Article de méthode

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un In Vivo Tissue Chambre Ingénierie

DOI :

10.3791/54099

⸱

30 mai 2016

 ,  ,  ,  , 
1O'Brien Institute Department, St Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Surgery, University of Melbourne, 3Faculty of Health Sciences, Australia Catholic University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il s’agit d’une ligne directrice pour la construction de tissus vascularisés in vivo à l’aide d’une boucle artérioveineuse microchirurgicale ou d’une configuration pédiculaire à écoulement continu à l’intérieur d’une chambre d’ingénierie tissulaire. Les tissus vascularisés générés peuvent être utilisés pour la régénération des organes et le remplacement des défauts tissulaires, ainsi que pour les tests de médicaments et la modélisation des maladies.

Résumé

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En chirurgie reconstructive, il existe un besoin clinique pour une alternative aux méthodes actuelles de reconstruction autologue qui sont complexes, coûteux et le commerce un défaut pour un autre. L'ingénierie tissulaire détient la promesse de répondre à cette demande croissante. Cependant, la plupart des stratégies d'ingénierie tissulaire ne parviennent pas à générer des substituts de tissus stables et fonctionnels en raison de la mauvaise vascularisation. Ce document met l' accent sur ​​une in vivo ingénierie tissulaire modèle de chambre de vascularisation intrinsèque où une artère et une veine perfusée soit comme une boucle artérioveineuse ou une configuration de pédicule accréditive est dirigé dans une chambre creuse protégée. Dans ce système à base de chambre germination angiogénique se produit à partir des vaisseaux artério-veineuses et ce système attire la migration cellulaire endogène ischémique et inflammatoire entraîné qui remplit progressivement l'espace de chambre avec le tissu fibro-vasculaire. cellulaire exogène / matrice implantation au moment de la construction de la chambre améliore la cellule survival et détermine la spécificité des tissus d'ingénierie qui se développent. Nos études ont montré que ce modèle de chambre peut générer avec succès différents tissus tels que la graisse, le muscle cardiaque, le foie et d'autres. Cependant, des modifications et des améliorations sont nécessaires pour assurer le tissu cible formation est cohérente et reproductible. Cet article décrit un protocole normalisé pour la fabrication de deux modèles de la chambre de l' ingénierie tissulaire vascularisé différentes in vivo.

Introduction

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Fabricating tissu vascularisé fonctionnelle en utilisant une approche d'ingénierie tissulaire est un nouveau paradigme dans la médecine régénérative. 1,2 De nombreuses approches pour concevoir un tissu nouveau et sain pour le remplacement des tissus lésés ou organes défectueux ont été développés, 3-6 expérimentalement dans des modèles animaux de petite taille avec potentiel clinique prometteur. 7,8 Cependant, vascularisation reste l' un des grands défis pour l' ingénierie tissulaire limitant son potentiel de croissance des tissus de taille cliniquement pertinente. 9

Les approches actuelles de vascularisation des tissus soit suivre une voie extrinsèque où de nouveaux vaisseaux se développent à partir du lit vasculaire bénéficiaire et envahissent tout le tissu implanté construit 10 ou une voie de vascularisation intrinsèque où la vascularisation grandit et se développe à l' unisson avec le tissu nouvellement en développement. 11 L'approche extrinsèque implique habituellement des cellules d'ensemencement sur un échafaudagein vitro et l' implantation de la construction complète dans l'animal vivant dans l'espoir que les nutriments, précédemment fournis par les milieux de culture, sera provient de la circulation. 12,13 Le concept est simpliste que la croissance interne vasculaire est trop lent et les implants très minces (< 1-2 mm d'épaisseur) restera viable. Fournir des éléments nutritifs et de l' oxygène au moyen d'une vascularisation suffisante et rapide est au cœur de toutes les tentatives réussies pour cultiver des substituts du génie tissulaire plus complexes et plus grands tels que les os, les muscles, la graisse et les organes solides. 14,15 vascularisation Intrinsic offre le potentiel de les grandes constructions de développer par la croissance progressive des tissus en rapport avec son approvisionnement en sang en pleine expansion. Une conception est l'implantation in vivo dans une chambre d'un pédicule vasculaire avec ou sans un échafaudage tête de série de cellules. 5,6 Cela a ouvert la voie à de nouvelles procédures pour la production de tissus plus épais intrinsèquement vascularisées. 16,17

Plus récemment, des stratégies ont été développées pour des greffes de tissus, avant l'implantation pré-vascularisation. Ces réseaux de vaisseaux sanguins intégrés sont destinés à inosculate avec des navires d'accueil à l' implantation permettant la mise à disposition rapide d'un approvisionnement en sang complet pour améliorer la survie de toutes les parties d'une greffe de tissu épais transplanté. 18

Nous avons lancé un modèle in vivo vascularisé en ingénierie tissulaire chez les petits animaux qui comporte une semi-rigide chambre fermée d'implantation sous - cutanée contenant un pédicule vasculaire perfusé et des biomatériaux contenant des cellules. La chambre crée un environnement ischémique qui stimule la germination angiogénique des vaisseaux implantés. 3 Le pédicule vasculaire peut être soit une boucle artérioveineuse reconstruite ou une artère accréditive intacte et de la veine. 3-6,19 Ce vasculaires pousses pédiculaires un de fonctionnement et une vaste artério -capillary-veineuse réseau qui relie à la fois l'arteriole veineuse et se termine avec le pédicule vasculaire. 3,20- En outre, la chambre de support creux entourant protège le tissu se développant à partir des forces mécaniques déformant potentiellement et prolonge le disque ischémique pour améliorer la vascularisation. 3,21,22 Si le pédicule de la cuve est simplement implanté dans tissu normal et non pas à l'intérieur de l'espace protégé de la chambre, la germination angiogénique cesse le long de la même ligne de temps comme une blessure normale et aucun nouveau tissu accumulera autour du pédicule. Les enquêteurs ont utilisé cette configuration in vivo pour produire des constructions de tissu en trois dimensions fonctionnelles vascularisées avec vascularisation de soutien et de la taille cliniquement pertinente. 4,23 En outre, les constructions de tissus vascularisés ingénierie avec son pédicule vasculaire intact peuvent être récoltées pour une transplantation ultérieure au site de la lésion . 24,25 Un scénario plus cliniquement réalisable serait de créer la chambre sur le site définitif pour la reconstruction sette comme la poitrine. Ainsi, ce tissu de novo approche d'ingénierie pourrait avoir un potentiel clinique pour fournir une nouvelle source de tissu cible fonctionnelle pour la chirurgie reconstructive 26-28.

Le protocole suivant constitue un guide général pour la construction d' une chambre d'ingénierie tissulaire vascularisé in vivo chez le rat, ce qui pourrait être adapté à différents modèles animaux et utilisé pour examiner les procédés complexes de l' angiogenèse, la production de matrice et de la migration et la différenciation cellulaire.

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Protocole

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Les protocoles décrits ici ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de Melbourne Hospital de St. Vincent, en Australie et ont été menées dans le strict respect des lignes directrices australiennes du Conseil national de la santé et de la recherche médicale.

NOTE: Deux protocoles de chambre sont décrits ci-dessous. Les deux modèles différents et leurs conceptions spécifiques de la chambre sont illustrés sur la figure 1. Chambre (1) est réalisé en polycarbonate (pour le modèle de chambre de la boucle de artérioveineuse chez le rat). Il est cylindrique avec un diamètre intérieur de 13 mm et une hauteur de 4 mm. Une fenêtre à un moment donné dans le mur permet un accès sans entrave pour le pédicule. Dans le second modèle (pour accréditive rat modèle de chambre de pédicule), la chambre est faite de polyacrylique et est rectangulaire (10 x dimensions 8 x 4 mm 3 internes). Il dispose de deux ouvertures de 1,5 mm sur les côtés opposés pour recevoir l'artère et la veine fémorales comme ils transgressent la chambre.

1. Rat artério Boucle Chambre Modèle (One Chamber par animal)

NOTE: Avant de commencer la chirurgie, assurez-vous que tous les instruments ont été correctement stérilisés. De même, assurer la instruments reposent sur des serviettes stériles et sont à une distance raisonnable du champ chirurgical pour éviter toute contamination lors de la procédure.

  1. Préparation de l'animal pour la chirurgie
    1. Utiliser des rats pesant au moins 250 g pour leur grande taille des navires pour la création de la boucle artérioveineuse.
    2. Anesthésier l'animal avec 4% inhalation isoflurane. Corroborer profondeur suffisante de l'anesthésie en évaluant l'insensibilité aux pieds-pincement. Après l'anesthésie, garder l'animal anesthésié de façon adéquate tout au long de la procédure avec 2% d'isoflurane.
    3. Placez l'animal dans une position couchée sur un coussin chauffant et appliquer du lubrifiant stérile pour les yeux pour éviter la dessiccation pendant la chirurgie.
    4. L'utilisation d'un rasoir électrique, de se raser les deux aines et enlever les poils avec un morceau de gaze humide.
    5. Prep les sites chirurgicaux avec chlorhexidine/ Solution d'éthanol à 70% et draper l'animal avec des serviettes stériles. Administrer une dose unique de carprofène (5 mg / kg par voie sous-cutanée), comme analgésique.
  2. Récolte de la veine fémorale Graft
    1. En utilisant une lame # 15, faire une incision de 4 cm de la peau sur l'aine gauche parallèle au ligament inguinal. Ceci expose le coussinet adipeux inguinal.
    2. Couper à travers le coussinet adipeux circonférentiellement avec des ciseaux en laissant attaché à son pédicule vasculaire sur la base des vaisseaux épigastriques.
    3. Utilisation de micro ciseaux, libérer les adhérences du tissu conjonctif vaporeux entre la paroi abdominale et vaisseaux fémoraux sous-jacents.
    4. Placer un écarteur sur la paroi abdominale et tirez dedans. Ceci expose le ligament inguinal et la longueur totale des vaisseaux fémoraux.
    5. Utilisation de micro pince et ciseaux courbes disséquer la veine épigastrique et l'isoler de sa graisse environnante en tirant et en coupe doucement. Cette veine agit comme une attache lors de la construction de la boucle.
    6. Using micro pinces et micro ciseaux courbes ouvrir la gaine périvasculaire contenant les vaisseaux fémoraux et nerveux tout le chemin du ligament inguinal à son extrémité distale de la bifurcation vers la branche épigastrique.
    7. Utilisation de micro pince, ramasser la veine fémorale par son adventice et doucement séparer des tissus environnants et accompagnant l'artère. Pour ce faire, avec des micro pinces et courbes rondes pointes ciseaux micro en tirant le tissu en dehors et en coupant à travers elle.
      REMARQUE: Ne jamais saisir toute l'épaisseur de la paroi de la veine, car cela pourrait causer un traumatisme à l'intima qui le rend vulnérable à la thrombose.
    8. branches ligaturer latérales trouvées lors de la dissection avec une suture 10/0 de nylon ou de les coaguler avec un coagulateur bipolaire.
    9. Avec la veine fémorale complètement libre, ligaturer ses extrémités proximale et distale avec des sutures en soie 4/0. Assurez-vous d'obtenir une greffe de veine d'au moins 10 mm de longueur et comprend environ 0,5 cm de longueur de la branche épigastriques à utiliser comme une attache de câble de haubanagepour maintenir la boucle ouverte dans la chambre.
    10. Utilisation de micro pinces et ciseaux micro droites, couper l'adventice à partir des extrémités de la greffe en tirant doucement et couper. Cela peut aussi être fait plus tard, avant anastomoses microchirurgie.
    11. Rincer la greffe de veine avec une solution saline héparinée (10 U / ml d'héparine) et laisser reposer dans la solution. Fermez la plaie en utilisant un fonctionnement continu 4/0 suture de soie ainsi que deux ou trois points de suture interrompues simples supplémentaires.
  3. Création de artério Boucle et Implantation de la Chambre
    1. Répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.4 de la même manière exacte sur le membre controlatéral.
    2. Utilisation de micro pince, disséquer et d'isoler à la fois l'artère épigastrique et la veine former le coussinet adipeux environnant. Pour ce faire, en tirant doucement le tissu loin des vaisseaux
    3. Utilisation de micro pince, ramasser l'artère fémorale par son adventice et la libérer des tissus environnants. Pour ce faire, avec des micro pinces et micro ronde pointue incurvéeciseaux ro en tirant le tissu en dehors et en coupant à travers elle. Ligaturer ou coaguler ses branches latérales.
    4. Ligaturer l'artère et la veine fémorale distale par rapport à l'apparition des vaisseaux épigastriques 4/0 en utilisant une suture de soie.
    5. Placer une seule pince proximalement sur chacune de l'artère et la veine fémorale. L'utilisation d'un micro ciseaux droite forte, faire une transversale propre coupe dans chaque distale du vaisseau à l'émergence des branches épigastriques. Placez un contraste en plastique fond stérile sous les vaisseaux.
    6. Rincer les récipients vigoureusement avec des quantités généreuses de sérum physiologique héparinisé jusqu'à ce que tout le sang est retiré de la lumière.
    7. Apportez la greffe de veine dans le champ opératoire et de supprimer toute adventice redondante à partir des extrémités des navires comme pour l'étape 1.2.10, si nécessaire.
    8. Effectuer les deux anastomoses microchirurgie avec suture 10/0 en nylon. Anastomose à l'extrémité proximale de la greffe de veine de la veine fémorale et l'extrémité distale de l'artère fémorale. Cela va permettre au sang de circuler felon artériel du côté veineux sans résistance de valves à l'intérieur du greffon veineux.
      REMARQUE: Assurez-vous que les vaisseaux fémoraux et la veine du greffon reste dans leur position naturelle sans rebondissements.
    9. Vérifier les fuites sur les deux sites anastomotiques. Résoudre les petites fuites, qui ressemblent non pulsatoire du sang sortant du site de l'anastomose, en plaçant un petit morceau de graisse sur le dessus et en comprimant doucement pendant 5-10 min. fuites pulsantes plus grands qui inondent rapidement le champ entier auront besoin des points supplémentaires.
    10. Vérifier la perméabilité de la boucle de artérioveineuse. occlusion douce de l'artère fémorale doit faire rétrécir alors que le même dans la veine fémorale devrait engorge elle.
    11. Placez la base de la chambre de l'ingénierie tissulaire dans la boucle artérioveineuse avec ce dernier repos dans sa position naturelle sans torsions ou Kinks.
    12. Fixez la base de la chambre du ligament inguinal et le fascia du muscle sous-jacent avec 6/0 sutures en nylon.
    13. Placez le couvercle sur labase de sorte que les vaisseaux fémoraux pénètrent dans la chambre à travers une encoche (fenêtre dans le côté de la chambre). Lors de la fermeture du couvercle, assurez-vous qu'il attrape les branches épigastriques, entre la base de la chambre et le couvercle, qui agissent comme des longes pour tenir la boucle artérioveineuse en position.
    14. Fermez la plaie en utilisant un fonctionnement continu 4/0 suture de soie ainsi que deux ou trois points de suture interrompues simples supplémentaires.
    15. Permettre à l'animal de se remettre de l'anesthésie sur un coussin chauffant.
    16. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. De même, ne pas retourner un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. 24 heures plus tard, administrer une autre dose unique de carprofène (5 mg / kg, sous-cutanée) comme analgésique.
    17. Traiter la plaie avec un onguent antibiotique topique pendant 5 jours. Si la plaie est ouverte, anesthésier l'animal comme à l'étape 1.1.2 par 1.1.5 et fermer la plaie comme dans 1.3.14. Surveiller la santé des animaux par jour. Euthanasier l'animal en utilisant une dose létale d'injection de lethabarb intrapéritonéale (163 mg / kg dans 0,25 ml par 23 aiguille G) si l'animal montre plus d'un des signes modérés de inacitivity, manque d'appétit, perte de poids et la perte de couleur.

2. accréditives Pédicule Chambre (Deux Chambers par animal)

  1. Préparation de l'animal pour la chirurgie
    1. Répétez les étapes 1.1.1 à 1.1.4. Deux chambres peuvent être implantés dans les deux régions de l'aine d'un seul rat.
  2. Isolement des vaisseaux fémoraux et insertion de la Chambre
    1. Répétez les étapes 1.2.1 à travers 1.2.8.
    2. Avec à la fois artère et la veine complètement libéré des tissus environnants et leurs branches ligaturées, amener la chambre dans le champ opératoire.
    3. Placez chacun des vaisseaux fémoraux intacts sur la fente correspondante de la base de la chambre en vous assurant qu'il n'y a pas de torsions ou Kinks.
    4. Fermez la chambre par collage desng du couvercle à la base. Fermez la plaie en utilisant un fonctionnement continu 4/0 suture de soie ainsi que deux ou trois points de suture interrompues simples supplémentaires et permettre à l'animal de récupérer comme décrit précédemment.

3. Récolte des chambres et traitement des tissus

  1. Une fois les points de temps de l'expérience (4-6 semaines après l'implantation) sont atteints, anesthésier l'animal comme à l'étape 1.1.2 et répétez les étapes 1.1.3 à travers 1.1.5.
  2. Ouvrez la plaie à l'aide d'une lame # 15 et couper à travers les tissus avec des ciseaux jusqu'à ce que la chambre est complètement exposé.
  3. Exposer les vaisseaux fémoraux proximale à la construction et l'essai pour la perméabilité vasculaire: obturer doucement le vaisseau avec deux microforceps, puis le lait le sang dans une direction distale et enfin libérer la pince proximale. Si le navire se remplit de sang nouveau, ce qui confirme la perméabilité. Ligaturer les vaisseaux fémoraux proximalement dans le cas de la boucle de artérioveineuse et à la fois proximale et distale dans le cas d'ee accréditive configuration, et enlever les chambres avec le tissu contenant en bloc.
  4. A la fin de l'expérience, l'euthanasie de l'animal à l'aide d'une dose létale d'injection lethobarb intrapéritonéale (163 mg / kg dans 0,25 ml par 23 aiguille G).
  5. Fixer les tissus de paraformaldéhyde 4% à la température ambiante pendant 24 heures. Tissus Divisez en plusieurs sections transversales (1-2 mm d' épaisseur) et incorporer dans de la cire de paraffine ou optimal composé de température de coupe pour coupes en paraffine (5 um) ou des coupes congelées (10 um), respectivement. 3,4,8,17,22, 24
  6. Effectuer une coloration histologique de routine tels que l'hématoxyline et de l'éosine pour examiner la morphologie générale des tissus. Effectuer une coloration immunohistochimique avec un anticorps spécifique pour identifier le type cellulaire d'intérêt, par exemple 3,4,8,17,22,24,29 troponine T cardiaque immunocoloration pour cardiomyocytes.

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Résultats

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La création microchirurgicale de tissus chambres d'ingénierie a été réalisée comme décrit dans le protocole ci-dessus. Les tissus générées à l' intérieur des chambres peuvent être examinées histologiquement comme décrit dans l' étape du protocole 3. Divers types de tissus ont été fabriqués avec succès en utilisant la chambre vascularisé in vivo (figure 2). Ceux - ci comprennent le tissu cardiaque avec des cardiomyocytes de rat nouveau - né (figure 2A),

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Discussion

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Ingénierie de la microcirculation est actuellement étudiée essentiellement à travers deux approches. La première consiste à développer un réseau vasculaire fortement interconnecté au sein de la construction in vitro de telle sorte que lorsqu'ils sont implantés, les capillaires du lit vasculaire de l' hôte se connecter avec ceux de la transplantation de construire à travers un processus appelé anastomose, assurant ainsi la livraison de nutriments non seulement à la périphérie , mais également sur ​​le no...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les subventions du NHMRC et la Fondation médicale Stafford Fox. Les auteurs reconnaissent l'assistance chirurgicale de Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos et Amanda Rixon du Experimental médicale et Unité de chirurgie, Hôpital St. Vincent, Melbourne. Un soutien est également fourni par le Département du gouvernement de l'État de Victoria Innovation, Industrie et du Programme d'appui aux infrastructures opérationnelles de développement régional.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 Scalpel 15 LamesBraunBB515
1 Pince Adson DentiqueBraunBD527R
1 Porte-AiguilleBraunBM201R
1 Coagulateur Bipolaire  ;BraunUS335
1 Porte-Micro-Aiguille B-15-8.3S & T00763
1 Micro Pince Dilatatrice D-5A.2S & T00125
1 Micro Pince de bijoutier JF-5S & T00108
1 Micro ciseaux - Droit SAS-11S & T00098
1 Micro ciseaux - Courbe SDC-11S & T00090
2 Pinces simples B-3S & T00400
2 10/0 suture en nylonS & T03199
1 6/0 suture en nylonBraunG2095469
2 4/0 Sutures en soieBraunC0760145
Xilocaïne 1 %Dealmed15073310 mg/ml
Héparine sodiqueDealmed2723015 000 UI/ml
Ringer LactateBaxterJB2323500 ml
1 génie tissulaire en forme de dôme chambresur
1 chambre d’écoulementsur mesure Lectin
I, Griffonia Simplicifolia  ;Laboratoires VecteursB-11051,67 &mu ; g/ml
Troponine Tanticorps Abcam Ab82954 &mu ; g/ml
Anticorps Ku80 spécifique à l’hommeAbcamAb805920,06 &mu ; g/ml
Anticorps anti-DesminDakoM07602.55 &mu ; g/ml
Cell Tracker CM-DiI colorantThermo Fisher ScientificC-70003 mg/106 cellules
Lethabarb (pentobarbital sodique)figure-materials-1figure-materials-2
mesure

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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