Article de méthode

Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

DOI :

10.3791/54106

⸱

23 juillet 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

Dans cet article

Résumé

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L’objectif de ce protocole est d’utiliser des liposomes cationiques/anioniques avec un peptide neuro-ciblant comme système d’administration du SNC pour permettre aux siRNA de traverser la BHE. L’optimisation d’un système d’administration pour les traitements, comme les siRNA, permettrait davantage d’options de traitement pour les prions et d’autres maladies neurodégénératives.

Résumé

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Les maladies à prions résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale (PrPC) en un isomère anormal résistant à la protéase appeléPrP Res. L’émergence de maladies à prions dans les populations d’animaux sauvages et leur menace croissante pour la santé humaine ont conduit à des efforts accrus pour trouver un traitement contre ces maladies. Des études récentes ont trouvé de nombreux composés anti-prions qui peuvent soit inhiber l’isomère infectieux PrPRes, soit réguler à la baisse la protéine prion cellulaire normale. Cependant, la plupart de ces composés ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique pour inhiber efficacement la formation dePrP Res dans les tissus cérébraux, ne ciblent pas spécifiquement la PrPC neuronale et sont souvent trop toxiques pour être utilisés chez des sujets animaux ou humains.

Nous avons cherché à savoir si le siRNA délivré par voie intravasculaire et ciblé sur la PrPC neuronale est un composé anti-prion plus sûr et plus efficace. Ce rapport décrit un protocole pour produire deux véhicules d’administration liposomale de siRNA, et pour conditionner et délivrer des siRNA PrP aux cellules neuronales. Les deux véhicules d’administration liposomale sont 1) la formulation de liposomes à siARN complexifiés à l’aide de liposomes cationiques (LSPC) et 2) la formulation de liposomes à siARN encapsulés à l’aide de liposomes cationiques ou anioniques (PALETS). Pour les LSPC, l’ARNi chargé négativement est lié électrostatiquement au liposome cationique. Un peptide chargé positivement (RVG-9r [glycoprotéine du virus de la rage]) est ajouté au complexe, qui cible spécifiquement les complexes liposomes-siARN-peptides (LSPC) à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) jusqu’aux neurones exprimant l’acétylcholine dans le système nerveux central (SNC). Pour les PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), les lipides cationiques et anioniques ont été réhydratés par le siRNA PrP. Cette procédure aboutit à l’encapsulation de l’ARNi dans les liposomes cationiques ou anioniques. Encore une fois, le neuropeptide RVG-9r était lié aux liposomes pour cibler les complexes siRNA/liposomes vers le SNC. En utilisant ces formulations, nous avons réussi à délivrer des siRNA PrP aux neurones exprimant AchR, et à diminuer l’expression de PrPC des neurones dans le SNC.

Introduction

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Les prions sont des maladies neurodégénératives graves qui affectent le système nerveux central. Les maladies à prion résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale, la PrPc, par un isomère infectieuse appelée PrP Res. Ces maladies touchent une grande variété d'espèces , y compris l' encéphalopathie spongiforme bovine chez les vaches, la tremblante du mouton, la maladie du dépérissement chronique chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l' homme 1-3. Prion provoquent la neurodégénérescence qui commence par la perte synaptique, et progresse vers vacuolisation, gliose, perte neuronale, et les dépôts de plaque. Finalement, ce qui entraîne la mort de l'animal / personne 4. Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les composés destinés à ralentir ou arrêter la progression de la maladie du prion. Cependant, les chercheurs ont pas trouvé soit une thérapie réussie ou un véhicule de livraison systémique efficace.

L' expression endogène de PrP C est nécessaire pour le développement des maladies à prion 5 . Par conséquent, en diminuant ou en éliminant l' expression PrP C peut entraîner un retard ou l' amélioration de la maladie. Plusieurs groupes ont créé des souris transgéniques avec des niveaux réduits de PrP C ou lentivecteurs injectés exprimant shRNA directement dans le tissu cérébral murin pour étudier le rôle des niveaux d'expression de la PrP C dans les maladies à prions. Ces chercheurs ont constaté la réduction de la quantité de neurones PrP C ont donné lieu à l' arrêt de la neuropathologie progressive des maladies à prions et prolongé la durée de vie des animaux 6-9. Nous avons signalé que les résultats de traitement PrP C siRNA de la clairance de la PrP Res dans les cellules de neuroblastome de souris 10. Ces études suggèrent que l'utilisation des thérapies pour réduire les niveaux d'expression de la PrP C, comme des petits ARN interférents (siRNA), qui clive l' ARNm, peut suffisamment retarder la progression des maladies à prions. Cependant, la plupart des thérapies étudiées pour les maladies à prions ont été livrées d'une manière qui ne serait pas pratiquedans un contexte clinique. Par conséquent, une thérapie par ARNsi a besoin d'un système d'administration systémique, qui est délivré par voie intraveineuse et ciblée vers le système nerveux central.

Chercheurs ont étudié l'utilisation de liposomes en tant que véhicules de délivrance pour des produits de thérapie génique. Des lipides cationiques et anioniques sont utilisés à la fois dans la formation des liposomes. Des lipides cationiques sont plus largement utilisés que les lipides anioniques, car la différence de charge entre le lipide cationique et l'ADN / ARN permet un conditionnement efficace. Un autre avantage de lipides cationiques est celle qu'ils traversent la membrane cellulaire plus facilement que d' autres lipides 11-14. Cependant, les lipides cationiques sont plus immunogènes que les lipides anioniques 13,14. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à passer de l'aide cationique anioniques lipides dans des liposomes. Les produits de thérapie génique peuvent être efficacement emballés dans des liposomes anioniques , en utilisant le sulfate de protamine peptide chargé positivement, qui condense les molécules d' ADN / ARN 15-19. Depuis lipi anioniqueds sont moins immunogènes que les lipides cationiques , ils peuvent avoir une augmentation des temps de circulation, et peuvent être plus tolérés dans des modèles animaux 13,14. Les liposomes sont ciblés vers des tissus spécifiques en utilisant des peptides de ciblage qui sont attachés à des liposomes. Neuropeptide RVG-9R, qui se lie à des récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine, a été utilisé pour cibler l' ARNsi et des liposomes au système nerveux central 17-20.

Ce rapport décrit un protocole pour produire trois véhicules de livraison de siRNA et d'emballer et de livrer le siRNA aux cellules neuronales (Figure 1). les complexes liposome-siRNA peptide (LSPCs) sont composées de liposomes avec l'ARNsi et RVG-9R peptide ciblant électrostatiquement fixés sur la surface extérieure du liposome. Peptide thérapeutique encapsulé dans des liposomes adressé siRNA (PALETS) sont composés d'ARNsi et la protamine encapsulé dans le liposome, avec RVG-9R lié de manière covalente à des groupes de lipides PEG. En utilisant les méthodes ci-dessous pour générer LSPCs et PALETS, PrP C siRNA diminue PrP C expression jusqu'à 90% dans les cellules neuronales, qui détient la promesse énorme pour guérir ou retarder l'apparition de la pathologie de la maladie du prion sensiblement.

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Protocole

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Toutes les souris ont été élevées et maintenues au laboratoire des ressources animales, agréés par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International, conformément aux protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université d'État du Colorado.

1. Préparation de LSPCs

  1. En utilisant un mélange 1: 1 DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane): Taux de cholestérol pour LSPCs. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2 nmoles de DOTAP et 2 nmoles de cholestérol dans 10 ml d'un mélange 1: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme.
  2. S'évaporer 9 ml de chloroforme et une solution de methanol en utilisant du N2 gazeux sous une hotte aspirante. Evaporer les dernières 1 ml de solvant dans une hotte nuit sans gaz. Observer un mince film de lipide sur le fond du flacon.
  3. Chauffer 10 ml d'une solution de saccharose à 10% à 55 ° C.
  4. Verser la solution de saccharose à 10% chauffé sur le film lipidique mince lentement, soit 1 ml / min, tandis que GEtourbillonnant ntly le ballon. Maintenir le saccharose à 10% et d'un flacon avec les lipides à 55 ° C, de sorte que les molécules de lipides restent dans la phase gel-liquide. Résultats de réhydratation dans des vésicules (MLV) formation multilamellaire.
  5. Laisser les lipides se réhydrater à 55 ° C pendant au moins une heure avant le dimensionnement des liposomes.
  6. Assembler une extrudeuse selon les instructions du fabricant avec 1,0 um filtres ou utiliser des filtres de seringue 1,0 um pour le dimensionnement.
  7. Ajouter 1 ml de la suspension de liposomes chauffé à une des seringues à l'extrudeuse, et passer la suspension entre les deux seringues de 11 fois. Assurez-vous que la suspension est dans la seringue opposée à la seringue de départ après 11 passes.
  8. Taille des liposomes à nouveau de 0,45 um puis 0,2 um filtres pour générer de grandes vésicules unilamellaires (LUV). Gardez la suspension de liposomes chauffé pour faciliter le dimensionnement.
  9. Incuber 20 ul de 4 nmol suspension de liposomes (200 um) avec 200 ul d'une 20 um (4totale nmol) de solution mère de siRNA pendant 10 min à température ambiante.
  10. Incuber 80 ul d'un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r disponible avec la solution / liposome siRNA pendant 10 min à température ambiante. LSPCs doivent être utilisés le plus tôt possible, mais peuvent être utilisés jusqu'à plusieurs heures après la préparation. LSPCs Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation.

2. Préparation de PALETS

  1. Utiliser un 55 ratio molaire 5 de l'une ou l'autre DSPE (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine): 40 cholestérol: DSPE-PEG ou de DOTAP: cholestérol: DSPE-PEG pour PALETS. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2,2 nmol de chacune DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de cholestérol, et 0,2 nmoles de DSPE-PEG dans 10 ml d'un mélange 2: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme.
  2. Préparer suspension de liposomes exactement comme décrit à l'étape 1.1 et 1.2 ci-dessus. Réhydrater les liposomes DSPE dans 10 ml de 1 x PBS chauffé à 75 ° C, en ajoutant 1 ml / min. Laisser les lipides se réhydrater à 75 ° C pendant aumoins 1 h avant de dimensionner.
  3. Taille de la suspension de liposomes exactement comme décrit à l'étape 1,6-1,8.
  4. Pipet 20 pi de chacune des 4 nmole (200 uM) suspensions de liposomes en aliquots à usage unique après DOTAP et DSPE liposomes ont été de taille, et lyophiliser pendant 30 minutes en utilisant un lyophilisateur de paillasse (Figure 2).
  5. Incuber 200 pi d'un 20 uM (4 au total nmole) stock solution siRNA avec 1,4 ul d'une solution de 26,6 uM de sulfate de protamine pendant 10 min à température ambiante pendant siRNA qui doit être encapsulé dans des liposomes DSPE Palets.
  6. Réhydrater les liposomes DOTAP Palets avec 200 pi d'une solution à 4 actions nmole de siRNA ou réhydrater liposomes DSPE Palets avec 201,4 pi de la solution / protamine siRNA. Incuber la solution / ARNsi de liposomes pendant 10 min à température ambiante.
  7. Ajouter 10 ul d'un 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), une solution 60 mM à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE.
  8. Ajouter 10 ul d'une 150 mM de N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) solution à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE.
  9. Incuber EDC et sulfo-NHS avec le / suspension de liposomes siRNA pendant 2 heures à la température ambiante.
  10. Incuber 80 ul d'un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r actions avec le siRNA / liposome solution pendant 10 min à température ambiante de réticulation.
    NOTE: L'ECD / sulfo-NHS permet au RVG-9r pour lier de manière covalente aux lipides PEG. Utilisez PALETS au sein de plusieurs heures après la préparation. PALETS Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation.
  11. Pour déterminer siRNA encapsulation efficacité de PALETS:
    1. Mesurer la concentration de l'ARNsi avant et après l'addition de protamine et des liposomes en utilisant un spectrophotomètre réglé à 260 nm.
    2. Filtrer le ARNsi non encapsulée dans le liposome / encapsulée suspension ARNsi en utilisant des filtres centrifuges 50 kDa. Centrifuger à 1000 xg pendant 20 min.
    3. Mesurer la concentration deARNsi non encapsulée dans le filtrat et la concentration de l'ARNsi encapsulé dans le rétentat à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm.

3. Injecter Souris avec LSPCs ou PALETS

  1. Exposer les souris pendant 5 à 10 min à une lampe chauffante pour dilater le système vasculaire.
  2. Anesthetize souris avec un 2-3% isofluorane / oxygène flux 5-10 min avant l'injection, et pendant l'injection. Confirmer anesthetization lorsque l'animal est plus ambulant et la respiration ont ralenti en faisant une pincée d'orteil. Placez la souris sur le dos ou sur le côté pour accéder à la veine de la queue. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement sous anesthésie.
  3. Essuyez / pulvériser la queue avec 70% EtOH et injecter 300 pi de LSPCs ou PALETS sur la veine de la queue de la souris à l'aide d'une seringue à insuline G 26. Commencer à injecter distalement dans la veine de la queue et de se déplacer proximalement si la veine s'effondre ou ruptures.
  4. Placez la souris dans une cage propre jusqu'à ce qu'elle maintient décubitus sternale. Ne placez pas moutiliser avec d'autres compagnons de cage jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré. Les souris doivent récupérer en 5 à 15 min. Ils peuvent être placés sur un coussin chauffant ou sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps si la récupération prend plus de temps. Les souris doivent être étroitement surveillés pour se protéger contre la surchauffe.
  5. Surveiller les animaux plusieurs heures après l'injection pour assurer l'anesthésie se dissipe, et il n'y a pas de mauvais effets du traitement. Permettre aux LSPCs ou PALETS de circuler pendant au moins 24 heures.

4. Analyse de l'expression des protéines par l'intermédiaire de cytométrie en flux

  1. Euthanasier souris avec un débit de 20% de CO 2 pendant 15 min.
  2. Disséquer un demi-hémisphère du cerveau en coupant la peau et le crâne de la souris à l'aide de ciseaux. Peler la moitié d'un hémisphère de cerveau loin du crâne à l'aide de pinces ou la fin d'une paire de ciseaux.
  3. Presser la moitié d'un hémisphère de cerveau de chaque souris à travers un tamis de maille 40 um en utilisant 2,5 ml de tampon FACS (1x; Du PBS, 1% de sérum bovin fœtal, 10 mM d'EDTA) dans une boîte de Petri avec le piston d'une seringue.
  4. Rincer la crépine cellulaire et boîte de Pétri avec un 2,5 ml supplémentaires de tampon FACS. Mettre la suspension monocellulaire dans un tube conique de 15 ml sur de la glace.
  5. Distribuer 100 ul de 5 ml seule suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 5 min à 350 x g. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS. Spin à 350 g pendant 5 min. Répéter l'opération avec un autre 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
  6. Incuber les cellules dans 100 ul de dilution 1: 100 d'une solution à 0,5 mg / ml de rat bloc Fc anti-souris dans un tampon de FACS pendant 30 à 60 minutes sur de la glace. Pellet et laver les cellules comme dans l'étape 4.5. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
  7. Incuber les cellules dans 100 ul d'une 20 pg / ml d' anticorps fluorescent contre les souris PrP C dans le sérum de la souris 7% dans un tampon FACS sur la glace pendant 30 à 60 min. Pellet et laver les cellules comme dans l'étape 4.5. Gardez la suspension cellulairesur la glace.
  8. Pellet et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RBC (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM NaHCO 3, EDTA 0,1 mM) pendant 1 min. Pellet à l'étape 4.5 et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
  9. Analyser la PrPc expression en utilisant un cytomètre en flux comme décrit précédemment 10. Porte cellules de la population cellulaire totale vit. Porte PrP C + cellules de la population de cellules vivantes pour déterminer MFI (intensité de fluorescence de la médiane).

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Résultats

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Pour augmenter l'efficacité de l'ARNsi à l'intérieur de l'encapsulation PALETS anioniques, l'ARNic a été mélangé avec de la protamine. Pour déterminer la meilleure concentration de protamine pour l'ARNsi, l'ARNic a été mélangé avec différentes concentrations de protamine, de 1: 1 à 2: 1 (figure 3A). Il y avait un rendement d'encapsulation ARNsi de 60 à 65% dans des liposomes anioniques sans l'utilisation de la protamine. Les échantillons ayant des rapports molaires: prot...

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Discussion

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Ce rapport décrit un protocole pour créer deux systèmes d'administration ciblés qui transporte efficacement siRNA au SNC. Les procédés antérieurs de prestation ARNsi au système nerveux central inclus l'injection des vecteurs de siRNA / shRNA directement dans le cerveau, l'injection intraveineuse de siRNA ciblé, ou injection intraveineuse de complexes de liposomes ARNsi non ciblées. Injection de vecteurs de siRNA / shRNA dans le système nerveux central ne provoque une diminution du taux d'expression de la...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Nous tenons à remercier les sources de financement suivantes : le programme de formation en recherche translationnelle sur les maladies infectieuses de la CSU (ID :TRTP) et le programme de subventions de recherche des NIH (R01 NS075214-01A1). Nous tenons à remercier le laboratoire Telling pour l’utilisation de son anticorps monoclonal PRC5. Nous tenons également à remercier le laboratoire Dow pour les liposomes DOTAP et pour le partage de leur expertise dans la génération de liposomes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DOTAP lipideAvanti Lipides890890
CholestérolAvanti Lipides700000
DSPEAvanti Lipides850715
DSPE-PEGAvanti Lipides880125
ChloroformeFisher ScientificAC268320010
MéthanolEMD Millipore113351
N2 GazAirGas
SaccharoseFisher ScientificS5-500
ExtrudeuseAvanti Lipids610023
1,0, 0,4 et 0,2 μ ; filtres mAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
Sulfate de protamineFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquote à usage unique
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquote à usage unique
40 μ ; m Filtre cellulaireFisher Scientific08-771-1
Rat anti-souris CD16/CD32 Fc blockBD Pharmigen553141
Anticorps anti-PrP (PRC5)Exclusif - PRC

Références

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Mots-clés

D livrance de siRNAformulation liposomalebarri re h mato enc phaliqueliposomes cationiquespeptide RVG 9rsiRNA contre PrPciblage neuronalcytom trie en fluxinjection par la veine caudale

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