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Article de méthode

Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels

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DOI :

10.3791/54127

⸱

4 juillet 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit les méthodes de marquage de spin dirigé par site et de reconstitution des canaux pentamères ligand-dépendants pour les études de résonance paramagnétique électronique. Ce protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine membranaire. La méthode de reconstitution décrite ici peut également être utilisée pour des mesures par patch-clamp de courants macroscopiques et monocanaux dans un système lipidique défini.

Résumé

Le gate des canaux ioniques est une orchestration des mouvements des protéines induite par un stimulus qui conduit à des transitions entre les états fermés, ouverts et désensibilisés. La flexibilité intrinsèque de la protéine, qui est modulée de manière critique par la composition lipidique membranaire, est fondamentale pour ces transitions. Pour mieux comprendre la base structurelle de la fonction des canaux, il est nécessaire d’étudier la dynamique des protéines dans un environnement membranaire physiologique. La spectroscopie par résonance paramagnétique électronique (EPR) est un outil important pour caractériser les transitions conformationnelles entre les états fonctionnels. Par rapport à la RMN et à la cristallographie aux rayons X, les informations obtenues à partir de l’EPR sont intrinsèquement de plus faible résolution. Cependant, contrairement à d’autres techniques, dans l’EPR, il n’y a pas de limite supérieure au poids moléculaire de la protéine, les besoins en échantillon sont nettement inférieurs et, plus important encore, la protéine n’est pas contrainte par les forces du réseau cristallin. Par conséquent, l’EPR est particulièrement adapté à l’étude de grands complexes protéiques et de protéines dans des systèmes reconstitués. Dans cet article, nous aborderons les protocoles généraux pour le marquage de spin dirigé et la reconstitution membranaire en utilisant un canal ionique ligand-dépendant pentamère procaryote procaryote (pLGIC) de Gloeobacter violaceus (GLIC) à titre d’exemple. Une combinaison d’approches EPR à ondes continues (CW) et pulsées (double résonance électronique électronique-DEER) sera décrite qui permettra une caractérisation quantitative complète de la dynamique des canaux.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, la compréhension structurale des canaux ligand-dépendants pentamères ion (pLGIC) a augmenté à pas de géant, en raison de multitudes de structures à haute résolution de plusieurs membres de la famille. Les principaux facteurs qui ont conduit à des avancées actuelles dans le domaine comprennent, la découverte des canaux de pLGIC procaryotes, 1-3 grands progrès dans eucaryote expression de la protéine de la membrane, 4-6 et d' énormes percées dans les approches de détermination de la structure. 7 Ces structures fournissent un consensus clair sur la conservation d'ensemble de l'architecture tridimensionnelle de pLGIC. Toutefois, deux grands domaines qui semblent traîner derrière sont la caractérisation fonctionnelle de ces préparations de canal et la description mécaniste de la fonction du canal.

Gating changements conformationnels sont complexes et ont lieu sur une distance de 60 Å le long de la longueur du canal, et que ces transitions sont largement modulés parles lipides membranaires. En particulier, les lipides négatifs, le cholestérol et les phospholipides ont été montrés pour moduler la fonction de pLGIC 11/08. Bien que le rôle précis de ces constituants lipidiques en fonction du canal reste inconnue, une compréhension moléculaire complète de déclenchement, il faudrait étudier ces canaux dans leur environnement natif. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) et résonance paramagnétique électronique (RPE) sont les techniques de choix pour l'étude de la dynamique des protéines dans les systèmes reconstitués. La spectroscopie EPR ne soit pas limitée par la taille moléculaire (comme RMN) ou de la propriété optique de l'échantillon (comme la spectroscopie de fluorescence) et permet ainsi des mesures de constructions de longueur complète dans des conditions reconstituées de lipides d'origine. La technique est extrêmement sensible et a des exigences de l'échantillon relativement faible (dans la gamme pico-mole). Ces deux aspects font la technique bien adaptée à l'étude de grandes protéines membranaires qui sont difficiles à exprimer dans plus de milligrammequantités.

L'utilisation de la spectroscopie EPR en combinaison avec dirigée marquage de spin a été développé par Wayne Hubbell et ses collègues, et a été adapté pour étudier une gamme de types de protéines. 12-24 données EPR ont été utilisées pour étudier les structures secondaires, les changements dans la protéine conformation, la profondeur d'insertion de membrane et la protéine-protéine / interactions protéine-ligand.

Le procédé implique la substitution de la cystéine à des positions d'intérêt par mutagénèse dirigée sur un site. Pour garantir un étiquetage spécifique au site, il est nécessaire de remplacer les cysteines natives avec un autre acide aminé (par exemple., Serine) pour créer un modèle de cystéine moins. De loin, l'étiquette la plus populaire de spin est un MTSL thiol-spécifique: (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-Δ3-pyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonate qui se fixe à la protéine par un pont de liaison disulfure. En raison de sa haute spécificité, la taille relativement petite (légèrement plus grand que le tryptophane), et flexibilité de la région de liaison, ce marqueur de spin a été démontré qu'ils ont une excellente réactivité, même avec une cystéine enterrée. En outre, pour maximiser la réactivité, la réaction de marquage de la protéine est réalisée sous la forme d'un détergent solubilisé. Après séparation de l'excès libre spin-label par chromatographie d'exclusion stérique, la protéine est reconstituée dans des liposomes ou des systèmes bicouches mimant la composition lipidique définie. En général, la cystéine mutagenèse est bien toléré dans la plupart des parties de la protéine, et la taille relativement petite du spin-sonde provoque une perturbation minimale pour les structures secondaires et tertiaires. Faire en sorte que la modification a conservé des fonctions de type sauvage, les canaux marqués et reconstitués peuvent être étudiés par des mesures de patch-clamp.

La protéine marquée-fonctionnelle est ensuite soumis à des mesures spectroscopiques, qui fournissent essentiellement trois principaux types d'information: 12,14,15,20,22,23,25-27 dynamique spin-sonde par lineshanalyse singe; l'accessibilité de la sonde à des agents de relaxation paramagnétique; et la distance distribution. 27 distances EPR sont mesurées par deux approches différentes. La première est basée sur la vague (CW) technique continu, où l' élargissement spectral résultant d'interactions dipolaires entre spin-étiquettes (dans le 8 - Une gamme de 20 à distance). Est utilisé pour déterminer la distance 28,29 Le second est un pulsé EPR méthode où les mesures de distance peuvent être étendues jusqu'à 70 Å. 30-34 en Double Electron Electron Resonance (CERF), les oscillations de l'amplitude d'écho de spin sont analysés afin de déterminer les distances et les distributions de distance. Ici, l'écho de spin est modulé à la fréquence de l'interaction dipolaire. Ensemble, ces paramètres sont utilisés pour déterminer la protéine topologie, les éléments structuraux secondaires, et les changements de protéines conformationnelle.

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Protocole

1. La mutagenèse dirigée et Cys Mutations

  1. Clonage et mutagénèse
    NOTE: GLIC type sauvage (wt) 35 a une cystéine unique native (C27), qui est muté à serine pour créer un fond de cystéine moins. Des mutations de cysteine ​​sont introduits sur la base de cystéine moins par mutagenèse dirigée en utilisant des amorces qui portent un codon cystéine à la position désirée 36.
    1. Mélanger 5 pi de tampon 10x réaction, 1 ul de 100 ng / ul cystéine moins GLIC ADN matrice 35, 0,5 ul chacun de 40 um avant et l' amorce inverse 36, 1 ul de dNTP (100 mM) et 41 pi d'eau déminéralisée . Pipeter l'échantillon à quelques reprises pour mélanger soigneusement, rotation (6000 tours par minute) et, enfin, ajouter 1 pl de l'ADN polymérase.
    2. Fixer le thermo-cycleur le protocole suivant:
      1. Dénaturation à 95 ° C pendant 4 min.
      2. Dénaturation à 95 ° C pendant 30 secondes.
      3. Recuiretion à 55 ° C pendant 1 min.
      4. Allongement à 68 ° C pendant 10 min (environ 1 min par kb longueur de plasmide).
      5. Répétez les étapes 1.1.2.2 - 1.1.2.4 pendant 18 cycles.
      6. Une élongation finale à 68 ° C pendant 10 min.
      7. Maintenir la température à 4 ° C
        REMARQUE: La température de recuit est calculée en se basant sur l'amorce Tm.
    3. Ajouter 1 pl de Dpnl au mélange de réaction, bien mélanger par pipetage et centrifuger (6000 rpm) pendant 1 min. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C.
  2. Transformation
    1. Thaw E. cellules compétentes coli sur la glace. Aliquote de 30 pi de cellules dans un tube stérile de transformation de 14 ml et ajouter 1 pl d'ADN digéré aux cellules. Mélanger en tapotant sur le côté du tube. Incuber pendant 20 min sur la glace.
    2. Placer le tube dans un bain d'eau de 42 ° C pendant 45 secondes, puis remettez-le sur la glace pendant 2 min. Ajouter 400 pi médias SOC stérile et agiter les cellules dans un incubator à 37 ° C pendant 1 h.
    3. Plaque 100 pi de cellules sur des plaques LB contenant de la kanamycine (50 uM) et 1% de glucose. Incuber les plaques O / N à 37 ° C.
    4. Récolter une seule colonie de la plaque et inoculer dans 5 ml O / N cultures contenant du milieu LB / kanamycine. Incuber la culture O / N (~ 16 h) à 37 ° C dans un agitateur incubateur.
    5. Extraire l' ADN de l'O / N culture par minipréparation 37. Quantifier le rendement de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre en mesurant l'absorbance à 260 nm de longueur d'onde. La concentration doit être ~ 1-200 ng / ul. Confirmer la présence de la mutation par des stratégies de séquençage de l' ADN recombinant 38,39.

2. GLIC Expression et purification

  1. Transformation
    1. En suivant les étapes décrites à la section 1.2, transformer 30 ul de cellules compétentes C43 avec 1 pl (~ 100 - 200 ng / ul) du plasmide contenant le gène codant pour GLIC avec un rhinovirus humain (HRV) site de clivage -3C de protéase (pour la séquence du plasmide et le gène, voir le texte supplémentaire) 35 (de l' étape 1.2.5).
    2. Plaque 100 pi de cellules sur des plaques de LB-agar contenant 1% de glucose et 50 pg / ml de kanamycine et de les laisser incuber O / N (~ 16 heures) à 37 ° C dans un incubateur.
    3. Vérifiez visuellement pour les colonies et veiller à ce qu'ils ne sont pas trop cultivés ou montrent la présence de colonies satellites. sceller rapidement les plaques avec du parafilm et les stocker à 4 ° C.
  2. Mise en place d'O / N-cultures et la préparation des milieux de croissance
    1. Choisir une seule colonie isolée en utilisant la boucle de fil inoculant et transférer dans un flacon stérile de 100 ml contenant 20 ml de bouillon Luria (LB) additionné de support stérile de 1% de glucose et 50 pg / ml de kanamycine. Incuber les O / N (~ 16 h) à 37 ° C dans un agitateur à 250 tours par minute.
    2. Autoclaves 900 ml Terrific Broth (TB) médias (Voir médias et Buffer Composition) dans 2.8L Fernbach flacons en verre pour la culture bactérienne dans le cycle de la vapeur à 121 ° C pendant 20 min.
  3. La mise en place de grandes cultures de croissance
    1. Ajouter 100 ml de tampon phosphate de potassium stérile (Voir médias et Buffer Composition) aux médias autoclavé de la tuberculose. Ajouter du glucose stérile (0,2% en concentration finale), kanamycine (50 pg / ml) et 10 ml de la culture O / N. Incuber à 37 ° C dans un agitateur à 250 tours par minute.
    2. Vérifier la densité optique à 600 nm de longueur d' onde (DO 600) en utilisant un densitomètre ou un spectrophotomètre toutes les heures jusqu'à ce qu'il atteigne 0,5 (~ 2 h). À ce stade, réduire la vitesse à 150 rpm et abaisser la température à 18 ° C. Surveiller l'OD 600 toutes les 30 minutes jusqu'à ce qu'il atteigne 0,8 (~ 1 h).
    3. Ajouter 50 ml de glycérol et continuer en secouant la culture jusqu'à ce que la DO 600 atteigne 1,0 - 1,2 (environ 15 - 30 min).
      NOTE: Dans ces conditions, il faut environ une heure pour la culture pour atteindre 18 ºC de 37 ºC. Il est important que le glycérol est ajouté à la culture après qu'il a refroidi à 18 ° C.
    4. Provoquer les cellules avec 200 uM d'IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) et réinitialiser le secoueur de retour à 250 rpm et incuber encore pendant environ 16 heures à 18 ºC.
  4. Une purification des protéines
    1. Veiller à ce que la DO 600 à la fin de 16 heures est de ~ 16 - 18. Récolte des cellules dans 1,0 L bouteilles de centrifugeuse par centrifugation à 8500 xg, 4,0 ºC pendant 15 min. Décanter le surnageant et peser le flacon avec le culot cellulaire. Calculer le poids de la pastille en soustrayant le poids de la bouteille vide du poids total.
      REMARQUE: Le poids de la boulette de cellules est attendue ~ 30 - 35 g / l. Bien que, il est à noter qu'il peut y avoir une variabilité du poids final DO 600 et le culot cellulaire dans les mutants.
    2. Remettre en suspension le culot bactérien dans 150 ml de tampon glacé A (NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 7,4) par 1,0 litre de la culture. Ajouter de la DNase I (100 pg / ml) et protéesLes inhibiteurs de e (fluorure de phénylméthylsulfonyle (1 mM), leupeptine (2,0 pg / ml), aprotinine (2,0 pg / ml) et pepstatine A (1 pg / ml)).
    3. Homogénéiser les cellules en les faisant passer à travers un désintégrateur de cellules dans une chambre froide 4,0 ° C. Répétez le processus trois fois afin que la plupart des bactéries est lysées. Centrifuger les cellules à 14 000 xg pendant 15 min et pipeter le surnageant et transfert dans un tube à centrifuger propre. Jeter le culot, qui contient des cellules non-lysées et des corps d'inclusion.
    4. Centrifuger le surnageant à 168.000 xg pendant 1 h. Décanter avec soin le surnageant sans perturber le culot de membrane.
    5. Mutualiser le culot de membrane de 1 L de culture et remettre en suspension dans un tampon A (supplémenté avec 10% de glycerol) à un volume final de 50 ml. Ajouter 0,5 g de n-dodécyle-β-D-maltopyranoside (DDM) à la suspension de la membrane et nutation pendant 2 heures à 4,0 ° C.
    6. Après solubilisation de la membrane, éliminer les débris cellulaires du lysat par centrifugation à 168.000 xg pendant 1 heure. En attendant de préparer la résine amylose. Transfert de 3 ml de résine à l'aide d'une pipette dans une colonne de chromatographie en polypropylène vide. Laver la résine en passant 10 volumes de lit d'eau 3 fois, puis avec 10 volumes de lit de tampon A contenant mM DDM 0,5.
    7. Après centrifugation, prendre doucement le surnageant à l'aide d'une pipette et transférer à un 50 ml tube conique propre. Pour discontinu de liaison, ajouter la résine pré-équilibrée amylose au tube conique. Lier la protéine extraite de la résine d'amylose en nutation le mélange pendant 2 heures à 4,0 ° C.
    8. Passer l'ensemble de la suspension à travers une colonne de chromatographie et recueillir le accréditive. Passez ensuite l'ensemble accréditives recueillies sur la résine une seconde fois afin de maximiser la liaison.
    9. Passer 10 volumes de lit de tampon A avec mM DDM 0,5 mM tris 0,5 (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) et 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour éliminer les protéines non liées.
    10. Éluer la protéine GLIC avec 10 ml d'Buffer A contenant 40 mM de maltose en plus mM DDM 0,5 mM et PTCE 0,05. PTCE empêche l'oxydation de la cystéine chaînes latérales. Recueillir l'ensemble éluat.
    11. Concentrer la protéine éluée en utilisant un concentrateur centrifuge (poids moléculaire Cut-off = 50 kDa) à 4 - 6 mg / ml et ajouter HRV-3C protease (200 ug par 10 mg de protéine) et incuber O / N à 4,0 ºC.
      NOTE: Déterminer l'achèvement de la protéase digestion en exécutant les échantillons sur gel de SDS - PAGE (Voir l' étape 2.5.5 et la figure 1).
  5. Site-Directed Spin-étiquetage
    1. Faire environ 100 pi de 200 mM de (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-Δ3-pyrroline-3-méthyl) MTSL 40 dans du DMSO et stocker le stock à -20 ºC en 25 aliquotes.
    2. Utilisez l'exemple de protéase digéré par marquage de spin avec MTSL. Ajouter un excès molaire de 10 fois de MTSL spin-étiquette (monomère GLIC: MTSL en 1h10 rapport molaire). Incuber sur la glace pendant 1 h. Ajouter un second coup de marqueur de spin à un excès molaire de 5 foisrapport et incuber pendant une heure.
      NOTE: Pour les postes enterrés (avec une faible efficacité de marquage de spin, décrites ci - dessous), 30 fois en excès molaire de marqueur de spin est ajoutée et la protéine est incubée pendant 6 heures.
    3. Passez l'échantillon à travers une protéine rapide colonne de taille d'exclusion chromatographie liquide (FPLC) qui est pré-équilibrée avec le tampon A et mM DDM 0,5 à séparer la MACM clivée et l'excès de spin-label libre de pentamères GLIC. Prélever 1 ml fractions pour un total de 30 ml d'élution. Réunir les fractions contenant GLIC pentamères (Figure 1). Suivez les instructions du fabricant pour exécuter le FPLC.
    4. Déterminer la concentration de l'échantillon à l'aide d'un spectrophotomètre en mesurant l'absorbance à 280 nm de longueur d'onde. Coefficient d'extinction molaire et le poids moléculaire estimé du monomère sont GLIC 49850 M -1 cm -1 et 36380 Da, respectivement. Concentrer la solution de protéine en utilisant un concentrateur centrifuge (MolecularPoids Cut-off = 50 kDa) à une concentration finale de ~ 8-10 mg / ml et placez-le sur la glace. L'échantillon est maintenant prêt pour la reconstitution.
    5. Comme un contrôle de qualité supplémentaire pour veiller à ce que la préparation est homogène biochimiquement, exécuter un (β-ME 1,0%) Gel SDS-PAGE réducteur.
      NOTE: Le gel Coomassie teinté doit montrer une seule bande à ~ 33 kDa correspondant au monomère GLIC (Figure 1).
    6. Pour les mutants de spin marqué soupçonnés de présenter un élargissement dipolaire, sous-étiqueter les échantillons en présence de l' étiquette 41 diamagnétique. Incuber la protéine élue avec 0,1 fois MTSL et incuber sur la glace pendant 1,0 h. Par la suite, ajouter un excès molaire de 20 fois de l'étiquette diamagnétique (1-acétoxy-2,2,5,5-tétraméthyl-Δ3-pyrroline-3-méthyl) méthane thiosulfonate.
      Remarque: le réactif utilisé ici est diamagnétique iso stérique à l'étiquette paramagnétique avec une chimie de marquage identique.
    7. Incuber l'échantillon sur la glace pendant 2 heures. Passez l'échantillon à travers un size colonne de chromatographie d'exclusion qui est pré-équilibrée avec le tampon A et 0,5 mM de DCM comme à l'étape 2.5.3.
  6. L'efficacité de marquage de spin
    1. l'efficacité de marquage de spin est défini comme le rapport de la concentration de spin marqueur à la concentration en cystéine de la chaîne latérale (GLIC-monomère). Pour déterminer l'efficacité de marquage de spin de l'échantillon, l'intensité intégrée de l'échantillon sera comparé avec un étalon de concentration connue en utilisant une courbe d'étalonnage. Faire des solutions d'une norme EPR (comme 2,2,6,6-tétraméthyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) dans une gamme de concentrations (10-250 uM) par dissolution dans l'eau.
    2. Mesurer le signal EPR pour chacune de ces solutions et de déterminer l'aire sous la courbe (double intégration du signal EPR) pour chaque concentration (comme décrit dans les étapes 6.1). Générer une courbe d'étalonnage en traçant la surface mesurée en fonction de la concentration de TEMPO et raccord avec une ligne droite.
      NOTE: Le sontun sous un signal EPR dérivé est une meilleure description de l'intensité spectrale que le amplitude crête à crête. L'intégration du premier dérivé signal RPE donne le spectre d'absorption, une seconde intégration donnera alors la surface sous le spectre d'absorption (qui est proportionnelle à la concentration de spin). Assurer une référence constante à la fois dans le bas-champ et de la région de champ élevé du spectre.
    3. Mesurer la concentration de la protéine de spin marqué dans le détergent en utilisant un spectrophotomètre (comme dans l'étape 2.5.4). Maintenant mesurer le signal EPR de l'échantillon, puis de déterminer la zone de la double intégrale du signal EPR suivant les étapes de la section 6.1. À l'aide de la courbe d'étalonnage, déterminer la concentration de l'étiquette qui correspond au signal RPE mesuré. Calculer l'efficacité de marquage de spin le rapport molaire du marqueur de spin et de la concentration en protéines.

3. GLIC reconstitution dans asolectine Membranes

  1. Préparation liposome
    1. Rincer un 25 ml flacon à fond rond propre avec 5 ml de chloroforme et sécher le ballon dans un courant de N2 gaz dans la hotte. Transfert 10 mg de asolectine (soja polaire extrait 25 mg / ml dans le chloroforme actions) dans le flacon et sécher les lipides sous un courant continu de gaz N2.
      NOTE: Le choix des lipides pour la reconstitution est basée sur les résultats d'expériences dans la section 4.
    2. Lorsque le chloroforme est évaporé, placer le ballon dans un vide pendant 1 heure pour assurer un séchage complet. Ajouter 1 ml de reconstitution du tampon A au lipide séché et vortexer vigoureusement la fiole pour obtenir le culot de lipide en suspension.
    3. Pour préparer des petites vésicules unilamellaires, sonication de la suspension lipidique dans un bain de sonication à froid jusqu'à ce que la solution de vésicules devient plus ou moins translucide et sans grumeaux sont observés (environ 10 - 15 min). A ce mélange, ajouter DDM à une concentration finale de 4 mM et on incube à la température ambiante pendant 30 min.
  2. Reconstitution
    1. Ajouter la protéine purifiée provenant de l'étape 2.5.4 au mélange lipidique.
      NOTE: Le rapport protéines-lipides dépend du type d'expérimentation. Pour mesurer des courants macroscopiques, un rapport de 1: 10 000 est utilisé. Pour les études de REP, la reconstitution est effectuée à une protéine plus élevée au rapport de lipide (1: 2500) afin de maximiser le signal. Il est montré précédemment que , à ces concentrations, aucune agrégation latérale est observée 42.
      NOTE: Montant de travail typique de GLIC pour EPR est ~ 1 mg, bien que basé sur la position sondée, des montants inférieurs travailleraient aussi bien.
    2. Incuber l'échantillon à 4 ° C pendant 1 h avec une rotation douce puis diluer l'échantillon à 15 ml avec le tampon A.
      REMARQUE: Cette étape amène la concentration de détergent inférieure à la concentration micellaire critique (CMC).
    3. Retirez le détergent résiduel dans la suspension en ajoutant des billes de polystyrène (avec des pores hydrophobes qui piège de détergent). Ajouter 80 mg de nettoyer les perles et incuber les liposome suspension O / N sur un nutator à 4 ºC.
      1. Pour préparer les perles pour une utilisation, peser ~ 100 mg et de les transférer dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 10 ml de méthanol, agiter vigoureusement, centrifuger les perles à 8000 xg pendant 2 min, et décanter le méthanol. Répétez ce processus de méthanol laver trois fois. Répétez le même processus avec 30 ml d'eau déminéralisée, laver trois fois.
    4. Le lendemain, le transfert des liposomes dans un tube d'ultracentrifugation 25 ml en utilisant un filtre de colonne pour retirer les billes et on dilue davantage l'échantillon à 25 ml. Centrifuger les échantillons à 168.000 xg pendant 2 heures. Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot en utilisant 100 pi de tampon B.

4. Déterminer optimale Lipid Composition pour la reconstitution par FRET

  1. Utiliser un transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) dosage à base afin de déterminer la composition de la membrane qui maintient la protéine monodispersée.
  2. Purifier poids GLIC (avec la cystéine native, C27) en suivant les étapes décrites dans la section 2. Étiquette la protéine à un 10: (label / monomère) 1 rapport molaire soit fluorescéine-maléimide ou tétraméthylrhodamine-maléimide en utilisant les étapes dans la section 2.5.
  3. Après les étapes de la section 3.2 pour la reconstitution, préparer trois échantillons différents pour chaque composition lipidique à tester; d' abord, marqué à la fluorescéine GLIC dans un rapport molaire de 1:. 1500 (pentamère: lipides) Deuxièmement, marqué à la rhodamine GLIC dans un rapport molaire de 1: 1500 (pentamère: lipides). Troisièmement, mélanger le détergent fluorescéine et de la rhodamine solubilisé étiquetés GLIC (1: 1 ratio molaire). Reconstituer ce mélange dans 1: 750 (pentamère: lipides) ratio.
    NOTE: Nous avons utilisé trois systèmes lipidiques: asolectine, POPC: POPG (rapport 3: 1 molaire), et E. extrait polaire coli. La protéine à lipide rapport de la reconstitution dans l'essai FRET est supérieure à celle utilisée pour les mesures de REP (1: 750 par rapport à 1: 1 500 utilisé pour les études EPR).
  4. Diluerla suspension de liposomes (pour réduire le signal de diffusion de la lumière; ~ 5 pi dans 995 pi de tampon A) puis pipette l'échantillon dans une cuvette de quartz et le placer dans un fluorimètre.
  5. Régler la longueur d'onde d'excitation à 490 (qui correspond au maximum d'absorption du donneur: fluorescéine). En utilisant les instructions du fabricant, enregistrer les spectres d'émission de 500 nm à 660 nm.
    NOTE: Pour l'échantillon GLIC marqué à la fluorescéine, vous verrez un pic à 518 nm (correspondant à l'émission de fluorescéine) sans pic à 572 nm (correspondant à la rhodamine émission). Pour l'échantillon GLIC marqué à la rhodamine, vous ne verrez pas un pic à 518 nm, mais plutôt à 572 nm résultant de l'excitation directe de rhodamine à 490 nm. Pour l'échantillon contenant l'étiquette de fluorescéine et la rhodamine, une diminution de l'intensité du pic fluorescéine et une augmentation correspondante de la rhodamine pic est un signal de FRET qui est un indicateur susceptible d'agrégation latérale de la protéine sur la membrane.
  6. Surveiller leamplitude de rhodamine émission à 572 nm à différents intervalles de temps (0-24 h) enregistrement à toutes les heures pendant les 6 premières heures, puis après O / N incubation (Figure 2). Pour chaque intervalle, mesurer l'intensité de fluorescence à 572 nm (pour rhodamine: Ia) et à 518 nm (pour la fluorescéine: Id). Soustraire la contribution de l'activation de la rhodamine directe (échantillon 2 à l'étape 4.3) de Ia (Iac). Déterminer le taux de FRET comme Iac / (Iac + Ib). Comparer le FRET à différents intervalles de temps et dans des compositions lipidiques différentes.
    NOTE: En tant que témoin, effectuer l'étape 4.5 et 4.6 pour les échantillons de détergent solubilisé et de comparer les spectres d'émission à ceux des liposomes reconstitués. En utilisant un mélange équimolaire de protéine marquée avec un détergent (décrit à l'étape 4.3) et on dilue dans du tampon A additionné de 0,5 mM de DCM. Il est prévu que les échantillons de détergent montreront signal de FRET minimale.

5. Mesures fonctionnelles par patch-clamp enregistrements

  1. Préparer proteoliposomes pour les mesures de patch-clamp exactement de la même manière que pour les études EPR (section 3.1).
    NOTE: Cependant, ajuster la protéine: lipide ratio basé sur le type de mesure étant faite (Single-channel vs enregistrements macroscopiques). Flash geler les protéoliposomes dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. En règle générale, la reconstitution GLIC en 1: 10.000 protéine: lipide (rapport molaire) pour les courants macroscopiques et 1: 50.000 pour le rapport molaire des enregistrements mono-canal.
  2. liposomes Décongeler sur la glace. Rincer une lame de verre propre avec de l'eau et de l'éthanol et sécher complètement. Placer une goutte de 10 ul de la protéoliposome sur le centre de la lame et le joint sec / N dans un dessicateur à 4 ° C sous vide.
  3. Réhydrater les protéoliposomes de séchées en ajoutant 20 pi de tampon B (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,0) et placer la lame dans un petriplate sur le dessus d'un papier filtre humide. Couvrir la plaque et laisser la réhydratation se dérouler pendant environ 2 heures.
    NOTE: Ce yie processuslds liposomes géants multi-lamellaires qui sont propices à patcher à partir.
  4. Tirez pipettes de patch de capillaires à paroi mince verre borosilicate (~ 1 - 2 diamètre de pointe de um) en utilisant recommandée par le fabricant mise sur l'extracteur de pipette. Heat-polish à l'aide d'un feu-forge à une résistance de 1,5 - 2MΩ lorsqu'il est rempli avec le tampon B.
  5. Remplir la chambre d'enregistrement avec le tampon B à l'aide d'une pipette et fixer l'électrode de masse Ag / AgCl. En utilisant une pointe de pipette 2 pl, déloger doucement les liposomes à partir du bord et de transfert 1 pl de la suspension sur la chambre d'enregistrement. Attendez quelques minutes pour les liposomes à se déposent au fond.
  6. Remplissez le patch-pipette avec le tampon B en utilisant une aiguille de seringue non métallique et le monter sur la tête-étage amplificateur. Identifier une vésicule unique isolé patcher. Appliquer une légère pression positive pour empêcher le patch-pipette de colmatage, et insérez la pointe dans la chambre d'enregistrement.
  7. Appliquer des impulsions de test pour mesurer la antitache de pipettence et compenser la tension de décalage de la pipette. L'approche de la vésicule, et quand le contact est fait, appliquer une légère pression négative pour tirer doucement la vésicule contre la pipette de patch pour former un joint de gigaohm.
  8. Surveiller la résistance de la pipette au cours de l'ensemble du processus. Une fois que le joint d'étanchéité est formé gigaohm, retirer la pipette soigneusement l'écart de liposomes pour former une pièce à l'envers. Eteignez l'impulsion de test.
  9. Réglez le potentiel de maintien à -100 mV, et appliquer une impulsion de pH. Faible pH a été obtenu en utilisant 10 mM de citrate de sodium du tampon C (NaCl 150 mM, citrate 10 mM, pH 3,0). (Figure 3)
    REMARQUE: Les enregistrements sont effectués à une fréquence d'échantillonnage de 10 kHz pour macroscopique et 40 kHz pour la mesure de canal unique.

6. Mesures EPR

  1. Continuous-Wave Spectroscopy EPR
    1. Transférer la suspension de liposomes de l'étape 3.2 dans un tube de 200 ul et le culot des échantillons en utilisant une centrifugeuse. Jeter le supernatant et l'échantillon est prêt pour les mesures EPR.
      Remarque: Pour les mesures RPE, il est important d'éliminer autant tampon de l'échantillon de liposomes possible. Etant donné que les échantillons aqueux absorbent la partie électrique des micro-ondes entraînant le chauffage et la perte de sensibilité.
    2. Pour mener à bien l'échange de tampon, transférer 20 pi de liposomes à granulés à l'aide d'une pipette dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter 180 pi de tampon D (NaCl 100 mM, citrate 10 mM, pH 3,0) et on incube à 42 ° C bain d'eau pendant 5 min. Centrifuger l'échantillon, retirer le surnageant à l'aide d'une pipette et répéter le processus à trois reprises pour assurer l'échange de tampon complet.
      NOTE: Sinon, l'échange de tampon peut être fait en soumettant les échantillons à plusieurs cycles de gel / dégel.
    3. capillaires en plastique perméables au gaz sont adaptés pour les mesures de la ligne-formes spectrales et accessibilité au solvant. Appuyez sur le capillaire sur le protéoliposome pastillé pour attirer l'échantillon à l'intérieur et sceller la fin avec de la cire d'os.
      NE PASE: typique des volumes d'échantillon sont ~ 5 pi et une concentration de spin souhaitable est de 150 uM. Si l'objectif est de mesurer les formes de ligne seul, on peut utiliser des tubes capillaires OD de quartz de 0,4 mm. Si nécessaire, une pipette peut être utilisée pour le remplissage de l'échantillon à l'intérieur du capillaire.
    4. Faire fonctionner le spectromètre
      1. Effectuer des mesures CW-EPR à température ambiante (292-297 K) sur un spectromètre X-bande équipé d'un résonateur diélectrique selon le manuel d'instructions du fabricant.
      2. Allumez le refroidisseur d'eau, l'alimentation, et la console de pont à micro-ondes. Autoriser le système à l'équilibre thermique pendant environ 30 minutes avant l'enregistrement. Ouvrez le logiciel d'acquisition.
      3. Insérez le tube échantillon / capillaire dans le résonateur, assurez-vous que la section du tube rempli de l'échantillon est au centre de la cavité du résonateur. Tune le résonateur selon l'instruction sur le manuel du spectromètre.
      4. Notez le premier spectre d'absorption dérivé par le champ de balayage àune puissance micro-onde incidente de 1,0 mW, une fréquence de modulation de 100 kHz et une largeur de balayage de 100 G. déterminer la puissance optimale pour l'expérience en procédant à une expérience de saturation de la puissance progressive où la hauteur crête-à-crête de la première CW dérivé signal RPE est mesurée en fonction de la racine carrée de la puissance micro-onde incidente.
        NOTE: Au pouvoir à micro-ondes inférieures, l'intensité du signal augmente proportionnellement à la racine carrée de la puissance tant la population des états de spin d'équilibre ne sont pas affectés. Cependant, si l'énergie est encore augmentée, la relaxation spin-réseau ne peut plus maintenir la différence de population d'équilibre des deux états de spin et l'amplitude du signal commence à plafonner ou "saturer". Au-delà de ce point, l'amplitude du signal peut effectivement diminuer avec l'augmentation observer la puissance en raison de l'inversion de population de assouvit de spin. En outre, pour les spectres élargi avec de vastes ailes où une ligne de base plate bien définie est pas visible, étendre la largeur de balayage à 150-200 G pour éviter la perte de la zone.
      5. Commencer avec l'aide d'une amplitude de modulation de 1,0 G.
        Remarque: Cette valeur est dépendante de l'échantillon et ajusté pour diminuer le bruit basse fréquence dans le signal. Si une trop grande valeur est utilisée, elle peut fausser ou élargir le signal.
      6. Réglez l'heure constante de temps et la conversion à 20,48 msec, balayer le temps de 20,97 secondes, et la résolution de 1024 points.
        NOTE: La constante de temps est également basé sur l'échantillon et est ajusté pour filtrer le bruit à haute fréquence.
      7. Après la première analyse, définissez le champ central au centre du signal EPR et de choisir la largeur de balayage de telle sorte que la trace comprend le signal et la ligne de base suffisante de chaque côté.
        NOTE: En outre, pour améliorer le rapport qualité / bruit du signal, d'augmenter le nombre de balayages en fonction de la puissance du signal EPR. Inclure la largeur de balayage et le nombre de points
      8. Mesurer l'accessibilité de l'étiquette de spin à collisionnel agents de détente O 2 ou de l' acide éthylènediaminediacétique (Niedda) protocoles de saturation à l' aide de puissance 27 décrit à l' étape 6.1.4.4.
        NOTE: Préparer Niedda comme décrit précédemment 26.
      9. Tout d' abord perfuser l'échantillon dans la cavité avec N2 pendant 5 minutes (pour rincer O 2). Mesurer les spectres pour chaque puissance micro-ondes entre 5 - 35 dB par pas de 3 dB avec une largeur de balayage de 30 G.
      10. Ensuite perfuser l'échantillon dans la cavité avec l'air pendant 10 minutes et de mesurer les spectres à différentes puissances de micro-ondes (5 - 35 dB par pas de 3 dB), comme dans l'étape 6.1.4.9.
      11. Incuber 20 pi de liposomes culot avec 180 ul de mM Niedda 50 (dans le tampon B ou tampon D) dans un 42 ºC au bain-marie pendant 5 min. Centrifuger l'échantillon et retirer le surnageant à l'aide d'une pipette. Charger l'échantillon dans le capillaire et le placer dans la cavité du résonateur. Répétez l'étape 6.1.4.9.
        NOTE: Le principe de l'expérience est que l'interaction avec la relaxine paramagnétiqueagents g par Heisenberg échange de spin empêcheraient la saturation du signal et inversion de population. Niedda soluble dans l' eau et soluble dans les lipides O 2 moléculaire sont utilisés comme rapporteurs pour l' eau ( à la fois en vrac et les antichambres intraprotein) et de la membrane des positions sur la protéine exposée, respectivement.
  2. L'analyse des données:
    NOTE: L'analyse des données EPR comprend les étapes suivantes: 14,22,23,25-27
    1. Calculer la mobilité de la sonde de spin (AH o -1), comme l'inverse de la largeur du premier spectre d'absorption dérivée de la ligne centrale. AH o -1 est le reflet de la liberté de mouvement ou de la dynamique de la sonde.
    2. Calculer le paramètre d'accessibilité (П), qui est une estimation de l'accessibilité de la sonde à d'autres agents de détente collisionnels paramagnétiques, en utilisant les étapes décrites ci-dessous.
      NOTE: Interaction du spin-sonde avec paramagnétiques détente agentsaméliore le taux de relaxation spin-réseau (T 1) du nitroxyde par Heisenberg échange de spin. 27
      1. Estimer le paramètre d'accessibilité (П) à partir des expériences de saturation de puissance (6.1.4.8) , dans lequel l'amplitude verticale de crête à crête de la ligne centrale du premier spectre RPE dérivé est mesurée à la puissance des micro - ondes différentes. 25 tracé de l'amplitude du signal en fonction de la racine carrée de la puissance de micro - ondes et un ajustement à l'équation 27 suivante.
        figure-protocol-1
        REMARQUE: où A est l'amplitude du signal est une mesure de l'homogénéité de la saturation de la raie de résonance (qui est habituellement compris entre 0,5 et 1,5), I est un facteur d'échelle, P est la puissance incidente, et représente le la valeur à laquelle la première amplitude dérivée est la moitié de sa valeur non saturée.
  3. Calculer AP 1/2 de la différence dans les valeurs P 1/2 en présence (O 2 ou Niedda) et l' absence (perfusées avec du N 2) de détente des agents paramagnétiques. Calculer le paramètre d'accessibilité (П) en utilisant l'équation:
    figure-protocol-2
    NOTE: Lorsque P 1/2 référence et AH référence o sont la moitié maximale valeur de saturation de la puissance et la largeur de la ligne centrale, respectivement, pour la norme de référence (comme DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl)) 27.

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Résultats

Caractérisation biochimique des Mutants GLIC Spin marqué

En suivant le protocole décrit ci-dessus serait typiquement donner GLIC-MBP protéine de fusion dans la gamme de 10 - 12 mg / litre de culture. Bien que cette valeur peut varier entre les différents mutants, en particulier pour les positions enterrées dans la protéine, le rendement peut être considérablement compromise. Dans ces cas, les volumes de cultur...

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Discussion

spectroscopie EPR est avérée être une approche structurelle sans précédent dans la quantification des changements conformationnels de protéines membranaires dans un environnement quasi-native. Cette approche nous permet un coup d'oeil dans les détails moléculaires de la dynamique des protéines qui sont obscurcis dans des structures à haute résolution de la cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique. Cependant, il est important de tenir compte des limites techniques de cette approche qui peut affe...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes très reconnaissants envers les membres actuels et anciens du laboratoire Chakrapani pour la lecture et les commentaires critiques sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health subvention (1R01GM108921) et l'American Heart Association (NCRP scientifique de développement Grant 12SDG12070069) et de SC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mutagénèse dirigée et mutations
10x tampon de réaction PfuUltra HFAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc&lrm ;N0447L10 mM chacun dNTP
pfu Ultra DNA polyméraseAgilent Technologies600380-512,5 U/ul
DPNINew England BioLabs Inc&lrm ;R0176S20 000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC mediaNew England BioLabs Inc&lrm ;B9020S
KanamycinFisher ScientficBP905
LB médiaInvitrogen127957084
Miniprep kitQIAGEN27106
C43 cellules compétentesLucigen60446
Expression et purification
GlucoseFisher ScientficD16
TryptoneFisher BioréactifsBP1421-500
Extrait de levureAmrescoJ850
GlycérolFisher BioréactifsBP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (isopropyl-thio-&beta ;-galactoside)Or BiotechnologieI2481C25
Trizma BaseSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
LeupeptineAmrescoJ580
PepstatineAmrescoJ583
DDM (n-Docecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Résine amyloseNew England BioLabs Inc&lrm ;E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltoseAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
Colonne de chromatographie vide en polypropylèneBioRad731-1550
Étiquetage par centrifugation
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-3-pyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonateToronto Reaserch chemicals IncO873900
(1-acétoxy-2,2,5,5-tétraméthyl-&Delta ; 3-pyrroline-3-méthyl)méthanethisiosulfonateToronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Reconstitution
Asolectinelipidique Avanti polar lipids Inc541602C
Biobilles (billes de polystyrine)Bio Rad152-3920
MéthanolProduits chimiques FisherA413
FRET
Fluorescéine-maléimideThermoFisher ScientificF-150
Tétraméthylrhodamine-maléimideThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti lipides polaires Inc850457C
POPGAvanti lipides polaires Inc840457C
E.coli extrait lipidique polaireAvanti polar lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
Mesure
Capillaires en plastique TPXBrukerER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)Aldrich158186
Ni(OH)2Aldrich283622
CysEPR

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