FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

Résumé

Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) imagerie est un outil puissant pour les études de biologie cellulaire en temps réel. Ici, un procédé pour les cellules d'imagerie FRET dans physiologiques microenvironnements en trois dimensions (3D) d'hydrogel en utilisant la microscopie à épifluorescence classique est présenté. Une analyse pour les sondes FRET ratiométrique qui donne des rapports linéaire sur la gamme d'activation est décrite.

Résumé

L'imagerie du Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) est un outil puissant pour l'examen de la biologie cellulaire en temps réel. Des études utilisant FRET emploient couramment (2D) la culture en deux dimensions, ce qui ne reproduit pas les trois dimensions (3D) microenvironnement cellulaire. Procédé pour effectuer l'émission trempée FRET imagerie par microscopie à épifluorescence Widefield conventionnelle des cellules dans un environnement d'hydrogel 3D est présenté. Voici une méthode d'analyse pour les sondes FRET ratiométrique qui donne des rapports linéaire sur la gamme d'activation de la sonde est décrite. Mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) niveaux est démontrée dans les chondrocytes sous stimulation par la forskoline en utilisant une sonde pour EPAC1 activation (ICUE1) et la capacité de détecter les différences de AMPc de signalisation en fonction du type de matériau d'hydrogel, ici un hydrogel de photoréticulation (PC-gel, diméthacrylate de polyéthylène glycol) et un hydrogel thermosensible (TR-gel). Par rapport aux méthodes 2D FRET,cette méthode nécessite peu de travail supplémentaire. Les laboratoires utilisant déjà l'imagerie FRET en 2D peuvent facilement adopter cette méthode pour effectuer des études cellulaires dans un microenvironnement 3D. Il peut en outre être appliquée au dépistage de drogues à haut débit dans microtissues 3D d'ingénierie. En outre, il est compatible avec d'autres formes d'imagerie FRET, comme mesure de l'anisotropie et de l'imagerie de fluorescence à vie (FLIM), et avec des plates-formes avancées de microscopie confocale en utilisant, pulsée ou illumination modulée.

Introduction

Signalisation cellulaire est à la fois complexe et en conséquence pour de nombreux domaines, y compris la pharmacologie, l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. outils d'enquête utiles sont nécessaires pour approfondir notre compréhension de la biologie cellulaire et de développer des matériaux optimaux pour la régénération des tissus. Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) imagerie est un outil essentiel permettant l' analyse de l' activation du récepteur, conformation moléculaire, et les interactions supramoléculaires (par exemple., Protéines / ADN complexation) dans les cellules vivantes. FRET est un type de transfert d'énergie non radiatif entre fluorophores ^1. Il a une efficacité qui est inversement proportionnelle à la puissance six de la distance entre un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur. Ainsi, il peut fournir des informations sur la distance spatiale entre deux molécules différentes ou à travers des régions d'une molécule à l'échelle du nanomètre (typiquement 1 - 10 nm) ^2. Les fluorophores donneur et accepteur peuvent être différents mles types olecule (hétéro-FRET), dans lequel le donneur a l'émission d'énergie plus élevée (plus courte longueur d'onde), ou du même type (homo-FRET). FRET imagerie peut être effectuée sur des cellules fixées ou vivantes, mais en général, les cellules fixes sont utilisés pour l'imagerie des interactions moléculaires à haute résolution spatiale lorsque les systèmes confocale à grande vitesse ne sont pas disponibles. Les cellules vivantes sont utilisées pour étudier les interactions et les processus qui sont inhibés ou modifiés par la fixation, tels que le temps réel intracellulaire de signalisation de réponse ^3.

Des études de cellules vivantes qui emploient FRET utilisation d'imagerie en deux dimensions (2D) cultures cellulaires en partie à cause de la simplicité et de fond plus faible (pas d'émission à partir de cellules d'avion). Cependant, les cultures 2D modifient également de nombreux processus cellulaires par rapport au microenvironnement physiologique et en trois dimensions (3D) la culture ^4,5. Par exemple, la cellule originaire de la cellule et la cellule à des interactions de la matrice extracellulaire sont radicalement modifiée dans la culture 2D menant aux easily a observé des changements dans la morphologie des cellules et la polarité ^6. Microdomaines membranaires (par exemple., Cavéoles et radeaux lipidiques) et la signalisation du récepteur sont fortement réglementés par l'environnement de la culture, en partie parce qu'ils se lient les composants du cytosquelette ^7,8 et la structure de la forme des cellules et du cytosquelette sont fortement réglementées par l'environnement de la culture spatiale ^9. Mécanotransduction est influencée non seulement par la matrice 3D, mais les conditions de charge secondaires plus complexes engendrés dans des environnements 3D en 2D par rapport à des cultures ^10. Enfin, la perméabilité de la matrice 3D est inférieure au milieu de culture, en général à une diminution de la diffusion et une liaison accrue des molécules de signalisation cellulaire par rapport à des cultures 2D. Avec des cultures 3D on est en mesure de créer et d'observer un microenvironnement plus semblable à la physiologique par rapport à l'adhésif, chimique, et des signaux mécaniques. Cellule d'interactions cellulaires peut être favorisée et les propriétés adhésives peut être contrôlé wvec la structure, la composition et l' architecture (motif) du matériau 3D ^11-13. Les propriétés mécaniques du matériau peuvent également être adaptés par la composition et la structure ^14,15. La culture de cellules en hydrogels donc permis FRET études sur des cellules primaires qui seraient autrement de-différencier les ou changement dans le phénotype en utilisant des techniques classiques, par exemple., Les cellules de cartilage articulaire. Ainsi, un procédé est nécessaire pour permettre des analyses FRET dans des cultures 3D en direct.

échafauds hydrogels sont idéales pour des études basées FRET 3D, car ils peuvent être optiquement transparents et adaptés pour commander le micro-environnement et pour fournir des signaux cellulaires. Hydrogels à base de polymères naturels ont été utilisés dans la culture cellulaire pendant des décennies, y compris la gélatine et la fibrine ^16. Meilleur contrôle sur le microenvironnement cellulaire peut être obtenue avec une modification chimique de ces polymères et avec l'utilisation de polymères synthétiques , ^17,18. hydrOGEL rigidité mécanique et de la perméabilité peut être contrôlée en modifiant leur composition polymère et la taille des mailles (polymère et la densité de réticulation) ^19,20. De plus, les hydrogels peuvent être biologiquement active par l'incorporation de facteurs de croissance et des ligands cellulaires. En raison de ces possibilités, le développement d'hydrogels pour les biocapteurs, la délivrance de médicaments, et les applications d'ingénierie tissulaire est un domaine de recherche très actif ^21. L' impression 3D d'hydrogels est également en cours de développement pour la fabrication de micro-tissus et -organs ^15. Ainsi, FRET imagerie des cellules dans les hydrogels est utile non seulement comme moyen de rapprocher le comportement cellulaire physiologique, mais aussi comme un outil pour étudier et optimiser la croissance de l'ingénierie tissulaire.

Les sondes FRET ratiométrique binaires sont très utiles pour étudier la signalisation cellulaire et peuvent être utilisés dans des cultures d'hydrogel. Pour une liste partielle des fluorescente publiée et FRET sondes, voir le site web cellulaire Migration Consortium ^{22. Le type de sonde la plus courante comporte deux fluorophores différents qui sont associés ou reliés par un élément de reconnaissance (s) (substance à analyser région sensible). Ces régions subissent un changement conformationnel, l' association ou la dissociation lors de la détection de l'analyte (par ex., La liaison d'un ion ou d'une molécule, le clivage enzymatique de la région) qui modifie la distance entre fluorophores et donc l'amplitude de FRET (supérieure ou inférieure) 23. Un type de sonde moins commune mais utile repose sur un changement sensible de l'analyte dans le chevauchement spectral des deux fluorophores, qui modifie FRET grandeur. "Monocaténaires" ratiométrique sondes utilisent une paire de fluorophore lié à une seule molécule. "Double chaîne" sondes utilisent des paires de fluorophores sur des molécules séparées, mais leur expression peut être couplé sous la même cassette d'expression 24. Contrairement aux études avec une expression unique de fluorophore (par exemple., Des protéines de fusion fluorescentes), des études avec ratiométriqueLes sondes FRET ne nécessitent pas de double transfection pour contrôler l'efficacité de la transfection ou la viabilité cellulaire. Sondes Ratiométrique FRET sont relativement insensibles à l' efficacité de transfection lorsqu'il est exprimé ci - dessus d' un seuil minimal (concentration insensible) 23,25. Ils sont insensibles aux fluctuations de la source d'excitation et d' autres facteurs du milieu intracellulaire (par ex., Le pH, des ions) tant que les deux fluorophores sont sensibles de manière similaire. En outre, leur réponse est non soumis à un retard de la transcription, à la différence de fluorescence et bioluminescence promoteur-rapporteur construit des 26,27.}

sondes Ratiométrique FRET sont facilement et fréquemment utilisés dans les systèmes classiques de microscope Widefield à épifluorescence. microscopes grand champ sont préférés balayage de ligne des systèmes confocale pour l'imagerie des cellules vivantes en raison de préoccupations sur le coût du système, fluorophore blanchiment, et la capture de signaux change avec une résolution temporelle suffisante. En outre, anal cellulaire uniqueyse sur une grande population de cellules est possible avec une capture de la scène et de l'image motorisé sur plusieurs champs de vision. La microscopie à champ large nécessite une analyse d'intensité en fonction des signaux de sonde hétéro-FRET. Bien que l' analyse de l' intensité ne nécessite pas de matériel complexe comme d' autres méthodes FRET, plus de travail post-acquisition est nécessaire pour corriger les effets des comportements fluorophores et configurations système microscope / d'imagerie ^28. L'intensité d'émission d'un fluorophore capturé est une fonction de l'énergie d'excitation, un fluorophore rendement quantique, et le filtre combiné et un appareil photo / détecteur de sensibilité spectrale et la linéarité ^2. Ceux-ci peuvent être différents pour le donneur et accepteur et nécessiteront l'étalonnage pour l'analyse quantitative. En outre, l' imagerie de l'émission de l' accepteur est influencée par le chevauchement spectral des fluorophores (excitation de l' accepteur par la lumière d' excitation et de donneur transpercement d'émission du donneur dans les spectres d'émission de l' accepteur) ^2.4; à chaîne unique "sondes sont normalisées à l' intérieur parce que leurs fluorophores sont équimolaire à l'échelle nanométrique, tandis que les fluorophores de" double-chaîne "sondes peuvent exister à différents stoechiométries à travers une cellule ^25,28 Si les fluorophores de." Chaîne unique " les sondes sont de même luminosité (fonction du coefficient d'extinction et le rendement quantique), les effets de la sensibilité du détecteur non linéaire sont petites et que la correction pour la fluorescence de fond et le quantum de sensibilité / rendement détecteur couplé est nécessaire ^23. Ainsi , " à une seule chaîne" sondes ratiométrique FRET sont plus facilement mises en œuvre en Widefield microscopie ^24.

Ce document décrit une technique simple pour effectuer FRET imagerie de cellules vivantes dans les cultures d'hydrogel 3D à l'aide d'un microscope Widefield épifluorescent classique. Il peut être facilement adopté par les laboratoires effectuant des expériences déjà FRET en 2D, ainsi laboratoires intéressés par interla signalisation cellulaire dans microtissues. Ici, nous démontrons la méthode de mesure de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc), les niveaux de chondrocytes vivants dans photoréticulation (PC-gel, le polyéthylène glycol diméthacrylate) et thermosensible (TR-gel, Matrigel) des hydrogels à base d'imagerie FRET. Une sonde FRET ratiométrique est utilisé sur la base EPAC1 (ICUE1) afin de détecter les taux d'AMPc en réponse à la forskoline, un agoniste chimique pour l'adénylcyclase qui catalyse la conversion de l'ATP en AMPc. AMPc est l'un des principaux seconds messagers médiatrices G la signalisation des récepteurs couplés à la protéine et active de divers facteurs, y compris les protéines d'échange en aval directement activés par l'AMPc (EPAC). Les fluorophores se séparent lors de la liaison de l'AMPc au domaine EPAC entraînant une diminution de FRET. Décrite ici est la préparation des matériaux d'hydrogel, la transfection de cellules avec la sonde ICUE1, et l'incorporation des cellules dans les hydrogels 3D. La procédure d'expérimentation 3D FRET et l'analyse d'image nécessairepour évaluer l'activité de la sonde par cellule sont expliquées. Nous discutons également des limites inhérentes à l'analyse FRET en 2D et 3D en utilisant la microscopie à champ large. La technique présentée ici représente une amélioration par rapport aux méthodes existantes en 2D, car elle permet une analyse dans un contexte plus physiologique et nécessite moins de correction d'image et d'étalonnage. Une grande utilité réside dans le fait que beaucoup de matériaux transparents peuvent être utilisés tandis que les préférences de la cellule et la transfection peuvent être maintenues.

Protocole

1. Préparation des matériaux

1. Préparer diméthacrylate de polyéthylène glycol (PEGDM, 4000 MW) par methacrylating polyéthylène - glycol selon les procédés décrits par Lin Gibson et al. , ^29. Alternativement, PEGDM peut être acheté.
2. Synthétiser le photoinitiateur, le lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), à travers un processus en deux étapes où le premier phénylphosphonite de diméthyle est mis à réagir avec le 2,4,6-trimethylbenzoyl chlorure par une réaction de Michaelis-Arbuzov, puis le sel de lithium créée par l' ajout de bromure de lithium dans du 2-butanone, conformément Majima et al. , ^30.
   Note: Alternativement, d' autres photoinitiateurs peuvent être achetés , mais LAP montre une meilleure biocompatibilité et réticulation d' efficacité ^31.
3. Fonctionnaliser les lamelles de verre pour permettre la liaison de l'hydrogel sur le verre et ainsi empêcher tout mouvement lors de l'imagerie.
   1. Dans une hotte chimique avec un équipement de protection adéquat, l'utilisation3- (triméthoxysilyl) propyle , le méthacrylate d'selon le protocole du fabricant pour les PC-gels et les époxy silanes (3-glycidoxypropyltriméthoxysilane) pour ^TR-31 gels. Remarque: Alternativement, les diapositives prérevêtues peuvent être achetés. Notez que la lamelle doit être plus grand que le bien du plat PDMS à l'étape 3.8.

2. Cellule Transfection

1. Dans une culture hotte de tissus et en utilisant des techniques stériles, dégel et plaque les cellules souhaitées au sous-confluence (50 - 70%), les chondrocytes bovins ici à 15.000 cellules / cm ² à 6 puits des boîtes de culture non-traités. Remarque: Tout type de cellule concernée peut être utilisée, y compris les cellules indépendantes d'ancrage.
   1. Laisser les cellules récupérer pendant un jour dans un incubateur à 37 ° C. Avant les étapes suivantes, éliminer le milieu, rincer avec du PBS, et ajouter du milieu 2 ml de phénol et sans sérum par puits.
2. Le lendemain, pour chaque puits, ajouter 100 pi de milieu phénol- et sans sérum ainsi que 3ul de réactif de transfection dans un tube à essai en verre autoclavée. Pour mélanger, agiter le tube légèrement. Incubation à température ambiante pendant 5 min. Limitez toute exposition à la lumière.
3. Ajouter 1 pg FRET la sonde ADN et secouer légèrement. Laisser incuber le mélange à la température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 30 min.
   Remarque: Dans cette expérience ICUE1 plasmidique (avec la permission du Dr Jin Zhang ³³⁾ a été utilisé. Les fluorophores en ICUE1 sont cyan protéine fluorescente (PCP, donneur) et la protéine fluorescente jaune (YFP, accepteur). Le rapport du réactif de transfection à l'ADN plasmidique sera besoin d'ajustement pour une transfection optimale des différents types de cellules.
4. Distribuer le mélange préparé (~ 104 pi) goutte à goutte à chacun des 6 puits contenant des cellules plus 2 ml de phénol et un milieu sans sérum. Ne pas pipeter de haut en bas. Agiter doucement la plaque pour mélanger.
5. Incuber à 37 ° C pendant 48 heures. Remarque: inhibe la confluence efficacité de transfection et modifie l'expression endogène des récepteurs.

3. Fabrication dePDMS Moules pour Hydrogel Fonderie et Culture

1. Pour préparer une lame de verre grand pour lancer le polydiméthylsiloxane (PDMS) sur, nettoyer la vitre d'abord avec du savon, rincer avec une grande quantité d'eau, puis sécher avec de l'isopropanol suivi par air.
   1. Traiter le verre avec un réactif de siliconage selon le protocole du fabricant afin que les PDMS peuvent facilement être décollée après durcissement. Rincer réactif résiduel hors de la surface avec du toluène sur un récipient de captage. Laisser la surface sécher à l'air complètement avant ou utiliser la chaleur à 100 ° C pour raccourcir le temps d'attente.
2. Sélectionner une hauteur d'hydrogel (par exemple, 1 mm) et calculer à 1,2 fois le volume de PDMS nécessaire pour couvrir la lame de verre avec des PDMS de cette épaisseur avec les dimensions de la lame de verre et la hauteur d'hydrogel. Remarque: PDMS ne rétrécit pas.
   1. Mélanger les composants du kit PDMS à un ratio de 10: 1 en poids dans un bécher. Une fois qu'il est bien mélangé, placer le bécher sous le vide de dégazer. RelIEVE le vide si des bulles commencent à déborder le récipient et répéter.
      Remarque: D'autres épaisseurs d'hydrogel peuvent être utilisés, mais au prix de l'augmentation de fond et une opacité accrue si centrifugation (étape 6.2) n'est pas utilisé.
3. Envelopper de papier d'aluminium autour de la base et les côtés du verre pour contenir les PDMS. Versez délicatement la quantité désirée de PDMS dégazés sur ce verre entouré par feuille. Mesurer la hauteur PDMS. Gardez à l'esprit que la hauteur du PDMS sera la hauteur maximale de l'hydrogel. Si les bulles sont créées lors de la coulée, dégazer à nouveau ou les faire éclater avec une spatule ou d'une aiguille.
4. Placez les PDMS non durcis sur une surface plane dans un four à 100 ° C pendant 2 heures, ou le laisser à température ambiante pendant 24 heures.
5. Retirez délicatement les PDMS de la surface une fois durci. Découper la forme souhaitée (par exemple, poinçon cylindrique de 3 mm) pour les hydrogels.
   Note: photoréticulation produira légèrement plus étroites cylindres PC-gel que le diamètre du moule en raisonà la trempe de la réaction par de l'oxygène moléculaire dans le PDMS.
6. Stériliser les PDMS poinçonnés. Pour les expériences à court terme, immerger le PDMS dans 70% d'éthanol pendant 1 heure.
7. Assembler le moule en ajustant la base de PDMS stérilisées avec une lamelle de verre stérile d'une épaisseur adaptée à la correction de microscope objective. Mettez de côté pour une utilisation à l'étape 6.
8. Fabriquez un plat PDMS plus grande en utilisant les méthodes ci-dessus (avec un puits plus large et plus haute que l'hydrogel) pour contenir l'hydrogel et moyen. Accommodez un volume moyen au moins 10x plus que l'hydrogel pour immerger l'hydrogel et de minimiser la dilution de l'analyte.

4. Préparation des hydrogels Précurseurs Solutions

1. Dans une culture hotte de tissus et en utilisant des techniques stériles, préparer l'hydrogel solutions de précurseur approprié pour l'étude immédiatement avant d'ajouter les cellules. Préparer PC-gel à partir d'un précurseur de polymère de la manière suivante.
   1. Mélanger la poudre PEGDM dans un tampon phosphate salin (PBS, pH 7,2) à 10% (p / v).
   2. Ajouter le photoamorceur (par exemple, LAP) à une concentration finale de 0,005 à 0,01% (p / v) et mélanger par pipetage. Couvrir la solution avec du papier d'aluminium ou de blindage de la lumière comme LAP est sensible à la lumière.
      Remarque: ici le facteur de matrice extracellulaire de croissance réduit TR-gel est utilisé tel que fourni par le fabricant.

5. suspension cellulaire dans les solutions hydrogels

1. Dans une hotte de culture tissulaire et en utilisant des techniques stériles, aspirer le milieu à partir des puits.
2. Ajouter PBS dans les puits, puis retirez bien rincer monocouches de cellules attachées.
3. Dissocier les cellules du substrat de culture à l' aide de 2 à 3 ml par 25 ^cm2 de solution de dissociation cellulaire. Roche doucement, puis incuber à 37 ° C pendant 10 - 20 minutes, ou jusqu'à dissociées. Fermement robinet plat si nécessaire pour déloger les cellules.
   Remarque: Les solutions de dissociation cellulaire alternatifs sont disponibles avec une sélection limitée à ceux qui ne sont pas impact la voie de signalisation en cours d'analyse par clivage des récepteurs d'intérêt.
4. Après que les cellules sont détachées, ajouter 2 ml de milieu phénol- et sans sérum, les cellules en suspension, et compter les cellules avec un hémocytomètre. Remarque: milieu sans sérum chimiquement défini (par exemple, additionné d'insuline, de la transferrine et le sélénium) peuvent également être utilisés.
5. Aliquoter le nombre désiré de cellules sur la base du type de cellules dans des flacons stériles et granulés (par exemple, les cellules à 2,0 x 10 ⁶ par flacon).
6. Éliminer le surnageant, ajouter le volume désiré de précurseur d'hydrogel et les cellules en suspension par pipetage. Utiliser un volume de précurseur qui produira 2 x 10 ⁵ cellules / cm ² dans le plan xy lors de la visualisation de l'axe z de l'hydrogel affaissé (par exemple 1,0 ml par flacon pour un hydrogel à 1 mm d' épaisseur contenant 2 x 10 ⁶ cellules / ml). Prenez soin de ne pas produire des bulles.
   1. Se déplacer rapidement à l'étape suivante pour limiter les effets négatifs sur ³⁴ viabilité des cellules ^</ Sup>.

6. Hydrogel Préparation

1. Dans une culture tissulaire et le capot en utilisant des techniques stériles, ajouter le précurseur d'hydrogel contenant des cellules dans les moules de fonderie préparés à l' étape 3 (par exemple, 7,1 ul par 3 mm de diamètre x 1 mm moule). Créer un hydrogel supplémentaire, selon les mêmes méthodes décrites, à utiliser pour l'étalonnage du système d'imagerie de microscope et la sonde d'étalonnage (si l'efficacité de la sonde inhérente est inconnue).
2. Centrifuger le précurseur d'hydrogel avant la gélification / réticulation pour optimiser la formation d' image en limitant les cellules à un seul plan focal et en minimisant signal hors plan contenant les cellules préparées (figure 1). Ajuster le temps de centrifugation et de la force du type de cellule et de la viscosité du précurseur (400 g pendant 4 minutes).
3. Un gel ou réticuler la solution
   1. Pour l'hydrogel PC-gel, irradier le précurseur contenant des cellules avec un UV-A source de lumière (λ = 365 nm) pendant une durée d'exposition égale à3,2 J / cm ² par millimètre d' épaisseur à photocrosslink.
      Remarque: Utilisez une épaisseur minimale de 1 mm dans le calcul. Exposures devraient tomber dans la gamme 1-5 min. Utilisez le temps d'exposition minimum. Évitez de trop irradier les cellules car cela diminue la viabilité et l'eau de Javel du donneur PCP. Cependant, les temps d'exposition à moins de 60 s ne sont pas recommandés, car l'irradiation à haute intensité conduit à l'auto-extinction radicale et faible viabilité cellulaire.
   2. Pour l'hydrogel TR-gel, placez le moule rempli dans une boîte de Pétri et de passer à un incubateur pour gelate thermiquement. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
4. Après gélification ou de réticulation de l'hydrogel, retirer le moule de coulée hydrogel PDMS et le remplacer par le plus grand plat préparé PDMS (de l'étape 3.5). Appuyez sur les PDMS vers le bas sur le verre avec une spatule stérile pour la faire adhérer.
   1. Placer ce PDMS plat avec lamelle dans un récipient stérile, comme une boîte de Pétri. Ajouter un milieu sans sérum exempt de phénol ou chimiquement me définidium (milieu sans sérum complété avec de l'insuline, de la transferrine et de sélénium (étape 5.4)) pour le bien créé avec le plat PDMS et lamelle pour maintenir l'hydrogel immergé. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
      Remarque: Si vous utilisez un plat spécialisé avec une lamelle, puis placer la lamelle en cela et ajouter de la même moyenne.
   2. Sinon, effectuer cette étape la veille imagerie FRET pour permettre aux sondes pour récupérer les longueurs d'onde d'irradiation se chevauchent avec le spectre donneur d'excitation PCP.

7. 3D FRET Imaging

1. Retirer le plat PDMS avec l'hydrogel de la boîte de Pétri, préparé à l' étape 6.4, et le fixer dans un porte-échantillon réglable pour la phase XY de microscope (Figure 2). Positionner le porte-échantillon sur la platine du microscope. Appliquer de l'huile à l'objectif si nécessaire. Utilisez un objectif d'au moins 40X et de grande ouverture numérique (NA) (c. -à- 1,3 NA) pour capturer le relativement faible fluorophoreémission e.
2. Configurer les champs de vision (FOV) pour l'acquisition d'images: Sélectionnez les cellules pour l'imagerie en utilisant l'imagerie lumière transmise et vérifier la transfection avec l'imagerie de fluorescence. Choisissez au moins 15 cellules différentes.
   1. Sélectionnez les cellules qui ne sont ni trop clair ni trop faible (qui pourrait autrement conduire à sonde sur-saturation ou de faible sensibilité) et le ratio de FRET entre 0,0 et 1,0 (qui indique le contraire dommage ou désintégration de la sonde binaire). Ensuite, éteindre la lumière pour limiter l'exposition.
   2. Sélectionnez FOV à proximité du centre de l'hydrogel et avec les cellules d'intérêt dans le champ d'éclairage relativement plat (Voir Figure 3B et Etape 9.2 ci - dessous).
3. Configurez les réglages de l'appareil pour les canaux d'image FRET. Choisissez parmi les quelques cellules à proximité du centre de la FOV pour optimiser les "configurations optiques" (ie., L' exposition et le gain par canal d'image).
   Note: La nomenclature ci-dessous varie depending du logiciel utilisé pour faire fonctionner le microscope et la caméra. Le logiciel de microscope, NIS-Elements, est utilisé ici pour la capture d'image et d'analyse.
   1. Pour l'analyse FRET de sondes à une seule chaîne, sélectionnez deux canaux d'image par FOV: Trempé émission (QE), qui est l'émission du donneur sous excitation du donneur et accepteur émission sous accepteur excitation (Aem).
      Note: Pour la sonde ICUE1 CFP-YFP, une paire pour QE CFP excitation et filtre d'émission (418-442 ex, 458-482 em) et une excitation et d'émission paire YFP pour Aem (490-510 ex, 520-550 em) sont utilisés.
   2. Réglez l'exposition pour QE et Aem pour acquérir l'intensité maximale du signal sans saturation (et si vous utilisez un CCD, avec le gain minimal possible) pour minimiser le bruit de fond. Maintenir les configurations optiques identiques pour les deux fluorophores et tout au long de l'expérience, ainsi que parmi les groupes expérimentaux pour éviter de biaiser les résultats ( par exemple, la puissance d'excitation, la taille de l' iris, l' exposition et le gain de la caméra) (figure 3A).
   3. Acquérir des canaux d'image supplémentaires pour permettre plus d' options d'analyse après l' acquisition (par exemple, corrigée émission sensibilisée (Cse) Imagerie (voir Discussion)). Pour la sonde ICUE1 CFP-YFP, acquérir l'excitation (Ex) et d' émission (Em) canaux Ex _donneur - Em _donneur (QE, sélectionnez CFP-CFP dans le logiciel de microscope), Ex _donneur - Em _accepteur (SE, sélectionnez CFP - YFP), Ex _accepteur - Em _accepteur (Aem, sélectionnez YFP-YFP) et Ex _accepteur - Em _donneur (YFP-CFP) configurations (voir la figure 3A).
4. Configurez le taux de capture pour l'acquisition d'images temps-lapse.
   1. Diminuer le taux de capture si elle est limitée par le matériel. Pour les essais à court terme (par exemple, 30 - 60 min), représentent environ 12 acquisitions par minute pour chaque FOV (taux d'échantillonnage de 5 sec) pour capturer la cinétique de signalisation. Utiliser le taux d'échantillonnage minimum nécessaire pour éviter signiphotoblanchiment tivement la sonde.
   2. Régler la vitesse d'acquisition en tapant la périodicité des captures dans le logiciel de microscope. Pour les essais à long terme (par exemple., 24 h), commencer par le taux élevé d'acquisition pour capturer la réponse impulsionnelle initiale, puis passer à une vitesse d'acquisition faible, par exemple, toutes les 5 à 10 min.
5. Sélectionnez "Exécuter maintenant" dans le logiciel de microscope pour lancer l'acquisition et la capture d'image des images pendant 5 minutes pour établir une base de référence pour la réponse de la sonde aux FOV désignés.
6. Après 5 min de l' acquisition d'image, pipettes dans l'agoniste ou un antagoniste analyte désiré (par exemple, la forskoline à 100 nM), mélanger par pipetage, et continuer l' imagerie.

8. FRET Calibration

1. Etalonnage du système: Utiliser l'hydrogel d'étalonnage supplémentaire, fabriqué comme décrit dans l'étape 6, pour acquérir des images Aem d'au moins 6 cellules représentatives en utilisant les mêmes critères FOV, configurations optiques et jeu de la caméraréglages utilisé pour FRET imagerie ci-dessus (étapes 7.1, 7.2, et 7.3).
   Remarque: La quantification du rendement quantique et de la sensibilité spectrale (QS) pour le système de sonde et d'imagerie de microscope combinée est nécessaire pour l'analyse «absolue» mais non FRET FRET "relatif".
   1. Photobleach le fluorophore accepteur en sélectionnant une longue exposition de 5 min à la lumière d'excitation à pleine intensité (excitation sur le canal Aem). Utilisez une ouverture étroite pour blanchir seulement les cellules d'intérêt. Vérifiez que le signal Aem est d'au moins 10% inférieur à celui du signal original en comparant l'histogramme de l'intensité du signal (fenêtre "LUT") avant et après photoblanchiment. Continuer photoblanchiment si la perte de signal est inférieur à 90%.
      Remarque: Vérifiez que le fluorophore donneur est non blanchie au cours de cette procédure en utilisant des filtres d'excitation Aem qui ne se chevauchent pas avec le spectre donneur d'excitation.
   2. Acquérir émission du donneur sous donneur d'excitation avec le fluorophore accepteur maintenant blanchi (Dem) nousment la même configuration optique pour QE à l'étape 7.3.
   3. Calculer QS par pixel comme Dem divisé par Aem après correction de fond, comme dans la section 9 ci-dessous. QS = Dem / Aem
   4. Calculer la moyenne QS parmi les cellules des moyennes cellulaires.
2. Estimer l'efficacité de FRET inhérente de la sonde (Ei) en utilisant l'échantillon d'étalonnage. Provoquer FRET maximum de la sonde et calculer Ei = 1 - QE / (Aem x QS) de l'article 9 ci-dessous. Alternativement, utilisez Ei = Cse / Aem, ou Ei calculées en utilisant un test de point de terminaison classique pour une efficacité FRET avec Ei = 1 - (QE / Dem).
   Note: Ei est nécessaire de quantifier la fraction absolue des sondes activées (FAP, à savoir, la fraction de sondes analyte de liaison), mais pas nécessaire pour l' analyse "relative" FRET.
   1. Saturer réponse de la sonde en stimulant la culture avec un agoniste de la production analyte / activation pour les sondes qui augmentent en FRET lors de l'interaction avec l'analyte.
   2. Inhibition sonde INTERACTIONSn avec l'analyte en utilisant un antagoniste de la signalisation pour les sondes qui diminuent en FRET lors de la liaison de l'analyte. Remarque: Dans le cas de la sonde ICUE1, supprimer les niveaux de AMPc avec une inhibiteurs adényl cyclase tels que 2 ', 5'-dideoxyadenosine (spécifique) ou 3-isobutyl-méthyl-xanthine (non spécifique).

9. FRET Ratio Calcul

1. Dessiner et désigner une région d'intérêt (ROI) par FOV près des cellules pour définir le niveau de fond (figure 3B) dans chaque FOV au fil du temps, mais limiter le retour sur investissement à la zone d'éclairage relativement homogène sur le centre de l'image (figure 4A ). Voir la discussion pour une explication des options de correction d'arrière-plan.
   1. Avec le logiciel de microscope: Sélectionnez la flèche sur l'icône "Contexte de ROI" et sélectionnez "Dessiner le fond Elliptique ROI" (d'autres formes vont travailler). Assurez-vous que "Keep Mise à jour de fond Offset" est sélectionné. Activer vieaile du ROI de fond en cliquant sur l'icône d'arrière-plan ROI. Vous pouvez également utiliser l'icône «ROI» et les propriétés de ROI définies comme "Utiliser comme fond d'un retour sur investissement» et «ROIs sont différentes dans chaque multipoint".
   2. Avec ImageJ: Utilisez la barre d'outils pour sélectionner l'outil de dessin circulaire. Puis ajouter la forme au gestionnaire de ROI via le menu "Analyser → Outils → ROI Manager". Définissez une couleur différente pour le retour sur investissement de fond dans le gestionnaire de ROI si désiré.
   3. Pour chaque canal FOV et de l' image (par exemple, QE et Aem), soustraire la valeur moyenne dans le retour sur investissement de fond par point de temps pour créer une image corrigée par canal, par exemple, SQE _{t, p} = QE _{t, p} - BQE _{t, p} où t est le temps d'acquisition, p est égal à l'angle de champ ( par exemple, la position xy), et Bqe et BAEM sont les valeurs scalaires du signal à l' intérieur de la ROI de fond. Utilisez les fonctions arithmétiques d'image disponibles dans le logiciel.
      1. Wvec le logiciel de microscope, utilisez l'icône "ROI de fond" et sélectionnez "Background Soustraire Utilisation de retour sur investissement". Dans la fenêtre pop-up, sélectionnez "Chaque image" sous "fond Soustraire retour sur investissement" et sélectionnez "Tous les cadres" sous "Appliquer à".
         Note: Un retour sur investissement de fond doit être défini dans chaque FOV pour cette fonction pour fonctionner correctement (par exemple, la fonction ne correctement soustraire pas de milieux pour FOV avec ROIs de fond si certains FOV ont undefined ROIs de fond.).
      2. Avec ImageJ, utilisez le "Soustraction BG de ROI" macro écrite par Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
   4. Enregistrer la série temporelle corrigée des images en sélectionnant "Enregistrer sous" pour les étapes d'analyse suivantes.
2. Définir un retour sur investissement autour de la cellule à l' aide d' un masque binaire pour chacune des cellules en cours d' analyse dans chaque champ de vision (figure 4B). Utilisez le canal Aem au seuil de l'image par FOV au début of l'expérience, déterminer les limites de la cellule, et a défini le ROI. Save the ROIs.
   1. Avec le logiciel de microscope: Pour chaque trame (ie, FOV), utilisez d' abord le menu "binaire → Définir Threshold" et sélectionnez "appliquer à la trame courante". Réglez la valeur de seuil inférieure pour sélectionner les cellules. Ensuite, utilisez la fonction "binaire → Close" pour remplir les trous dans le masque binaire si nécessaire. Ensuite, utilisez l'icône de ROI pour sélectionner "Copier binaire ROI"; la couche binaire est automatiquement supprimé.
      1. Append ROIs pour les images suivantes à la piscine existante de ROIs. Supprimez tout ROIs parasite. Suivant "clic-droit" sur le ROIs et assurez-vous que leurs propriétés sont "Utilisation comme standard ROI" et "ROIs sont différentes dans chaque multipoint".
      2. Avec ImageJ: Pour chaque FOV, utilisez d'abord le menu "Image → Ajuster → Seuil". Ensuite, utilisez "Analyser → analyser des particules» avec Afficher Outlines et Ajouter au gestionnaire sélectionné. Utilisation"Binaire → Fermer" pour remplir des "trous" dans le masque binaire si nécessaire. Supprimer parasite ROIs. plugins gratuits sont disponibles pour automatiser ce processus.
3. Calculer le QE basé ratio de FRET à chaque pixel, SQE / SAEM pour l' analyse relative (Voir l' étape 10) et E _QE = SQE / (QS x SAEM) pour l' analyse absolue (voir l' étape 10) avec QS obtenu à l' étape 8.1. Utilisez flottante division point des images. Voir la section de discussion pour une explication des dérivations de rapport.
   1. Avec le logiciel de microscope: Utilisez le menu «Image → image Opérations" et sélectionnez "virgule flottante".
   2. Avec ImageJ: Utilisez soit le «Processus → Photo Calculator" fonction ou le plug-in "Calculator_Plus.java". Remarque: Sinon, la macro "pH_ratioMacro" .txt "peut être adapté pour calculer les ratios de FRET Il utilise la macro de correction de fond décrit ci-dessus et est disponible à.
4. Exporter le rapport moyen par cellule (ie, par ROI) dans un logiciel de tableur et de graphiques.
   1. Avec le logiciel de microscope: Utilisez soit le bouton d'exportation ND dans le "Statistiques ROI" contrôle de l'analyse ou le bouton "Spreadsheet Export" dans le "Temps d'analyse" contrôle de l'analyse.
   2. Avec ImageJ: Sélectionnez d'abord le menu "Analyser → Définir mesures" et assurez-vous que la «valeur moyenne» et «écart-type» sont sélectionnés. Ensuite, utilisez le gestionnaire de ROI et sélectionnez le bouton "Mesure". Enregistrer la fenêtre des résultats générés.

Ratio 10. FRET Analyse

1. Calculer le ratio de FRET cellulaire moyenne dans le temps à partir des ratios moyens par cellule (exporté à l'étape 9.4). Considérons la ligne de base de FRET ratios (le rapport avant d'administrer la substance à analyser) dans ce calcul.
   Note: Tableur et logiciel graphique est utilisé ici pour tracer la ligne de base-subtragi ratios moyens de FRET et leur erreur standard de la moyenne (SEM) en utilisant une régression linéaire sur la ligne de base comme dans l' étape 10.1.2 et 10.1.3 ci - dessous (figures 5 et 6).
   1. Analyse relative (amplitude de la réponse): Normaliser chaque courbe à un échantillon de référence commun (par exemple, un échantillon non traité.).
   2. Analyse absolue (évolution temporelle de la réponse): Maj les courbes à un point de départ commun en normalisant chaque courbe avec sa ligne de base FRET ratio.
      1. Dans le logiciel de feuille de calcul et graphique, entrelacer les données (colonnes de ratios moyens par cellule) avec de nouvelles colonnes, de telle sorte que chaque colonne d'origine est jumelé avec une nouvelle colonne ne contenant que des données de rapport pour la période de référence (rapports avant analyte ajouté). Sélectionnez «Insérer une colonne" pour insérer une colonne vide après chaque colonne de données. Ensuite, copiez les données de base dans les colonnes vides appariés.
      2. Dans le logiciel de feuille de calcul et graphique, sélectionnez "Insérer → Nouvelle analyse → Transform Retirez la ligne de base "et réglez ensuite" colonne Sélectionné "à" tous les autres ", sélectionnez" suppose la ligne de base est linéaire ", et sélectionnez« Différence »sous la rubrique« calcul ».
      3. Calculer le rapport cellulaire moyenne et statistiques descriptives. Dans le logiciel de feuille de calcul et graphique, sélectionnez "Insérer → Nouvelle analyse → XY Analyses → Moyens Row avec SD ou SEM" puis sélectionnez "signifie Row avec SEM" dans la fenêtre pop-up.

Résultats

Tous les précurseurs, des cellules et des moules de coulée d'hydrogel ont été préparées comme décrit ci-dessus. Les solutions de précurseurs de cellules ont été chargées coulés dans des moules PDMS, puis centrifugés avant gélification / photoréticulation pour immobiliser des cellules à proximité de la lamelle couvre -objet et à faciliter l' analyse FRET d'imagerie (figure 1). Les hydrogels avec des lamelles couvre - joints ont été placés dans des puits préparés PDMS d'imagerie pour l' imagerie microscopique (figure 2). Les configurations optiques et des paramètres d'acquisition d'image ont ensuite été fixées comme représenté sur la figure 3A. La capture de tous les quatre FRET liés à l' image des canaux pour CFP-YFP paires de fluorophores est démontrée (voir la rubrique «Conf optique.» Dans la figure 3), comme il est nécessaire pour les sondes non-binaires. Cependant, dans ce travail que deux images sont nécessaires pour la sonde à une seule chaîne de ICUE1 binaire, QE = "CFP CFP" et Aem = "YFP YFP" (excitation émission). FOV multiples (position xys) ont été sélectionnés au cours duquel plusieurs cellules ont résidé dans la zone d'illumination homogène (figure 3B). Après l'acquisition de laps de temps, les données de signal pour la sonde a été exporté. ROI pour la correction des signaux de canal d'arrière - plan et pour l' analyse des cellules ont été désignées en utilisant des images Aem seuillés à partir du début des expériences (figure 4). Les cellules ont été choisis parmi le pool de cellules comme celles exprimant suffisante (pas trop faible), mais pas trop élevé (trop clair) sonde (figure 4B). Les QE et SE FRET ratios par pixel à chaque acquisition ont été calculées en utilisant la division à virgule flottante de l'arrière-plan soustrait canaux d'image. Le ratio de FRET moyenne par cellule (ie, par ROI) a été calculé, normalisé au signal de référence avant la stimulation (ie, une régression sur la base soustraite de tous les points de temps), et comploté avec des barres d'erreur que l'erreur standard de la moyenne (SEM). Tant le QE et sur la base des ratios cse FRET detect l'augmentation de l' activité de l' AMPc dans les chondrocytes sous stimulation par la forskoline (100 nM, figure 5). Le ratio QE FRET était plus sensible à la correction de fond que le ratio cse FRET parce que le signal de QE a été plus faible en raison du faible niveau de base de l'activité de l'AMPc dans les chondrocytes incorporés dans les hydrogels. Les deux types d' hydrogel (TR-gel et PC-gel) a montré une augmentation du ratio FRET au cours du temps (figure 6), ce qui indique une augmentation de la réponse de signalisation de l' AMPc à l'addition de forskoline. Comme indiqué par le rapport QE FRET, chondrocytes dans hydrogels PC-gel montrent un plus grand changement dans l' AMPc (montré) et un niveau de base supérieur de l' AMPc (E _QE = 0,19 en PC-gel vs E _QE = 0,09 dans TR-gel, non représenté sur la base soustraite figure).

Figure 1: Cellule Distribution en photoréticulé Hydrogel (PC-gel) A: Le précurseur de la cellule d'hydrogel chargé a été centrifugée pour maximiser le nombre de cellules au niveau d'un plan focal près de la lamelle couvre-objet. B: Ceci augmente le nombre de cellules dans le champ de vision et de minimiser le signal de fond provenant de cellules planes. (Barre d' échelle = 200 um) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Hydrogel en PDMS Dish
L'hydrogel a été placé à l'intérieur d'une grande hauteur PDMS bien (10x volumes d'hydrogel) avec une base de lamelle pour l'imagerie microscopique et la stimulation de l'analyte. Les hydrogels PC-gel sont transparentes et collé sur la lamelle couvre-objet de sorte qu'ils restent en place tout au long de l'essai. Les PDMS peuvent bien être plus grand pour contenir 10 fois plus que le volume moyen d'hydrogel à l'aide d'un poinçon de biopsie plus en plus d'auFiche hicker PDMS. (Barre d' échelle = 2 mm) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Configuration d' acquisition pour FRET Imaging
A: L'acquisition a été configuré pour la capture d'image toutes les 7 secondes à plusieurs endroits. Pour le calcul du ratio QE FRET, seuls deux canaux d'image sont nécessaires pour la sonde ICUE1 utilisé ici (sonde à une seule chaîne binaire), QE = "CFP CFP" et Aem = "YFP YFP" (excitation émission) en vertu de la "Conf optique." la colonne dans l'onglet λ du logiciel de microscope. B: FOV (positions «XY») ont été sélectionnés au cours duquel plusieurs cellules ont résidé dans la zone d'illumination homogène. L'intrigue ci-dessous l'image montre l'intensité d'éclairage le long de la ligne bleue fléchéequi traverse à travers le centre de la FOV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Choix des ROIs pour l' analyse FRET Imaging
A: Une région d'intérêt (ROI) libre de cellules a été sélectionné pour corriger le signal de fond sur chaque canal. Une image d'un hydrogel sans cellule peut plutôt être utilisé pour la soustraction de fond si la densité cellulaire ou la migration est élevé, ou si un masque d'ombrage ne sont pas utilisés lorsque les cellules ne se trouvent pas dans un champ d'éclairage homogène. B: Les ROIs cellulaires ont été sélectionnées en utilisant l'image seuillage et masquage binaire du canal Aem. Sélection d'un retour sur investissement plus grand que les cellules nuira calcul du ratio de FRET moyenne par cellule en raison de l'inclusion des rapports extracellulaires générés à partir de fond noise. Calcul du ratio de FRET cellulaire en utilisant la moyenne de chaque canal par cellule est déconseillée car cela sous-estime le rapport. (Barre d' échelle = 50 pm) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Comparaison des rapports FRET dans thermosensible Hydrogel (TR-gel)
Les deux QE et des ratios de FRET à base SE détectent l'activité accrue d'AMPc dans les chondrocytes sous stimulation forskoline. La forskoline est un agoniste de l'adényl-cyclase, qui induit la production d'AMPc. FRET diminue lorsque la sonde se lie ICUE1 AMPc, et donc le ratio QE FRET (E _QE = SQE / (SAEM x QS)) augmente. A l' inverse, le ratio SE FRET diminue et est ainsi tracée E _SE = 1 - Cse / SAEM. Dans un hydrogel incorporé chondrocytes, QE Frapport RET est plus sensible à la correction de fond que le ratio FRET SE parce que le signal QE est faible en raison de l'activité de l'AMPc de base faible. Les barres d'erreur = SEM, n = 25. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Comparaison du ratio FRET dans différents hydrogels
Les chondrocytes dans les deux types d'hydrogel ont répondu à la stimulation de la forskoline avec une augmentation de l'activité de l'AMPc comme le démontre le rapport accru QE FRET au fil du temps. Les effets de type hydrogel , la réponse cellulaire par plusieurs effets secondaires , y compris des différences de perméabilité à la forskoline et l'activité de l' AMPc cellulaire basai (E _QE = 0.19 PC-gel par rapport à E _QE = 0,09 dans le TR-gel, non représenté). Les barres d'erreur = SEM, n pour TR-gel= 25, n pour PC-gel = 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ce travail montre comment l'imagerie FRET peut être utilisé pour analyser la signalisation cellulaire dans des hydrogels 3D. Bien que des études antérieures ont démontré FRET imagerie de cellules mises en culture sur des substrats d'hydrogel ^35-37, des interactions extracellulaires avec des hydrogels ³⁸ et des molécules piégées dans des hydrogels ^39-41, ceci est la première publication de décrire l' analyse intracellulaire en fonction d'imagerie FRET de cellules incorporées dans Les hydrogels 3D. Le travail résout plusieurs problèmes de mise en œuvre lors de la traduction d'imagerie FRET de la 2D à la 3D. En premier lieu, les objectifs de grande ouverture numérique sont nécessaires pour l'imagerie FRET pour recueillir le signal d'émission suffisant, mais ils ne limitent la profondeur de champ. Les cellules ici sont autorisés à régler légèrement par centrifugation pour augmenter le nombre de cellules dans un plan focal près du verre pour compenser. Deuxièmement, échafauds d'hydrogel 3D peuvent dériver à travers le champ de vision lors de l'imagerie qui complique l'analyse. Les hydrogels ici sont liés au coverslip de sorte qu'ils restent fixes pendant toute l'expérience. Troisièmement, la sélection de compositions d'hydrogel appropriées pour 3D FRET est essentielle parce que hydrogels peuvent entraver la visualisation des cellules. hydrogels Ici transparents de PC-gel et TR-gel sont utilisés. Cependant, la collecte des cellules avec centrifugation à un plan focal près de la lamelle peut être utilisé pour les cellules d'image dans hydrogels avec une plus grande diffraction des choix d'hydrogel dépend des conditions de microenvironnement qui doivent être simulés, qui peuvent être trouvés dans une critique sur hydrogels ⁴² . Quatrièmement, un autre calcul est employé ici pour le rapport FRET de la sonde ICUE1 à chaîne unique (c. -à- E _QE = QE / CAEM) afin de minimiser le nombre de canaux d'image nécessaires à l' analyse et ainsi minimiser photoblanchiment. Le ratio FRET moyenne par cellule est calculé comme la moyenne des rapports par pixel au sein d'une cellule pour minimiser la sous-estimation du taux réel de FRET. Enfin, une analyse et un moyen linéaire ratiométriquepour calculer la fraction active de sondes binaires à une seule chaîne est décrite.

Il y a plusieurs aspects critiques de la réalisation d'expériences de FRET réussies en utilisant la microscopie widefield. En ce qui concerne le matériel, la caméra doit être suffisamment sensible pour résoudre les petits changements de signal, laissant les nouveaux appareils scientifiques CMOS et CCD d'électrons multipliant mieux adaptés que CCDs classiques. Pour mieux analyser la répartition spatiale du ratio de FRET, la caméra doit au minimum posséder deux fois la résolution spatiale de la fonction d'étalement de point de l'objectif (critère de Nyquist). Cela rend les systèmes à double vue moins adapté à la tâche. Plus cruciale est de sélectionner un taux d'acquisition de l'exposition et de l'image appropriée pour la paire FRET donnée de manière à minimiser photoblanchiment des fluorophores. Un taux d'acquisition diminué est recommandé que la durée de l'expérience augmente. L'utilisation de roues de filtre rapide augmente la vitesse d'acquisition et le nombre de FOV pour l'analyse tout éviterment les problèmes d'enregistrement d'image à double-vue et les cubes de filtre de la tourelle. Le champ d'éclairement inhomogène complique la correction pour la fluorescence de fond qui provient de l'autofluorescence de l'échantillon et le bruit du système de caméra. Certains hydrogels, en particulier ceux contenant des protéines collagènes sont très autofluorescents ^43,44. Les ratios de FRET sont sous-estimés sans correction de fond. Ici , nous utilisons une méthode de correction de fond simple qui repose sur le terrain relativement plat d'éclairage qui peut souvent être configuré avec un éclairage epi-fluorescence sur le centre de l'image (figure 3B, étape 7.2). Cette méthode limite donc les cellules d'intérêt pour ceux dans ce champ d'éclairage. La correction de fond décrite ici ne tient pas compte de l'autofluorescence cellulaire dans les longueurs d'onde de lecture pour la sonde binaire. Dans un tel cas, les cellules non marquées (aucune sonde de transfection) doivent être visualisés dans les mêmes conditions et le contexte soustraites. Un mix des cellules marquées et non marquées peuvent être utilisées et les cellules non marquées sélectionné pour le retour sur investissement d'arrière-plan. D'autres méthodes qui prévoient l'analyse des cellules sur le champ de l'image comprennent l'utilisation d'un masque d'ombrage, plusieurs ROIs de fond, ou des échantillons identiques sans cellules et un protocole est disponible sur demande.

Spécifique pour l' imagerie 3D FRET, la réponse de la sonde est hautement sensible à l'hydrogel perméabilité à la substance à analyser (figure 6). les mêmes régions d'hydrogel sont donc comparés entre les traitements expérimentaux, de préférence à un point de la géométrie de symétrie, comme à proximité du centre d'échafaudage tel qu'il est utilisé ici. En variante, les chambres microfluidiques / bioréacteurs peuvent être utilisés pour perfuser rapidement et uniformément dans l'hydrogel avec une solution d'analyte ^45. Un signal de FRET ne peut pas être détecté (rapport signal sur bruit est trop faible) lorsque l'autofluorescence de l'hydrogel est trop élevé; un hydrogel plus mince ou d'une sonde différente (différents fluorophores) devraient être utilisés.En ce qui concerne l'imagerie 3D FRET dans des hydrogels photoréticulé, l'utilisation de longueurs d'onde en dehors de l'exposition et les spectres d'excitation des fluorophores de la sonde d'irradiation minimale est recommandée. LAP peut être utilisé avec une source de lumière visible à 405 nm afin de réduire davantage les dommages cellulaires potentiels ^31,46. Cependant, en utilisant LAP avec 365 nm irradiation est recommandée car cela minimise la sonde blanchiment. 365 nm se situe à l'extrémité de queue du spectre d'excitation du donneur PCP, alors que 405 nm se trouve à l'excitation maximale. En variante, l'expression de la sonde peut être autorisé à récupérer pendant un jour. L'utilisation de sondes binaires minimise les problèmes de sensibilité aux différences dans les niveaux d'expression et à la diffusion moléculaire des fluorophores donneur et accepteur. Les sondes non binaires peuvent être utilisées, mais au lieu d'imagerie SE QE et une correction supplémentaire de transpercement spectrale des spectres d'excitation et d'émission (voir plus bas). En outre, la faible disponibilité commerciale et de la complexité dans la conception de sondes FRETpeut être un obstacle. Le facteur le plus critique pour les expériences réussies reste correction appropriée et l'analyse des signaux de fluorescence.

Un calcul alternatif du ratio FRET est utilisé pour plusieurs raisons supplémentaires en plus de la réduction au minimum le photoblanchiment. Pour les sondes à chaîne unique binaires, le rapport fréquemment rapporté est accepteur d' émission sous excitation des donateurs (émission sensibilisés, SE) à l' émission des donateurs sous donneurs d' excitation (émission trempé, QE), c. -à- FRET rapport = SE / QE ^25,47,48. SE / QE est non-linéaire par rapport aux changements dans l' efficacité de FRET ^21,22,47. A savoir, le rapport a une relation exponentielle non linéaire inhérente FRET efficacité de la sonde (Ei) ^{(DONIUS, AE, Taboas, JM travaux non publiés. (2015)),} avec le rapport le plus linéaire pour Ei inférieure à environ 15%. SE / QE sera également sous - estimer la fraction de sondes activées (FAP, à savoir, la fraction de sondes analyte de liaison). Therefore, analyse de SE / QE exige une dose d'équilibre lourde d'étude de réponse et ajustement de la courbe. Heureusement, les ratios de SE ou QE à l'émission de l' accepteur sous l' accepteur d' excitation (Aem) sont linéaires par rapport à Ei et le FAP, à savoir, les rapports de FRET SE / Aem et QE / Aem. SE / Aem est souvent utilisé pour les sondes binaires et ne nécessite point final étalonnage (sans activité de la sonde et l'activité complète de la sonde), mais la signalisation cellulaire basale rend cela difficile. Pour éliminer le besoin pour l'étalonnage de point de terminaison, SE peut être corrigée (Cse) pour le chevauchement spectral de donneur et accepteur d'excitation et d'émission des spectres (spectrale transpercement) et pour le rendement quantique et de la sensibilité spectrale (QS) des fluorophores de sondes combinées et microscope système d'imagerie. Le ratio FRET SE corrigé sur la base cse définit l'efficacité de FRET observé des sondes au sein de chaque pixel d'une image, soit E = _SE Cse / Aem. Les logiciels commerciaux et gratuit est disponible pour corriger SE pour ces effets etle lecteur est renvoyé aux travaux de Chen et Periasamy 2006 pour une explication détaillée des méthodes ^50. Toutefois, le calcul de E _SE nécessite la capture de trois canaux d'image par point de temps (SE, QE, Aem). Par conséquent, dans ce travail , nous employons également un ratio de FRET alternatif E _QE = 1 - QE / CAEM, qui exige la capture de seulement deux canaux d'image (QE et Aem). Calcul E _QE à partir de ces canaux ne nécessite que la correction Aem pour QS (CAEM = Aem x QS). QS = Dem / Aem est estimée facilement à l'aide de deux images à partir de l'échantillon d'un étalonnage, où Dem est l'émission du donneur sous donneur d'excitation avec l'accepteur blanchi. Le FAP à tout instant peut être calculé en comparant E _SE ou E _QE à l'Ei de la sonde.

En fin de compte, la sélection du rapport FRET (E _SE = Cse / Aem vs E _QE = QE / CAEM) doit être fondée sur un examen du type de sonde et les canaux avec meilleur signal. a la foispproches comprennent la correction de fond de bruit d'images par image tel que décrit ci-dessus pour tenir compte des changements dans autofluorescence au fil du temps. Ils supposent pas de chevauchement des Aem excitation lumineuse dans le spectre d'excitation Dem, qui est souvent le cas en raison de la sonde configuration du filtre conception et microscope. sondes à chaîne unique peuvent utiliser et la sélection est basée sur les meilleures signal de la sonde (luminosité) au bruit de la caméra et de signal de fond sur les SE et les canaux QE. Pour la sonde ICUE1 et les conditions expérimentales utilisées ici (types de cellules et d'hydrogel), S'a un signal plus fort que QE. Sondes à double chaîne nécessitent l' utilisation de E S'en raison de la distribution non-équimolaire de donneur et accepteur fluorophores. Pour les sondes qui diminuent en FRET sur analyte de liaison tels que ICUE1, FRET efficacité peut être «inversé» pour présenter un changement de signalisation positif lors de la liaison de l'analyte comme nous le faisons ici, avec E _SE = 1 - Cse / Aem ou E _QE = QE / (Aem x QS).

L'analyse des ee FAP est sensible à une bonne correction des rapports de FRET et à l'estimation de Ei. On peut estimer avec le même échantillon d'étalonnage utilisé pour QS et un critère classique FRET efficacité dosage tel que Ei = 1- (QE / Dem) (image de QE suivie par l' accepteur photoblanchiment et une image Dem) ^28, mais il faut prendre soin de minimiser blanchiment accidentelle du donneur. Nous décrivons une version modifiée où l'estimation de Dem basée sur Aem ajusté pour QS est substitué, à savoir, Ei = 1 - (QE / (Aem x QS)). Alternativement, Ei = Cse / Aem peut être utilisé. Estimation de Ei dans les cellules vivantes exige que toutes les sondes soient conduits à pleine FRET. Ceci est difficile à réaliser dans la pratique pour les sondes, comme ICUE1 qui diminuent en FRET lors de la liaison de l'analyte. Un calcul basé Ei in vitro en utilisant des lysats de cellule et l' analyte purifié est préférable, mais pas dans le cadre de ce travail. Ici, nous vous recommandons d'utiliser 2 ', 5'-dideoxyadenosine pour diminuer l'AMPc dans les cellules. Cependant, un FAP relatif peut be calculé en utilisant une estimation Ei dérivée du niveau de signalisation de base. Pour ces raisons, les études rapportent le plus souvent le ratio de FRET (comme cela se fait ici) ou d'un FAP relatif basé sur critère d'étalonnage, où la ligne de base de signalisation avant d'ajouter agoniste est la limite inférieure et le signal après l'ajout d'un second agoniste qui sature la signalisation est la partie supérieure lié. La forskoline est souvent utilisé comme un agoniste de commande pour saturer le signal AMPc. En variante, un analogue de l'AMPc peut être utilisé, tel que 8 Bromoadenosine 3 ', 5'-monophosphate cyclique. Les contrôles positifs utilisés à la fin des études pour identifier les changements potentiels dans la voie de signalisation entre les traitements expérimentaux sont recommandés.

Calcul de la réponse de signalisation moyenne par cellule nécessite un examen de plusieurs facteurs. Tout d' abord, le ratio moyen de FRET devrait être calculé comme la moyenne des rapports à chaque pixel dans une cellule, à savoir, (Σ (QE/cAem)) / (nombre de pixels), au lieu de la ratio du QE moyen et Aem dans une cellule, à savoir (ΣQE) / (ΣcAem). Bien que ce dernier ne nécessite pas de masquage prudent car le bruit de fond est faible, il sous-estime gravement le vrai ratio moyen de FRET. Cependant, les rapports de pixels nécessitent calcul à virgule flottante et masquage binaire attentif de la surface de la cellule pour définir la ROIs et éviter l'inclusion des ratios parasites générés par le bruit de fond extérieur de la cellule. La zone de la cellule entière doit être quantifiée pour éviter des résultats de sollicitation sur la forme des cellules. Le masquage peut devoir être redéfini au fil du temps en fonction des changements dans la forme et la migration cellulaire. Alternativement, ROIs plus grande que la cellule peut être utilisée si les critères d'exclusion sont définis pour éliminer les ratios de pixels de QE et des signaux Aem qui tombent bien en dessous des niveaux cellulaires et sont des niveaux de fond à proximité. Les méthodes d'analyse décrit en détail les étapes de base utilisées dans ce travail pour l'analyse FRET sans spécialisés logiciels / plugins. Les fabricants de microscopes et d'autres fournisseurs vendent module complémentaires pour leur logiciel de microscope, qui soutiennent ratiométrique automatisé et FRET analyse. De même, le logiciel ImageJ du domaine public a plusieurs plugins disponibles pour particules et l'analyse FRET, comme RiFRET. D'autre part, le ratio FRET moyen à base de pixels sous-estime le vrai rapport moyen de la structure cellulaire 3D, car une image 2D est utilisé. Les signaux 2D représentent la moyenne et le long de l'axe z. Calcul de la distribution spatiale 3D de rapports FRET dans des cellules vivantes est pas possible sans imagerie 3D à grande vitesse (par exemple., En utilisant la filature disque microscopie confocale). Ceci est un problème à la fois en 2D et 3D cultures, mais a un effet plus important en 3D comme plus de la structure cellulaire existe en dehors du plan. Ceci est une grande préoccupation pour les sondes qui localisent à des structures cellulaires, telles que la membrane plasmique sonde EPAC1 PM-ICUE. Voir Spiering et al. 2013 pour des suggestions pour corriger les effets de l' épaisseur de la cellule sur les calculs des ratios ^24. L'analyse de la distribution de Aem peut être utilisé pourdétecter si la sonde accumule dans les régions du plan d'imagerie cellulaire et ajustée. Cela aidera également à interpréter la répartition spatiale des ratios de FRET et d'éliminer des résultats erronés, par exemple., Identifier la saturation de la sonde (ie, une région à faible Aem aura concentration de la sonde basse et peut présenter une saturation de la sonde et ratio élevé de FRET). Troisièmement, les différents niveaux de référence FRET peut indiquer une différence dans l'efficacité de transfection, la sonde d'expression, ou la signalisation de base entre les groupes expérimentaux. "Analyse Relative" (étape 10.1.1) permet de supprimer la dérive dans le rapport de FRET au fil du temps si elle est présente. Il facilite la comparaison de l'importance relative des réponses entre les échantillons, mais empêche la comparaison de l'évolution temporelle de la réponse pour l'échantillon de référence (parcelle témoin est une ligne plate). "Analyse absolue" (étape 10.1.2) facilite la comparaison du taux de réponse à travers des échantillons, mais entrave la comparaison de l'ampleur de la réponse parce que chaque ligne est mise à l'échelle par un dissimconstante ilar. Des études ont souvent recours à une régression linéaire sur la ligne de base pour corriger la dérive du ratio FRET au cours du temps.

La méthode 3D FRET décrit est un moyen utile et pratique à fabriquer et à réaliser une imagerie time-lapse de cellules hydrogels 3D chargés, qui peuvent être appliquées à d'autres sondes et modalités d'imagerie. Autre système FRET en plus des sondes binaires à une seule chaîne, il faudra plus de correction complexe de signaux d'intensité sur la base, tel que discuté ci-dessus. En variante, la durée de vie de fluorescence FRET imagerie (FLIM-FRET) peut être utilisée pour calculer l'efficacité de FRET par l'intermédiaire d'un changement dans la durée de vie d'émission du donneur de la sonde. Contrairement à l' intensité en fonction FRET, FLIM-FRET est insensible au bruit de fond, spectrale transpercement, rendement quantique, et le détecteur de sensibilité spectrale ^2. Cependant, les systèmes FLIM sont coûteux, complexes et rares, et fonctionnent mieux avec des fluorophores avec un seul désintégration de l' exposant et sans FLIM run-off ^49. Le procédé décrit peut également être utilisé avec des more plates - formes de microscopie de pointe (par exemple., FRET-FRBR, anisotropie de fluorescence, et spectrale corrélation FRET). L'application de cette méthode pour l'imagerie 3D avec confocal à haute vitesse et la microscopie multiphotonique facilitera l'analyse de la distribution sub-cellulaire de la réponse de signalisation et d'augmenter la précision de l'analyse de signalisation. Cette méthode 3D FRET permettra avancées des études de biologie cellulaire en microenvironnements cellulaires 3D simulées. En tant que tel, il peut être facilement appliquée à la pharmacologie et de la médecine régénératrice besoins, y compris l'étude de signalisation intercellulaire et de criblage de médicament en réponse microtissues à base d'hydrogels modifiés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polydiméthylsiloxane (PDMS) [Kit d’élastomère Sylgard 184]	Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)	NC0162601	Réactifs
Diméthacrylate de polyéthylène glycol (PEGDM)	Préparé selon Lin-Gibson avec PEG de Sigma Aldrich	95904	Réactifs
3-(Trimethoxysilyl)méthacrylate de propyle	Sigma Aldrich	M6514	3
- glycidoxypropyltriméthoxysilane	Sigma Aldrich		440167 Réactifs
Diméthylphénylphosphonite	Sigma Aldrich	149470-5g
Réactifs Chlorure de 2,4,6-triméthylbenzoyle Fisher	Scientific	AC244280100	Réactifs
2-Butanone	Fisher Scientific	AC149670010	Réactifs Bromure
de lithium	Fisher Scientific	AC199871000	Réactifs
Isopropanol	Sigma Aldrich	190764
Réactifs Sigmacote (réactif siliconant)	Sigma Aldrich	SL2	Réactifs
Toluene  ;	Fisher Scientific	AC36441-0010	Réactifs
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Hyclone	SH3025601
Réactifs Opti-MEM Milieu sérique réduit, sans rouge de phénol (milieu sans phénol ni sérum)	Life Technologies	11058-021	Réactifs
FuGENE HD Réactif de transfection (réactif de transfection)	Promega	E2311	Reagents
Cellstripper (cellule solution de dissociation)	Corning	25-056-CI	Réactifs
Facteur de croissance réduit Matrigel, Sans phénol	Corning	356231	réactifs
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Réactifs
Pointes de pipette (10,200,1,000 &mu ; l)  ;	Fisher Scientific	02-707-474, 02-707-478, 02-707-480	Matériel de laboratoire jetable
Gants d’examen non poudrés	Fisher Scientific	19-149-863B	Matériel de laboratoire jetable
Feuille d’aluminium	Fisher Scientific	01-213-100	Matériel de laboratoire jetable
Poinçon à biopsie (3 mm)	Miltex	3332	Matériel de laboratoire jetable
Lamelles de protection en verre	Fisher Scientific	12-544C	Matériel de laboratoire jetable
Lamelles en verre pré-enduit (époxysilane)	Arrayit	CCSL	Matériel de laboratoire jetable
Lame en verre	Fisher Scientific	12550D	Matériel de laboratoire jetable
Flacons stériles (15 ml, 50 ml coniques)	Fisher Scientific	14-959-70C, 14-959-49A	Matériel de laboratoire jetable
Boîte de culture cellulaire (6- bien)	Falcon	351146	Matériel de laboratoire jetable
Microscope épifluorescent avec platine motorisée	Nikon	MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)	Matériel de laboratoire grand/non jetable
Porte-échantillon réglable pour platine XY	Nikon	77011393	Équipement de laboratoire non jetable
Objectif 60X (1,3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)	Nikon	MRD01605	Matériel de laboratoire non jetable
Porte-filtres de source lumineuse CFP/YFP et d’excitation/émission (source lumineuse et roue Lambda, système de filtre d’émission Lambda)	Nikon (revendeur Sutter Instrument)	77016231, 77016088	Matériel de laboratoire non jetable
Jeu de filtres CYF/YFP Nikon	(Chroma Technology Corp)	77014928	Matériel de laboratoire non jetable
Appareil photo (ORCA Flash 4.0 v1)	Nikon (Hamamatsu revendeur)	77054076	Matériel de laboratoire non jetable
NIS-Elements 40.20.02 logiciel de microscope)	Nikon	MQS31100  ;	Équipement de laboratoire non jetable
Prism (tableur et logiciel graphique)	GraphPad Software, Inc	Version 6	Équipement de laboratoire non jetable
OmniCure S1000 Système de lampe à polymérisation UV avec filtre 365 nm ou autre source lumineuse (&lambda ; = 365 ou 405)	OmniCure	S1000	Équipement de laboratoire grand/non jetable
Aide à la pipette  ;	Drummond Scientific Co.  ;	DP-100	Matériel de laboratoire non jetable
Hémacytomètre	Hausser Scientific	Reichert Bright-Line 1475	Matériel de laboratoire non jetable
Chambre de dessiccateur sous vide/dégazeur  ;	Tout		Équipement de laboratoire volumineux/non jetable
Capot de culture tissulaire  ;	Tout		équipement de laboratoire volumineux/non jetable
Hotte chimique  ;	Tout		Équipement de laboratoire grand/non jetable
Four	Tout		Équipement de laboratoire grand/non jetable
Spatule	Tout		équipement de laboratoire non jetable
Bécher	Tout		équipement de laboratoire non jetable
Incubateur  ;	Tout		équipement de laboratoire volumineux/non jetable