Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’utiliser des liposomes cationiques/anioniques avec un peptide neuro-ciblant comme système d’administration du SNC pour permettre aux siRNA de traverser la BHE. L’optimisation d’un système d’administration pour les traitements, comme les siRNA, permettrait davantage d’options de traitement pour les prions et d’autres maladies neurodégénératives.

Résumé

Les maladies à prions résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale (PrP^C) en un isomère anormal résistant à la protéase appelé^{PrP Res}. L’émergence de maladies à prions dans les populations d’animaux sauvages et leur menace croissante pour la santé humaine ont conduit à des efforts accrus pour trouver un traitement contre ces maladies. Des études récentes ont trouvé de nombreux composés anti-prions qui peuvent soit inhiber l’isomère infectieux PrP^Res, soit réguler à la baisse la protéine prion cellulaire normale. Cependant, la plupart de ces composés ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique pour inhiber efficacement la formation de^{PrP Res dans les} tissus cérébraux, ne ciblent pas spécifiquement la PrP^C neuronale et sont souvent trop toxiques pour être utilisés chez des sujets animaux ou humains.

Nous avons cherché à savoir si le siRNA délivré par voie intravasculaire et ciblé sur la PrP^C neuronale est un composé anti-prion plus sûr et plus efficace. Ce rapport décrit un protocole pour produire deux véhicules d’administration liposomale de siRNA, et pour conditionner et délivrer des siRNA PrP aux cellules neuronales. Les deux véhicules d’administration liposomale sont 1) la formulation de liposomes à siARN complexifiés à l’aide de liposomes cationiques (LSPC) et 2) la formulation de liposomes à siARN encapsulés à l’aide de liposomes cationiques ou anioniques (PALETS). Pour les LSPC, l’ARNi chargé négativement est lié électrostatiquement au liposome cationique. Un peptide chargé positivement (RVG-9r [glycoprotéine du virus de la rage]) est ajouté au complexe, qui cible spécifiquement les complexes liposomes-siARN-peptides (LSPC) à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) jusqu’aux neurones exprimant l’acétylcholine dans le système nerveux central (SNC). Pour les PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), les lipides cationiques et anioniques ont été réhydratés par le siRNA PrP. Cette procédure aboutit à l’encapsulation de l’ARNi dans les liposomes cationiques ou anioniques. Encore une fois, le neuropeptide RVG-9r était lié aux liposomes pour cibler les complexes siRNA/liposomes vers le SNC. En utilisant ces formulations, nous avons réussi à délivrer des siRNA PrP aux neurones exprimant AchR, et à diminuer l’expression de PrP^C des neurones dans le SNC.

Introduction

Les prions sont des maladies neurodégénératives graves qui affectent le système nerveux central. Les maladies à prion résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale, la ^PrPc, par un isomère infectieuse appelée PrP ^Res. Ces maladies touchent une grande variété d'espèces , y compris l' encéphalopathie spongiforme bovine chez les vaches, la tremblante du mouton, la maladie du dépérissement chronique chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l' homme ^1-3. Prion provoquent la neurodégénérescence qui commence par la perte synaptique, et progresse vers vacuolisation, gliose, perte neuronal....

Protocole

Toutes les souris ont été élevées et maintenues au laboratoire des ressources animales, agréés par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International, conformément aux protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université d'État du Colorado.

1. Préparation de LSPCs

1. En utilisant un mélange 1: 1 DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane): Taux de cholestérol pour LSPCs. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2 nmoles de DOTAP et 2 nmoles de cholestérol dans 10 ml d'un mélange 1: solution de....

Résultats

Pour augmenter l'efficacité de l'ARNsi à l'intérieur de l'encapsulation PALETS anioniques, l'ARNic a été mélangé avec de la protamine. Pour déterminer la meilleure concentration de protamine pour l'ARNsi, l'ARNic a été mélangé avec différentes concentrations de protamine, de 1: 1 à 2: 1 (figure 3A). Il y avait un rendement d'encapsulation ARNsi de 60 à 65% dans des liposomes anioniques sans l'utilisation de la protamine. Les échantillons ayant des rapports molaires: prot.......

Discussion

Ce rapport décrit un protocole pour créer deux systèmes d'administration ciblés qui transporte efficacement siRNA au SNC. Les procédés antérieurs de prestation ARNsi au système nerveux central inclus l'injection des vecteurs de siRNA / shRNA directement dans le cerveau, l'injection intraveineuse de siRNA ciblé, ou injection intraveineuse de complexes de liposomes ARNsi non ciblées. Injection de vecteurs de siRNA / shRNA dans le système nerveux central ne provoque une diminution du taux d'expression de la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DOTAP lipide	Avanti Lipides	890890
Cholestérol	Avanti Lipides	700000
DSPE	Avanti Lipides	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipides	880125
Chloroforme	Fisher Scientific	AC268320010
Méthanol	EMD Millipore	113351
N2 Gaz	AirGas
Saccharose	Fisher Scientific	S5-500
Extrudeuse	Avanti Lipids	610023
1,0, 0,4 et 0,2 μ ; filtres m	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
Sulfate de protamine	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	Aliquote à usage unique
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	Aliquote à usage unique
40 μ ; m Filtre cellulaire	Fisher Scientific	08-771-1
Rat anti-souris CD16/CD32 Fc block	BD Pharmigen	553141
Anticorps anti-PrP (PRC5)	Exclusif - PRC