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Article de méthode

Génome Édition dans

7.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/54113

⸱

20 juin 2016

 ,  , 
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

la mutagenèse du gène de ciblage est maintenant possible dans une large gamme d'organismes en utilisant des techniques de montage du génome. Ici, nous démontrons un protocole pour la mutagenèse du gène ciblé utilisant l' activateur de la transcription comme nucléases effectrices (Talens) dans Astyanax mexicanus, une espèce de poisson qui comprend les poissons de surface et cavefish.

Résumé

Identifier les allèles des gènes sous-jacents au changement évolutif est essentiel pour comprendre comment et pourquoi l’évolution se produit. À cette fin, de nombreux travaux récents se sont concentrés sur l’identification de gènes candidats pour l’évolution des traits chez une variété d’espèces. Cependant, jusqu’à récemment, il a été difficile de valider fonctionnellement des gènes candidats intéressants. Des outils récemment développés pour le génie génétique permettent de manipuler des gènes spécifiques dans un large éventail d’organismes. L’application de cette technologie dans des organismes pertinents pour l’évolution permettra d’obtenir un aperçu sans précédent du rôle des gènes candidats dans l’évolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) est une espèce de poisson avec des formes habitant à la surface et dans des grottes. De multiples lignées indépendantes de formes cavernicoles ont évolué à partir de poissons de surface ancestraux, qui sont interfertiles les uns avec les autres et avec les poissons de surface, permettant d’élucider la base génétique des traits des grottes. A. mexicanus a été utilisé pour un certain nombre d’études évolutives, y compris l’analyse de liaison pour identifier les gènes candidats responsables d’un certain nombre de caractères. Ainsi, A. mexicanus est un système idéal pour l’application de l’édition du génome afin de tester le rôle des gènes candidats. Ici, nous rapportons une méthode d’utilisation de nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) pour faire muter des gènes dans la surface d’A. mexicanus. L’édition du génome à l’aide de TALEN chez A. mexicanus a été utilisée pour générer des mutations dans les gènes de pigmentation. Cette technique peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats pour un certain nombre d’autres traits qui ont évolué dans les formes grottes d’A. mexicanus.

Introduction

Comprendre la base génétique de l'évolution caractéristique est un objectif de recherche critique des biologistes évolutionnistes. Des progrès considérables ont été accomplis dans l' identification des loci sous - tendent l'évolution des traits et d' identifier des gènes candidats au sein de ces loci (par exemple 1-3). Cependant, le test fonctionnel du rôle de ces gènes est restée difficile que de nombreux organismes utilisés pour l'étude de l'évolution des traits ne sont actuellement pas génétiquement traitable. L'avènement des technologies de l'édition du génome a considérablement augmenté manipulabilité génétique d'un large éventail d'organismes. Transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens) et regroupés régulièrement espacées répétitions courtes palindromiques (de CRISPRs) ont été utilisés pour générer des mutations ciblées dans des gènes dans un certain nombre d'organismes (par exemple 4-11). Ces outils, appliqués à un système évolutionnaire pertinent, ont le potentiel de révolutionner le chemin biologistes évolutionnistes étudier la base génétique de l'évolution.

Astyanax mexicanus est une espèce de poisson qui existe sous deux formes:. Un (poissons de surface) de la rivière-logement sous forme de surface et de multiples formes cavernicoles (de cavefish) A. mexicanus cavefish a évolué à partir d' ancêtres de poissons de surface (revue dans 12). Les populations de poissons cavernicoles ont évolué un certain nombre de traits , y compris la perte d'yeux, de diminuer ou de la perte de la pigmentation, nombre de papilles gustatives et neuromastes crâniens, et les changements accru de comportement tels que la perte du comportement de la scolarité, l' augmentation de l' agressivité, des changements dans l' alimentation posture et hyperphagie 13 -19. Cavefish et les poissons de surface sont interfécondes, et des expériences de cartographie génétique ont été réalisées pour identifier les gènes loci et candidats pour les caractères de la grotte 1,20-26. Certains gènes candidats ont été testés pour un rôle fonctionnel dans la contribution aux caractéristiques des cavernes dans la culture cellulaire 1,19, dans des organismes modèles d'autres espèces 21 ou 27 par une surexpression ou knock - down temporaire uchanter morpholinos 28 A. mexicanus. Cependant, chacune de ces méthodes a des limites. La capacité de générer des alleles mutants de ces gènes chez A. mexicanus est essentiel pour la compréhension de leur fonction dans l'évolution de cavefish. Ainsi, A. mexicanus est un organisme candidat idéal pour l' application des technologies de modification du génome.

Nous présentons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus utilisant TALENs. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la mosaïque injectée fondateur du poisson pour les phénotypes et pour isoler les lignes de poissons avec des mutations stables dans les gènes d'intérêt 29.

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Protocole

Toutes les procédures d'animaux étaient en conformité avec les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de l'Iowa et l'Université du Maryland.

1. TALEN Conception

  1. Entrée souhaitée séquence cible à un site Web de conception TALEN. (Par exemple: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrée choisie longueurs de tableau entretoise / répétition.
    1. Copiez la séquence génomique dans la case "Séquence".
    2. Dans l'onglet "Fournir personnalisé Spacer / RVD Longueurs" sélectionner la longueur d'espacement et longueur du tableau.
      Remarque: Les longueurs Spacer de 15 paires de bases, et répéter longueurs de réseaux de 15-17 fonctionnent bien et rendre l'assemblage moins complexe.
  2. Sélectionnez une paire TALEN. paires Talen conçus autour d'un site unique d'enzyme de restriction permettent pour le génotypage par l'enzyme de restriction digestionun produit de PCR.
  3. Concevoir des amorces pour amplifier la région génomique entourant le site cible TALEN au moyen d' un site Web tel que Primer3 30-32. Lors de génotypage avec une enzyme de restriction, les amorces de conception pour amplifier une région qui contient le site d'enzyme de restriction qu'une seule fois. Il est recommandé que cette région est amplifiée et séquencée avant la construction TALEN pour identifier les polymorphismes présents dans A. mexicanus population de laboratoire à utiliser pour microinjection.

2. Assemblée TALEN (Modifié à partir du protocole TALEN Kit) 33,34

Pour plus de détails et de dépannage, voir le protocole 34.

  1. Préparer et séquencer les plasmides nécessaires à partir du kit TALEN selon les instructions du fabricant.
  2. Mettre en place le # 1 des réactions pour les réactions A et B Inclure répéter variables diresidues (DRV) 1-10 et pFUS_A vecteur de destination dans la réaction A. Inclure DRV 11- (N-1) et evecteur e destination pFUS_B (N-1) dans la réaction B où N est le nombre total de DRV dans le TALEN.
    1. Ajouter à chaque réaction: 1 pi de chaque plasmide contenant chaque DRV (100 ng / ul), le vecteur de destination (100 ng / pl), 1 pl Bsa I des enzymes de restriction, 1 ul de sérumalbumine bovine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampon 10 x de ligase et x ul d'eau pour un volume total de 20 ul. Par exemple, voir le tableau 1.
      Remarque: Les demi-réactions peuvent également être utilisés.
    2. Placez les réactions dans un thermocycleur et exécuter le cycle: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
  3. Incuber les réactions avec la nucléase. Pour chaque réaction ajouter 1 pl 25 mM ATP et 1 ul nucléase. Incuber réactions à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. Transformer les réactions.
    1. Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes.
      Note: Homemade c compétenteaunes peuvent être utilisés. Cependant, les cellules ayant une faible compétence peuvent entraîner un manque de colonies.
      1. Mélanger 2,5 pi de la réaction avec 25 pi de cellules chimiquement compétentes. Incuber sur la glace pendant cinq minutes. Incuber les cellules pendant 30 secondes à 42 ° C.
      2. Placer les tubes sur la glace pendant 2 min. Ajouter 125 pi de bouillon de Super optimale avec répression catabolique (SOC). Agiter les tubes à 37 ° C pendant 1 heure.
    2. Plaque 100 ul de cellules transformées sur des plaques LB contenant de la spectinomycine (50 pg / ml), X-gal et isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG). Cultivez O / N à 37 ° C.
  5. Choisissez 2-3 colonies blanches pour chaque réaction et vérifier par colonie PCR utilisant des amorces pCR8_F1 et pCR8_R1 (tableau 2).
    1. Faire un mélange maître des réactifs. Par exemple, voir le tableau 3.
    2. Choisissez une colonie et de l'étaler dans le fond d'un tube PCR, puis mettre les restes de la colonie dans 2 ml de LB avec spectinomycine(50 ug / ml). Placer 15 ul du mélange maître dans le tube avec la colonie.
    3. Exécutez le programme de PCR suivant (tableau 4)
    4. Vérifiez la PCR (exécuter la totalité du volume) sur un gel agarose à 1,5% par électrophorèse. Les clones corrects auront une bande à la taille attendue ainsi qu'un frottis et une échelle de bandes. Pour un exemple du frottis approprié, voir 34,33.
    5. Cultivez 2 ml de cultures des clones corrects dans des milieux LB O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation.
  6. Miniprep les plasmides selon les instructions du fabricant.
  7. Séquence pour vérifier la séquence TALEN avec pCR8_F1 et pCR8_R1. Suivez les méthodes 35 décrites précédemment.
  8. En utilisant les clones corrects vérifiées par séquençage, mis en place la réaction # 2 (kit TALEN), qui placera les DRV des vecteurs A et B et la DRV finale dans le vecteur de destination.
    1. Préparer mélange pour la réaction 2 (Tableau 5).
      Note: HaLes réactions lf peuvent être utilisés.
    2. Placez les réactions dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
  9. Transformer les réactions.
    1. Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes.
      1. Mélanger 2,5 pi de la réaction avec 25 pi de cellules chimiquement compétentes. Incuber sur la glace pendant 5 min. Choc thermique des cellules pendant 30 secondes à 42 ° C.
      2. Placer les tubes de la glace. Ajouter 125 pi de SOC. Placer les tubes dans un incubateur sous agitation à 37 ° C pendant 1 heure.
    2. Plaque 100 ul de cellules transformées sur des plaques LB avec l'ampicilline (100 pg / ml), X-gal et IPTG. Cultivez O / N à 37 ° C
  10. Choisissez 1-3 colonies blanches pour chaque réaction et vérifier par colonie PCR utilisant des amorces TAL_F1 et TAL_R2 (tableau 2).
    1. Préparer une solution de la polymerase Mastermix, l'eau et amorcesdécrit dans le tableau 3. Choisissez une colonie et de l' étaler dans le fond d'un tube PCR, puis mettre les restes de la colonie dans 2 ml de LB avec de l' ampicilline (100 pg / ml). Placer 15 ul de la solution dans le tube de la colonie.
    2. Exécuter le programme de PCR (tableau 6).
    3. Vérifier la PCR sur un gel d'agarose à 1,5% par électrophorèse. Les clones corrects auront un étalement et une échelle de bandes. Pour un exemple du frottis approprié, voir 34,33.
    4. Cultivez 2 ml de cultures des clones corrects dans des milieux LB O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation.
  11. Miniprep les plasmides selon les instructions du fabricant.
  12. Séquence pour vérifier la séquence TALEN avec TAL_F1 et TAL_R2 suivant les méthodes 35 décrites précédemment.

3. ARNm de transcription de TALENs

  1. Digest 4 pg de modèle de séquence vérifiée avec 2 pi Sac I pendant 2 heures à 37 ° C.
  2. Essai 2 pi du plasmide digéré par Sacl sur un gel d'agarose à 1,5% par électrophorèse. Plasmides qui sont correctement digérées afficheront une seule bande.
  3. On purifie le reste du plasmide digéré par Sac I suivant le protocole de PCR kit de purification. Laver deux fois avec la solution de lavage avant l'élution. Eluer dans 30 pi d'eau sans nucléase.
  4. Suivez le protocole standard pour la production T3 ARNm.
    1. Mettre en place des réactions de la moitié en utilisant 0,5 pg de modèle linéarisé (préparé ci-dessus). Incuber à 37 ° C pendant 2 heures.
    2. Ajouter 0,5 pi de DNase (inclus dans le kit) et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
  5. Purifier l'ARNm, en suivant les instructions du fabricant. Eluer dans 30 l'eau sans nucléase ul.
  6. Exécuter un gel agarose à 1,5% par électrophorèse pour vérifier l'ARNm.
    1. Nettoyer le dispositif de gel avec un produit pour éliminer la contamination de RNase et de préparer un gel à 1,2%.
    2. Mix 1 ul ARNm + 4 &# 181; l sans nucléase l'eau + 5 pi glyoxyl colorant de charge. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 30 min. Centrifuger les tubes brièvement et placer sur la glace avant d'exécuter le gel.
  7. Vérifier la concentration en utilisant un procédé de quantification des concentrations d'acide nucléique et de stocker l'ARN dans des aliquotes à -80 ° C. Choisir une taille de l'aliquote de telle sorte que l'ARN n'a pas été congelé / décongelé plusieurs fois.
    Remarque: Les concentrations de 500-1000 ng / nl sont généralement obtenus. ARN avec une concentration plus faible peut être utilisé aussi longtemps que l'intégrité de l'ARN est maintenue (telle qu'évaluée par une bande plutôt que sur un frottis sur le gel).

4. Inject Astyanax mexicanus Embryons avec TALEN ARNm

  1. Préparer Outils pour injection.
    1. Verser des plaques d'injection en versant 1,2% d'agarose dans de l'eau du poisson (eau traitée avec du bicarbonate de sodium et le sel de mer à un pH de 7,4 et une conductivité de 700 uS) dans une boîte de Pétri. Placez un moule (pièce en plastique avec des projections pour faire des puits pour les poissonsoeufs) à l'intérieur du plat. Retirer le moule lorsque la gélose a durci et conserver à 4 ° C. Pour plus de détails sur le moule voir 36.
    2. Tirez aiguilles pour l'injection à l'aide d'un extracteur d'aiguille selon les directives du fabricant.
      Remarque: la longueur de l'aiguille appropriée est important pour les injections. Les aiguilles qui sont trop longues seront trop souples pour les injections. Le protocole pour les aiguilles de traction variera en fonction de l'équipement utilisé pour tirer des aiguilles. Un exemple d'une aiguille appropriée est représenté sur la figure 1. Pour notre équipement, nous nous retirons des aiguilles qui sont 5-6 cm de longueur, et ont un diamètre extérieur à la pointe d'environ 0,011 mm lorsqu'il est cassé. Cependant, les aiguilles doivent être étalonnés (étape 4.3.4) afin de déterminer la largeur d'ouverture. Un exemple de programme pour extraire les aiguilles peuvent être trouvés dans le Tableau 7.
    3. Préparer les pipettes en verre pour le transfert d'embryons par rupture de la pipette, de sorte que l'ouverture est assez grande pour un oeuf de passer à travers. Flamber l'extrémité cassée jusqu'à ceil est plus forte.
      Note: Il est important d'utiliser des pipettes en verre et des bols en verre lorsque vous travaillez avec A. oeufs mexicanus et les embryons car ils sont collants et adhèrent au plastique.
  2. Collecter 1 cellule étape Eggs.
    1. Race A. mexicanus suivant des protocoles standards 37.
      Remarque: Par exemple, si les poissons sont maintenus sur un 14 cycle de lumière: obscurité 10 et en utilisant le temps Zeitgerber (ZT) avec ZT0 comme lumières allumées et ZT14 comme lumières éteintes, notre frai de surface entre ZT15 et ZT19. moment de la ponte exacte doit être déterminée pour chaque laboratoire individuel.
    2. Provoquer frai par suralimenter les poissons pendant 3-4 jours avant l'accouplement et à placer du poisson dans l'eau douce. Augmenter la température de 2 ° C. Note: Notre température initiale de l'eau est d'environ 74 ° F.
    3. Collecter les œufs de poissons de surface dans l'obscurité, en vérifiant toutes les 15 minutes pour obtenir des œufs au stade 1 cellule. Des centaines d'oeufs peuvent être obtenus à partir d'une seule paire de poissons de surface.
    4. Collecteœufs dans des bols en verre pour empêcher de coller aux surfaces en plastique et trier pour isoler embryons au stade 1 cellule avant l'injection en observant les œufs sous le microscope et la collecte des œufs qui sont une seule cellule. Gardez les oeufs dans l'eau douce du système (eau du réservoir dans lequel les poissons adultes sont logés, qui a été traité pour le pH et conductivité).
  3. Injecter TALEN ARNm.
    1. Injecter des quantités différentes d'ARNm totale (quantités égales de chacun de la paire TALEN) afin de déterminer la concentration optimale pour l'injection comme la toxicité et l'efficacité varient en fonction TALEN paire. Commencer par l'injection de concentrations d'ARNm total qui sont 400-800, p. Diluer et de combiner l'ARNm à des concentrations désirées pour injecter 1,5 nl.
    2. Charge diluée ARNm dans le dos de l'aiguille et fixez l'aiguille à un micro-injecteur.
    3. Casser l'aiguille en utilisant une pince.
    4. Calibrer l'aiguille. Par exemple, éjectez 10 fois et récupérer la baisse résultant en un micro capillaire. 10 x 100 1,0 jetable81; l, 32 mm micro capillaire, la chute doit remplir le micro capillaire à 0,5 mm pour 1,5 / 1 injection nl. Réglez le temps et la pression d'injection au besoin.
    5. Insérez l'aiguille dans la cellule unique et injecter l'ARNm. Injecter directement l'ARNm dans la cellule, et non pas dans le jaune d'oeuf.
    6. Recueillir des embryons injectés dans des bols en verre. Gardez embryons à 23-25 ​​° C. Retirer les embryons morts (embryons qui deviennent trouble et de forme irrégulière) régulièrement pendant les premiers jours suivant l'injection. Un nombre record d'embryons morts et déformés de contrôle (sans injection) et des plaques injectées.
      Remarque: la concentration d'ARNm accrue peut conduire à une toxicité accrue et une déformation / mort des embryons. Ainsi, la toxicité par rapport à l'efficacité doit être équilibrée pour déterminer la meilleure concentration de l'ARNm pour l'injection.

5. Phénotype Fondateur poisson et évaluer l'efficacité TALEN

  1. Sacrifiez embryons selon le protocole d'animaux dans les institutions.
    Note: Nous euthanasierembryons par refroidissement rapide sur la glace.
  2. Recueillir des embryons dans 0,8 ul de PCR tubes de bande à l'aide d'une pipette de transfert.
    Remarque: Le génotypage peut être effectuée sur des embryons ou des pools d'embryons individuels.
  3. Extraire l'ADN.
    1. La place des embryons dans 100 ul d'hydroxyde de sodium 50 mM (NaOH) et incuber à 95 ° C pendant 30 min, puis refroidir à 4 ° C.
    2. Ajouter 1/10 volume (10 ul) de 1 M de Tris-HCl pH 8.
  4. Effectuer une PCR sur la région en utilisant les amorces conçues à l' étape 1.3 (voir les tableaux 8 et 9 pour les protocoles d'échantillonnage). Pour les embryons individuels 1 pi d'ADN est suffisante pour la réaction PCR.
  5. Digest produit PCR résultant avec l'enzyme de restriction appropriée et exécuter un gel agarose à 1,5% par électrophorèse.
    1. Par exemple, pour le génotypage du locus albinisme oculo 2 (OCA2) dans les embryons injectés digérer le produit de PCR en utilisant l'enzyme de restriction Bsr I en ajoutant 0.5 Ul de Bsr I directement à 12,5 pi de la réaction PCR terminée, l' incubation à 65 ° C pendant 2 heures. Exécutez le digérées et le produit digéré sur un gel. Les bandes résistantes à des enzymes de restriction ( par exemple, des bandes qui ne digère pas) indiquent que des mutations induites par TALEN sont présents (figure 2).
  6. (Facultatif) Calculer le taux de mutation de pourcentage en déterminant le pourcentage de produit non coupé par l' analyse des images de gels à Fidji 38 à l' aide de l'outil d'analyse de gel pour calculer la valeur d'intensité de chaque bande comme décrit précédemment 29.
  7. Déterminer la séquence des alleles mutants par clonage du TA purifié sur gel, l'enzyme de restriction bande mutant résistant et le séquençage des clones.
    1. Gel purifier l'enzyme de restriction bande mutant résistant suivant les instructions du fabricant. TA cloner la bande suivant les instructions du fabricant. Prélever des colonies et à croître dans 1,5 ml LB O / N à 37 ° C dans une secousseincubateur.
    2. les cultures miniprep en suivant les instructions du fabricant. Envoyer l'ADN pour le séquençage.
    3. L'utilisation d'un programme tel que ApE, aligner les séquences mutantes à la séquence de type sauvage.
      1. Copiez et collez les deux séquences en fichiers ape. Choisissez l'outil "Aligner deux séquences" dans le menu "Outils".
      2. Spécifiez les deux séquences d'ADN en utilisant les menus déroulants.
        Remarque: le complément inverse de la séquence clonée peut être nécessaire d'utiliser en fonction de la direction dans laquelle la PCR est entré dans le vecteur de clonage. Si les séquences ne sont pas alignés, répétez les étapes cochant la case "Rev-Com" dans la boîte "Aligner l'ADN".
  8. Évaluer le poisson fondateur de phénotypes au stade approprié et en utilisant des méthodes appropriées pour le phénotype attendu 29 (Par exemple, la figure 3). Les méthodes de phénotypage seront basés sur le phénotype attendu pour le gène ciblé par le chercheur en utilisant le protocol.

6. écran pour la transmission germinale

Remarque: A. mexicanus atteignent leur maturité sexuelle à 4-8 mois.

  1. Traversez poissons fondateur sexuellement matures type poisson sauvage.
  2. Embryons d'écran ou les poissons adultes en utilisant des méthodes dans les étapes 5.1-5.7 (Figure 4). Pour les poissons adultes, un morceau de la queue peut être fixé suivant anesthetization.
    1. Anesthetize poissons en immergeant le poisson dans une solution de tricaïne (ester éthylique de l'acide 3-aminobenzoïque) pour réduire le stress lors de l'écrêtage fin. Après découpage fin, permettent de récupérer le poisson dans l'eau douce. Les poissons se rétablissent rapidement; observer jusqu'à ce qu'ils aient récupéré (nagent normalement).

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Résultats

Talen paire injections entraînent dans la liaison des DRV à nucléotides d'ADN spécifiques et donc dimérisation des domaines FokI, entraînant des cassures double brin 39 qui peuvent être réparés par l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ). NHEJ introduit souvent des erreurs qui se traduisent par des insertions ou délétions (indels). Indels peuvent être identifiés par l'amplification de la région entourant le site cible TALEN et de digérer l'amplic...

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Discussion

De grands progrès ont été réalisés ces dernières années dans la compréhension de la base génétique de l'évolution des traits. Alors que les gènes candidats qui sous - tendent l'évolution d'un certain nombre de traits ont été identifiés, il est resté difficile de tester ces gènes in vivo en raison de l'absence de traçabilité génétique des espèces les plus intéressantes évolutionnaire. Nous rapportons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus, une espèce utilisée pou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Département de génétique, de développement et de biologie cellulaire et de l'Iowa State University et par NIH EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner a fourni des commentaires sur le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Equipment
Thermocycleur
Station
Appareil
Extracteur
Nanodrop
Name Entreprise <strong>Numéro de catalogueComments
Supplies
Remarque : Pour autant que nous le sachions, les fournitures de différentes sociétés peuvent être utilisées, sauf indication
Golden Gate TALEN et TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulé)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents Microbiologie Support : LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 en 50 % EtOHTeknova (commandé via Fisher)50-843-314
Dichlorhydrate de spectinomycine, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Super ampicilline (1 000x solution)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, prête à l’emploiThermo Sci Fermentas Inc (commandée auprès de Fisher)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
Boîtes de PétriFisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (commandée auprès de Fisher)50-812-203Utiliser BsaI, et non BsaI-HF (comme décrit dans le protocole Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit)
BSANew England Biolabsfourni avec des enzymes de
10x tampon T4 ligasePromega (commandé par Fisher)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega (commandé par Fisher)PRM7123D’autres Taq peuvent être utilisés, mais la réaction doit être ajustée en conséquence
Kit de ligature rapideNew England Biolabs (commandé via Fisher)50-811-728Nous utilisons Quick Ligase pour toutes les réactions d’assemblage TALEN
One Shot TOP10 Chimiquement compétent E.coliInvitrogenC4040-06D’autres cellules chimiquement compétentes ou des cellules compétentes faites maison peuvent être utilisées
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (commandé via Fisher)FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNaseEpicentre (commandé via Fisher)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Le kit Qiagen doit être utilisé pour la préparation initiale du plasmide (comme décrit dans le protocole du Golden Gate TALEN et du TAL Effector Kit)
QIAquick PCRPurification Kit Qiagen28104
GeneMate LE Quick Dissolve AgaraoseBioExpressF-3119-125
Sac IPromega (commandé par Fisher)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription KitAmbionAM1348M
Rneasy MinElute Cleanup KitQiagen74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye  ;Ambion (commandé par Fisher)AM8551
EliminaseDecon (commandé par Fisher)04-355-32
Fisherbrand Verre sodocalcique jetable Pasteur PipetsFisher13-678-6B
Standard Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips pour micro-injecteur FemtojetEppendorf (commandé chez Fisher)E5242956003
Hydroxyde de sodiumFisherS318-500
Tris baseFisherBP152-1
d’injectionà geld’aiguillecontrairerestriction

Références

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105(2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108(2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281(2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823(2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647(2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307(2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

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