Des colorants cyanines photostables sont fixés à des oligonucléotides pour surveiller l’hybridation par transfert d’énergie.
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Article de méthode
Synthèse de la longueur d'onde de décalage d'ADN à l'aide de sondes d'hybridation cyanine photostable
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour la synthèse de 2'-alcyne modifié acide désoxyribonucléique (ADN) brins par synthèse en phase solide automatisée en utilisant la chimie phosphoramidite standard. Les oligonucléotides sont post-synthétiquement marqués par deux nouveaux colorants de cyanine photostable en utilisant le cuivre catalysée par un clic-chimie. La synthèse du donneur et accepteur de colorant est décrit et est réalisée en trois étapes consécutives. Avec l'ADN que l'architecture environnante, ces deux colorants sont soumis à un transfert d'énergie quand ils sont amenés en étroite proximité par hybridation. Par conséquent, le recuit des deux brins d'ADN simple brin est visualisée par un changement de couleur de la fluorescence. Ce changement de couleur est caractérisé par spectroscopie de fluorescence, mais peut aussi être directement observée à l'aide d'un rayonnement ultraviolet de poche (UV), la lampe. Le concept d'une double lecture de la couleur de fluorescence rend ces sondes d'oligonucléotides d'excellents outils pour l'imagerie moléculaire en particulier lorsque le pho décrittostable colorants sont utilisés. De ce fait, le photoblanchiment des sondes d'imagerie est empêchée, et les processus biologiques peuvent être observées en temps réel pendant une période de temps plus longue.
Introduction
L' imagerie moléculaire représente une technique fondamentale pour la compréhension des processus biologiques dans les cellules vivantes. 1-3 Le développement de sondes fluorescentes d'acides nucléiques sur la base de ces applications chimiques et biologiques est devenu un domaine de recherche en pleine expansion. Ces sondes fluorescentes doivent répondre à quelques exigences pour devenir des outils appropriés pour l'imagerie cellulaire. Tout d' abord, les colorants appliqués doivent présenter une fluorescence avec des rendements quantiques élevés, les changements de grande Stokes et, surtout, de hauts photostabilities pour permettre à long....
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Protocole
Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. S'il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées qui sont généralement nécessaires dans les laboratoires de chimie organique, comme le port d'une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants.
1. Synthèse des colorants
Remarque: Les deux colorants peuvent être synthétisés par les mêmes types de réaction Figure 2 montre une vue d....
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Résultats
Absorption et spectres de fluorescence de l'ADN simple et double brin sont enregistrés comme le montre la figure 4.
Les spectres d'absorption enregistrés (figure 4 à droite) montrent maxima d' absorption λ max à 465 nm pour ADN1 simple brin (colorant 1) et 546 nm pour ADN2 simple brin (colorant 2). Le DNA1_2 recuite (colorant 1 & colorant 2) montre des maxima à la fo.......
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Discussion
Ce protocole montre la procédure complète pour marquer l'ADN post-synthétiquement via CuAAC par des colorants fluorescents azoture modifié. Cela comprend la synthèse des colorants et de l'ADN modifié par alcyne ainsi que la procédure d'étiquetage.
La synthèse des colorants en quatre étapes. Tous les produits peuvent être obtenus par une précipitation assez simple en raison de leur charge positive et pas de temps Chromatographie sur colonne est nécessaire. L'introduction des f.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la formation à la recherche Groupe GRK 2039 (financé par DFG) et KIT est grandement apprécié.
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Matériaux
HPLC
10660131 de qualité technique ; 97 %T111081td colspan="4">
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acétonitrile | Fisher Scientific | Acétate | d’éthyle |
| Fisher Scientific | 10456870 | qualité technique | |
| Azoture de sodium | Sigma Aldrich | 71290 | qualité p.a. |
| Dichlorométhane | Fisher Scientific | 10626642 | qualité technique |
| Indole-3-carboxaldéhyde ; 98 % | ABCR | AB112969 | |
| carbonate de potassium, 99+ % | Acros | 424081000 | |
| diméthylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N-Diméthylformamide, 99,8 %, Extra Dry sur tamis moléculaire | Acros | 348435000 | |
| Sulfate de sodium | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Éthanol, 99,5 % | Acros | 397690010 | |
| pipéridine, 99 % | Acros | 147181000 | |
| Diéthyléther | Fisher Scientific | 10407830 | |
| 2-Phénylindole-3-carboxaldéhyde | ABCR | AB125050 | |
| 4-méthylquinoléine | ABCR | AB117222 | |
| fort | |||
| Expedite 8909 Synthétiseur d’acides nucléiques | Applied Biosystems | ;- | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | ||
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Diluant amidite pour la synthèse | de l’ADN Sigma Aldrich | L010010 | |
| Acétonitrile ultrapur pour la synthèse | de l’ADN Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Colonne 1.0 ; et micro ; mole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Colonne 1.0 ; et micro ; mole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Colonne 1.0 ; et micro ; mole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Colonne 1.0 ; et micro ; mole | Proligo Réactifs | C461010 | |
| ammoniac (solution aqueuse) ; | Fluka Analytical | 318612 | |
| dispositifs centrifuges nanosep 0,45 ; et micro ; m | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tétrazole (Activateur) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tétrakis(acétonitrile)cuivre(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Acétate de sodium | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-L-ascorbate de sodium | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA Sel disodique | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | ;- | ;- | synthétisé selon une procédure littérale1< |
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 colonne | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| détermination de la concentration | |||
| ND 1000 | nanodrop | ||
| préparation d’échantillons et spectroscopie | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
Références
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.
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Réimpressions et autorisations
