. 23
    1. Porter des costumes utilitaires légers, des gants en nitrile, et des masques. espace de laboratoire propre et pipettes avec 70% d'éthanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    2. Retirer souséchantillon (filtre à partir de carottes de glace ou de l'échantillon de sol permafrost) dans 2 ml perle en céramique vis-catube de p de -80 ° C congélateur et décongeler à la température ambiante.
    3. Ajouter 0,5 ml de bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB) tampon d'extraction et de vortex brièvement.
    4. Ajouter 0,5 ml d'alcool phénol-chloroforme-isoamylique (25: 24: 1) (pH 8) et agiter les tubes horizontalement pendant 10 min en utilisant un adaptateur à écran plat sur un vortex.
    5. Après bourrelet battant, des tubes de centrifugation à 16.100 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    6. Enlever la couche aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml stérile et mélanger avec un volume égal d'alcool chloroforme-isoamylique (24: 1). Centrifugeuse à 16.100 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    7. Enlever la couche aqueuse dans un nouveau tube stérile de 1,5 ml et ajouter deux volumes de 30% de polyéthylène glycol 8000 et 1,6 M de NaCl. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C.
    8. Centrifugeuse à 16.100 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    9. Laver granulés d'acide nucléique avec environ 500 pi de glace froide éthanol à 70% et centrifuger à 16100 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    10. Air culot sec dans un biohood stérile pendant 2 heures. Remettre en suspension dans un tampon de 50 ul de DNase / RNase-TE (pH 8,0). L'ADN est prêt pour les applications en aval telles que la PCR et qPCR.
    11. Déterminer la concentration de l'ADN avec un spectrophotomètre.
    12. Diluer l'ADN avec de l'eau stérile, exempte d'ADN pour atteindre 20 ng par réaction.

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Résultats

La méthode présentée peut être utilisée pour décontaminer les échantillons congelés prélevés dans divers environnements cryosphère, de la glace glaciaire au pergélisol. Ici, nous présentons des données spécifiquement collectées à partir d' échantillons de glace et pergélisol recueillies à partir de la recherche en génie et Centre de développement - régions froides Laboratoire de recherche et d' ingénierie (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel situé à Fox, AK (figure 1A ...

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Discussion

La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Bien que les taxons récupéré peut ne pas représenter la communauté historique complète, ceux récupérés à partir de l' analyse des échantillons de glace et pergélisol glaciaires peuvent donner des informations historiques précieuses sur des périodes de temps sélectionnez 15-16. Par exemple, l' information biologique significatif a été établi à partir d' études de glace enquêtant s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Centre de recherche et de développement du génie de l’armée américaine, Bureau du programme de recherche fondamentale. L’autorisation de publier ces informations a été accordée par le chef des ingénieurs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70 % d’isopropanolWalmart551116880
95 % d’alcool éthylique (dénaturé)  ;Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
Solution de décontamination de l’ADN, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
Solution de décontamination de la RNase, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA  ;7002
Combinaisons légèresKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Gants en nitrileFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Masques antivirauxCurad, WalgreensCUR3845
stériles  ;Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Lame de microtome en acier  ;B-sharp Microknife, Wake Forest, NC
Support en métalfabriqué à CRREL, Hanovre, NH
PlateauHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Feuille d’aluminiumWestern Plastics, Temecula, CA
Bouteille de 500 ml avec 0,22  ; &mu ; m FilterCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Hotte de biosécuritéNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Boîte de PétriFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlucoseFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Extrait de levureFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Phosphate dipotassiqueJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Sparks, MD214530
NanoDrop 2000 SpectrophotomètreUV-VisThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
em>Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
em>Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Kit d’isolement de l’ADN microbienMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Protection auditiveElvexEP-201
Casque de
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Laine de verrePyrex430330
Règle
Pesant Étain  ;Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Chlorurede sodium Sigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Chlorure de potassiumJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Phosphate de potassium, monobasiqueJT Baker, Phillipsburg, NJ  ; 3246-01
Phosphate de potassium dibasiqueJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Phosphate de sodium dibasique anhydreFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
50 ml Tubes à centrifugerCorning, Corning, NY4558
Tubes à centrifuger 2 mlMoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
Tubes à billes en céramique de 2 ml (1,4 ml mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Hexadecyltrimethylammoniamide (CTAB)  ;Acros Organics, NJ22716-5000
Polyéthylène glycol 8000²Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Alcool phénol-chloroforme-isoamylique (25:24:1) (pH 8)  ;Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrifugeuseEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Alcool chloroforme-isoamylique (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipettesRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 et 1 000 µ ; l pipettes
Pointes de pipetteRainin, Woburn, MARainin LTS préstérilisé, à faible rétention, pointes filtrées, 10, 20, 200, 1 000  ; et micro ;
VortexorScientific Industries, Bohemia, NYG-560
Adaptateur VortexMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Bouteille transparenteCorning, Corning, NYC1395500
Bouteille ambréeCorning, Corning, NYC5135250
Filtres pour bouteilles, 0.22  ; et micro ; mCorning, Corning, NY430513
Seringue de 60 mlBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Filtres pour seringue Millex, 0,22 &mu ; mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70 % d’éthanolFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500dilué et stérilisé par filtre
Four Isotemp 100 LFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Épandeur de cellulesFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Boucles d’inoculation jetablesFisher Scientifique, Pittsburgh, Pennsylvanie22-363-602
Sacs d’échantillons<<sécuritél

Références

  1. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
  2. Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
  3. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
  4. Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
  5. Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
  6. Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
  7. Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
  8. Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
  9. Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020(2006).
  10. Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603(2007).
  11. Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
  12. Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
  13. Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
  14. Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
  15. Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
  16. Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
  17. Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
  18. Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
  19. Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
  20. Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
  21. Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
  22. Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
  23. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  24. Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
  25. Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
  26. Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
  27. Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
  28. Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647(2012).
  29. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  30. Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
  31. Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
  32. Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
  33. Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
  34. Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042(2010).
  35. Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
  36. Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
  37. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  38. Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
  39. Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).

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