Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

Résumé

Ici, nous décrivons un dosage colorimétrique pour détecter la présence de sucres réducteurs lors de la germination des spores bactériennes.

Résumé

Le processus de germination des endospores chez Clostridium difficile, et d’autres Clostridium, diffère de plus en plus de celui de la bactérie sporulée modèle, Bacillus subtilis. La germination est déclenchée par de petites molécules germinantes et se produit sans qu’il soit nécessaire de procéder à une synthèse macromoléculaire. Bien qu’il existe des différences entre les mécanismes de germination des spores chez les espèces de Bacillus et de Clostridium, une exigence commune est l’hydrolyse du cortex de type peptidoglycane qui permet au noyau des spores de gonfler et de se réhydrater. Après la réhydratation, le métabolisme peut commencer, ce qui conduit éventuellement à l’excroissance d’une cellule végétative. La détection de fragments de cortex hydrolysés pendant la germination des spores peut être difficile et les modifications apportées aux tests décrits précédemment peuvent être déroutantes ou difficiles à reproduire. Ainsi, sur la base de notre récent rapport utilisant ce test, nous détaillons un protocole étape par étape pour la détection colorimétrique des fragments de cortex lors de la germination des spores bactériennes.

Introduction

Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l' exposition à l' oxygène ou d' autres contraintes ^1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel ^2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d'études dans l'organism....

Protocole

1. Échantillons Génération

1. Heat activer C. difficile spores à 65 ° C pendant 30 min et magasin sur la glace.
   Remarque: C. Les spores difficile peuvent être produits et purifiés comme décrit précédemment ^7,9,10.
2. Préparer la solution de germination à X + 1 ml où X est le nombre d'échantillons à prélever au cours de l'essai.
   Remarque: La solution de germination est spécifique aux espèces de bactéries SPORE à l'étude. Pour doser C. difficile la germination des spores, on a utilisé une solution de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glycine 100 mM , et 10 mM d' acide taurocholi....

Résultats

Le tableau 1 présente des résultats typiques en utilisant des normes NAG. Les données sont utilisées pour générer une courbe standard. Le tableau 2 montre des résultats typiques d'un essai de germination dans un tampon de germination supplémenté avec de la glycine 100 mM et TA 10 (conditions de germination favorisant) ou mM de glycine 100 uniquement (conditions de non-germination). En l'absence de TA, C. spores Difficile ne germent et i.......

Discussion

Lors de la stimulation, les spores subissant le processus de germination perdent leurs propriétés de résistance, sans la nécessité de la synthèse macromoléculaire. Lorsque la germination des spores est déclenchée, le noyau de spores libère DPA en échange d'eau ^2. En raison de la forte teneur en DPA de la spore dormante, le noyau de spores est sous pression osmotique intense et le peptidoglycane spécialisé, cortex, aide à prévenir le noyau de l' enflure en agissant, sans doute, comme un obstacle à l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à bouchon à vis de 2,0 ml	USA scientific	1420-3700
p1000 Pipette Eppendorf	Eppendorf
p200 Pipette Eppendorf	Eppendorf
p20 Pipette Eppendorf	Eppendorf
100 - 1,250 μ ; l pointes de pipette	VWR	89079-486
1 - 200 μ ; ll pointes de pipette	VWR	89079-458
N-acétyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Acide chlorhydrique - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Anhydride acétique	Alfa Aesar	L04295
Bicarbonate de sodium	BDH	BDH0280-500G
Tétraborate de potassium	tétrahydraté Alfa Aesar	39435
Hydroxyde de sodium	BDH	BDH8019-500G
4-(Diméthylamino)benzaldéhyde	Sigma	156477-100G
Phénol saturé	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoéthanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Dispositifs
Acide acétique, glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Bain d’eau chaude et circulante	VWR Modèle scientifique	1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 plaques de culture de tissus bien claires Tubes
de culture	VWR	89000-506
Lyophilizer
Blocs
de chaleur Vortex Machine