Method Article

Développement d'un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

DOI:

10.3791/54148

⸱

July 25th, 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel représentent une amélioration marquée par rapport à la culture des cellules dans des environnements 2-D (par exemple, des flacons ou des boîtes). Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine en culture en microgravité fournies par rotation paroi vasculaire (RWV) bioréacteurs.

Abstract

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Étant donné que les cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel ont le potentiel pour combler de nombreuses lacunes de culture cellulaire dans des milieux 2-D (par ex., Des flacons ou des boîtes). En fait, il est largement reconnu que les cellules cultivées dans des flacons ou des plats ont tendance à dé-différencier et de perdre des fonctions spécialisées des tissus à partir de laquelle ils ont été dérivés. À l'heure actuelle, il existe principalement deux types de systèmes de culture 3-D où les cellules sont ensemencées dans des échafauds mimant la matrice native extracellulaire (ECM): (a) les modèles statiques et (b) les modèles utilisant des bioréacteurs. La première percée a été les modèles statiques 3-D. modèles 3-D en utilisant des bioréacteurs tels que le mur-récipient rotatif (RWV) bioréacteurs sont un développement plus récent. Le concept original des bioréacteurs RWV a été développé au Centre spatial Johnson de la NASA au début des années 1990 et est censé pour surmonter les limitations des modèles statiques tels que le développement des hypoxiques, des noyaux nécrotiques. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner thest le problème en fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l'oxygène. Ces bioréacteurs sont constitués d'une base de la coiffe qui sert à supporter et faire tourner deux formats différents de récipients de culture qui diffèrent par leur type de source d'aération: (1) Lent Turning navires latéraux (STLVs) avec un oxygénateur de co-axiale dans le centre, ou (2 ) rapport d'aspect élevé des navires (Harvs) avec l'oxygénation via une membrane de transfert de gaz en caoutchouc de silicone plat. Ces navires permettent le transfert de gaz efficace tout en évitant la formation de bulles et de la turbulence conséquente. Ces conditions se traduisent par un écoulement laminaire et de la force de cisaillement minimale que les modèles réduits gravité (microgravité) à l'intérieur du récipient de culture. Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes cultivés en microgravité fourni par le bioréacteur RWV. </ P>

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La première percée dans la construction d' un modèle 3-D a été signalé au début des années 1980 , lorsque les scientifiques ont commencé à étudier les différents types de l'échafaudage (par exemple., La laminine, le collagène de type I, le collagène IV, et la fibronectine) et des cocktails de facteurs de croissance pour améliorer cellule à cellule interactions ECM de modèles 3-D "statique" et 1-7. Depuis lors, le principal problème avec ces modèles a été limitations dans le transfert des nutriments et de l' oxygène dans les moyennes et les tissus des constructions 8. Contrairement aux cellules dans l'environnement in vivo , qui reçoit un flux continu de nutriments et de l' oxygène à partir de réseaux de vaisseaux sanguins environnants, la nature statique de ces modèles entrave la distribution effective d'entre eux aux cellules. Par exemple, des agrégats de cellules générées dans des modèles in vitro statiques qui dépassent de quelques millimètres de taille invariablement développer hypoxiques, des noyaux nécrotiques 9. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner ce problèmeen fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l' oxygène 12/10. Cependant, à ce jour, le travail en utilisant bioréacteurs RWV ont été limités à l'inclusion d'un ou de deux types de cellules 13-17. En outre, au lieu d'une orientation spatiale similaire aux tissus natifs, ces cellules forment des agrégats cellulaires. La principale raison de ces limitations a été l'absence d'un échafaudage en mesure d'intégrer des cellules d'une manière intégrée. Les échafaudages utilisés dans les bioréacteurs RWV à ce jour consistent, à quelques exceptions près 16-18, principalement des microbilles synthétiques, des cylindres tubulaires ou petites feuilles 13-15,19-23. Ce sont des matériaux rigides dont la composition et la flexibilité ne peut être manipulé et auquel les cellules sont attachées à leur surface. Par conséquent, il est peu probable que ces modèles vont fournir un système permettant d'évaluer, de façon intégrée, les différents composants cellulaires tels que des cellules stromales (par ex., Des fibroblastes, des cellules immunitaires et endothéliales) qui should être dispersé dans l'échafaudage pour imiter étroitement le tissu humain.

Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une ligne intestinale des cellules épithéliales et les lymphocytes humains primaires, les cellules endothéliales et les fibroblastes 24. Ces cellules ont été cultivées en microgravité fournir par le bioréacteur RWV 13,25-30. Dans notre modèle 3-D, l'ECM possède plusieurs propriétés distinctes, comme une osmolalité similaire à celle du milieu de culture (par ex., Des contraintes diffusionnelles négligeables au cours de la culture) et la capacité d'incorporer des cellules et d' autres protéines de la matrice extracellulaire concernées, ainsi que de la la rigidité appropriée pour être utilisée dans des bioréacteurs 24. Les systèmes biologiques sont très complexes, et au cours des dernières années, il y a eu un changement d'orientation de la recherche de la muqueuse vers l'examen des interactions cellulaires avec leur environnement plutôt que de les étudier dans isolation. En particulier, l'importance des interactions entre les cellules en influençant la survie des cellules intestinales et la différenciation est bien documentée 31-34. Plus précisément, la communication entre les cellules épithéliales et leur niche a une profonde influence sur l'expansion des cellules épithéliales et la différenciation 35. En effet, il est largement admis que non seulement la cellule à cellule, mais aussi des interactions cellule-ECM sont essentiels pour le maintien et la différenciation des cellules épithéliales dans des modèles de culture 3-D. Des études antérieures ont démontré que les protéines d'ECM intestin telles que le collagène I 24,36,37, 38 laminine et la fibronectine 39 jouent un rôle décisif pour influencer les cellules épithéliales intestinales d'acquérir une orientation spatiale similaire à la muqueuse naturelle. Ainsi, le développement de nouvelles technologies, comme notre modèle 3-D 24, qui peut imiter la diversité phénotypique de l'intestin est nécessaire si les chercheurs ont l' intention de recréer l'architecture cellulaire et structurale complexeet le fonctionnement du micro-environnement intestinal. Ces modèles représentent un outil important dans le développement et l'évaluation des nouveaux médicaments par voie orale et des vaccins candidats.

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Protocol

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Déclaration éthique: Tous les échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires qui ont participé au numéro de protocole HP-00040025-1. L'Université du Maryland Institutional Review Board a approuvé ce protocole et a autorisé le prélèvement d'échantillons de sang provenant de volontaires sains pour les études incluses dans ce manuscrit. Le but de cette étude a été expliqué aux volontaires, et tous les bénévoles ont informé, signé le consentement avant la prise de sang.

Note: Voir le tableau 1 pour la préparation du supplément de milieu. Voir le tableau 2 pour la préparation des milieux de culture en 3-D.

1. Préparation des navires Culture

  1. Dévissez le bouchon de l'orifice de remplissage de la cuve 50 ml-et remplir avec 50 ml de milieu de culture stérile (par exemple., RPMI). Effectuer toutes les procédures dans des conditions stériles dans une hotte laminaire.
  2. Replacer le capuchon et essuyez tout support déversé sur toute surface avec 70% d'éthanol.
  3. Laisser le navire Incubmangé pendant au moins 15 min à O / N à la température ambiante.
  4. Utiliser le port de remplissage pour éliminer le milieu de culture et ajouter 30 ml de 3-D du milieu de culture.
  5. Essuyer tout moyen déversé sur toute surface avec 70% d'éthanol.

2. Préparation des cellules

  1. Line humaine des cellules épithéliales (HCT-8) 24,40.
    1. les cellules de la culture dans un milieu RPMI supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 50 pg / ml de gentamicine, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, HEPES 10 mM tampon et du sérum inactivé à la chaleur 10% de fœtus bovin (FBS ) (supplément 1). À 70% de confluence, les cellules divisées en une proportion de 1: 5.
  2. Fibroblastes colique humaines (cellules CCD-18Co) 24,41.
    1. Les cellules de la culture dans le milieu de Basal Aigle enrichi avec supplément 1 à confluence, les cellules fractionnées à un rapport de 1: 3..
  3. Human Umbilical Vein Endothelial (HUVEC) cellules 24,42.
    1. Les cellules de culture en Endothelial Basal Medium (EBM) milieu enrichi avec 100 pg / ml d' héparine, 3 pg / ml Endothelial Cell Growth Supplément (ECGS), et de compléter 1 à 70% de confluence, les cellules fractionnées à un rapport de 1: 2..
  4. Les lymphocytes / monocytes
    1. Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) à partir du sang par centrifugation en gradient de densité en utilisant des techniques standard 43.
      1. En bref, en utilisant une pipette de 10 ml, ajouter avec précaution 30 ml de sang dilué (1: 1 de sang: tampon phosphate salin (PBS)) dans un tube de 50 ml conique contenant 10 ml de milieu de centrifugation de densité. Après l'étape de centrifugation, les lymphocytes et les monocytes résident dans la couche de "blanc" entre le milieu de centrifugation de densité et des couches de plasma.
      2. Recueillir la couche blanche en utilisant une pipette de transfert. Éviter la contamination des granulocytes en limitant la collecte des supports de centrifugation de densité. Après le lavage de 43, use PBMC cryoconservées tel quel ou dans N2 liquide.
        Note: Il est important de souligner que les PBMC se compose essentiellement de lymphocytes et de monocytes, avec une petite proportion de cellules dendritiques et d'autres types de cellules.
  5. Cultivez toutes les cellules dans des conditions standard de culture à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2.

3. Préparation des cellules de collagène embarqués

  1. Déterminer le nombre d'insertions besoin en fonction du nombre de conditions expérimentales pour être mis en place. Placez le nombre approprié d'inserts dans les puits d'une plaque à 6 puits.
  2. Préparer une suspension de HUVEC et des fibroblastes:
    1. Laver les flacons deux fois dans du PBS et détacher les cellules en utilisant la trypsine, 0,25% (1x) avec 0,05% de trypsine-tétrasodique éthylènediaminetétraacétate (trypsine-EDTA). Ajouter une solution de trypsine suffisante pour couvrir la totalité de la surface de culture cellulaire. Le détachement se produit généralement dans les 5 à 15 minutes,
    2. Collecteles cellules individuelles dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) -30% de FBS moyenne.
    3. Centrifuger le tube à 500 g pendant 10 min.
    4. Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
    5. Compter le nombre total de cellules viables en diluant 20 ul de cellules remises en suspension avec 20 pi de bleu trypan colorant. Charger le hémocytomètre avec le mélange de cellules. CMSP Viable sera blanche claire; inviable PBMC va acquérir le colorant et devenir bleu.
      1. Resuspendre chaque type de cellule dans un milieu DMEM-30% de FBS à une concentration de 5 - 8 x 10 7 cellules ml - 1.
  3. Préparer des gels de collagène contenant des cellules
    Note: Chaque navire nécessite la préparation de ~ 5 ml de gel de collagène contenant des cellules.
    1. Dans un tube de 50 ml conique préparer le mélange de collagène par addition de 1 x support DMEM, supplémenté avec 50 pg / ml de gentamicine, 2 mM de L-glutamine et 10% de la chaleur inactivated FBS plus 3 mg / ml de collagène bovin I, 10 pg / ml de laminine, 40 pg / ml de collagène IV, 10 pg / ml de fibronectine, 2 pg / ml de protéoglycanes de sulfate d'héparine et du NaOH 15 mM (pour atteindre le pH physiologique).
    2. Fermer le tube et mélanger en retournant plusieurs fois jusqu'à ce que le mélange soit complètement homogénéisé. Eviter la formation de bulles.
      IMPORTANT: Gardez le mélange sur la glace pour empêcher la gélification.
      1. Étape critique: Si le mélange développe une apparence acide (couleur jaunâtre), ajouter quelques gouttes de NaOH stérile 1 pour neutraliser le mélange.
    3. Ajouter HUVEC et de fibroblastes concentré à une densité de 1,0 - 1,2 et 1,5 - 2,0 x 10 6 cellules / ml, respectivement au collagène enrichi en mélange (décrit ci - dessus). Fermer les tubes et mélanger en retournant plusieurs fois jusqu'à ce que le mélange soit complètement homogénéisé. Eviter la formation de bulles. IMPORTANT: Gardez le mélange sur la glace pour empêcher la gélification.
    4. Ajouter 4 - 5 ml de collagène contenant des cellulesgel pour chaque insert, préalablement chargé dans un puits de plaque 6, et on laisse gélifier dans la hotte, avec peu ou pas de mouvement pendant 1 heure.
    5. Après 1 h, transférer la plaque de 6 puits à une 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pour 1 - 2 heures additionnelles.
    6. Remettre la plaque de 6 puits à la hotte, et avec l'aide d'une pince stérile et aseptique scalpel de coupure de la membrane de l'insert de détacher le gel contenant des cellules de la membrane. Couper le gel détaché en petits carrés (~ 5 x 5 mm).
    7. Ajouter les petits carrés contenant des cellules dans un HARV de 50 ml en utilisant l'orifice de remplissage.
  4. Préparer une suspension de 8-HCT cellules épithéliales:
    1. Laver les flacons deux fois dans du PBS et détacher les cellules en utilisant la trypsine, 0,25% (1x) avec le traitement trypsine-EDTA. Ajouter une solution de trypsine suffisante pour couvrir la totalité de la surface de culture cellulaire. Le détachement se produit habituellement dans les 10 à 15 min.
    2. Collecter des cellules individuelles dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
    3. centrifuge DMEM-30% FBS contenant le tube à 500 xg pendant 10 min.
    4. Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
    5. Compter le nombre total de cellules viables comme décrit dans 3.2.5.
    6. Remettre en suspension les cellules HCT-8 dans l' épithélium DMEM-30% de FBS à une concentration de 10 7 cellules ml - 1.
    7. Ajouter 1 ml de HCT-8 cellules épithéliales concentrées dans le 50-ml HARV en utilisant l'orifice de remplissage.
  5. En utilisant l'orifice de remplissage, ajouter d'autres milieu de culture 3-D jusqu'à ce que le navire est presque plein (~ 20 ml).
  6. Replacer le capuchon et essuyez la lèvre de l'orifice de remplissage avec 70% d'éthanol.
  7. Placer une seringue dans chaque orifice de seringue de la RWV: placer un 5 ml seringue contenant 3 - 4 ml de 3-D dans le milieu de culture, un port et une seringue de 5 ml de vide dans l'autre port.
  8. Éliminer les bulles visibles en tirant dans la seringue vide pendant approximativement le même volume de milieu est injecté à travers l'autre orifice de la seringue.
  9. Placez les VesSels dans le bioréacteur, mettre sous tension et régler la vitesse d'environ 13 à 14 rotations par minute.
    Remarque: l' étape critique: taux de rotation peut être nécessaire d'ajuster quelques fois au cours d' une expérience visant à maintenir les cellules en orbite autour de l' intérieur du récipient, ce qui évite le contact avec les parois des vaisseaux.
  10. Les cellules de la culture à 37 ° C, 5% de CO 2 sous microgravité, fourni par le bioréacteur RWV.
  11. Changement milieu de culture tous les 3 - 4 jours en remplaçant environ 30 ml avec du milieu frais de culture 3-D.
  12. Après 4 jours (± 1 jour), retirez les navires du bioréacteur et ajouter des lymphocytes / monocytes aux vaisseaux (2 x 10 7 / navire).
  13. Placez les vaisseaux de retour dans le bioréacteur à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 5 jours (± 1 jour).
  14. Après les 5 jours supplémentaires (jour 9 de la culture), ajouter des lymphocytes / monocytes aux vaisseaux (2 x 10 7 / navire) et continuer les cultures pour un maximum de 12 jours supplémentaires.
  15. Changement milieu de culture tous les 3 - 4 jours en remplaçant environ 30 ml avec du milieu frais de culture 3-D.

4. Récolte Cultures 3-D pour histologie

  1. À l'aide d'une récolte de pipette de transfert de chaque fragment de gel petit, maintenant appelé «construire» dans une plaque à six puits contenant 10 ml de tampon de formol à 10%. Laisser pendant 3 heures à la température ambiante ou pour les 12 - 16 heures à 4 ° C.
  2. Préparer le traitement des tissus et des cassettes d'enrobage par marquage et en ajoutant deux morceaux de blocs de mousse de biopsie dans chaque cassette.
  3. Immerger les cassettes dans 10% de tampon formol.
  4. À l'aide d'une pince placer les constructions-fixes entre les deux tampons de mousse.
  5. Immerger les cassettes dans 10% de tampon formol.
  6. Procéder à des procédures standard pour l' intégration, sectionner et coloration 44.

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Results

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Précédemment , nous avons conçu un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine constituée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes en culture en conditions de microgravité 24 (figure 1). Les fibroblastes et les cellules endothéliales ont été noyées dans une matrice de collagène I enrichi avec intestin supplémentaire sous - sol protéine...

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Discussion

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Dans ce manuscrit, nous décrivons le développement d'un modèle transgénique de la muqueuse intestinale humaine composée de multiples types cellulaires incluant les lymphocytes humains primaires, des fibroblastes et des cellules endotheliales, ainsi que des lignées de cellules épithéliales intestinales 24. Dans ce modèle 3-D, les cellules sont cultivées dans une matrice extracellulaire riche en collagène dans des conditions de microgravité 24.

Comme précédemment décr...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’une demande de brevet non provisoire a été déposée auprès de l’Office des brevets et des marques des États-Unis (numéro : 13/360,539).

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu, en partie, par les subventions de recherche fédérales R01 AI036525 et U19 AI082655 (CCHI) du NIAID et par les subventions DK048373 du NIH à AF. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou des Instituts nationaux de la santé.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bioréacteur à quatre rotateurs/cuves à paroi tournante indépendante (RWV)  ;SyntheconRCCs-4DQPour jusqu’à 4 vaisseaux. Des modèles avec plus ou moins de cuves sont également disponibles.
Boîte jetable de 50 ml deSyntheconD-405avec 4 vaisseaux
HCT-8 cellules épithéliales  ;Fibroblastes ATCCCCL-244
CCD-18Co  ;ATCCCRL-1459
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaineATCCCRL-1730HUVEC
Facteur de croissance des fibroblastes - Basic  ;SigmaF0291bFGF
Facteur de cellules souches  ;SigmaS7901SCF
Facteur de croissance des hépatocytes  ;SigmaH1404HGF
Endothéline 3SigmaE9137
LaminineSigmaL2020Isolé de la souris Tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire  ;SigmaV7259VEGF
Facteur inhibiteur de la leucémie  ;Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulineSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine  ;SigmaT-6397T3
Toxine cholériqueSigmaC-8052
FibronectineBD354008Isolé du plasma humain
apo-TransferrineSigmaT-1147
HéparineSigmaH3149
Sulfate d’héparane ProtéoglycaneSigmaH4777Isolé de la membrane basale de souris  ; Tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm
Collagène IVSigmaC5533Isolé du placenta humain
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur  ;Invitrogen10437-028
D-MEM, poudreInvitrogen12800-017
10 % formolo. PBS  ;Fisher ScientificSF100-4
Collagène bovin de type I  ;InvitrogenA1064401
Trypsine-EDTA  ;Fisher ScientificMT25-052-CI
Pyruvate de sodiumInvitrogen11360-070
Gentamicine  ;Invitrogen15750-060
Pénicilline/streptomincine  ;Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham’s F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothélial Milieu basalLonzaCC-3156EBM-2
Supplément de croissance des cellules endothélialesMillipore02-102ECGS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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