Développement d'un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Summary

Des cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel représentent une amélioration marquée par rapport à la culture des cellules dans des environnements 2-D (par exemple, des flacons ou des boîtes). Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine en culture en microgravité fournies par rotation paroi vasculaire (RWV) bioréacteurs.

Abstract

Étant donné que les cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel ont le potentiel pour combler de nombreuses lacunes de culture cellulaire dans des milieux 2-D (par ex., Des flacons ou des boîtes). En fait, il est largement reconnu que les cellules cultivées dans des flacons ou des plats ont tendance à dé-différencier et de perdre des fonctions spécialisées des tissus à partir de laquelle ils ont été dérivés. À l'heure actuelle, il existe principalement deux types de systèmes de culture 3-D où les cellules sont ensemencées dans des échafauds mimant la matrice native extracellulaire (ECM): (a) les modèles statiques et (b) les modèles utilisant des bioréacteurs. La première percée a été les modèles statiques 3-D. modèles 3-D en utilisant des bioréacteurs tels que le mur-récipient rotatif (RWV) bioréacteurs sont un développement plus récent. Le concept original des bioréacteurs RWV a été développé au Centre spatial Johnson de la NASA au début des années 1990 et est censé pour surmonter les limitations des modèles statiques tels que le développement des hypoxiques, des noyaux nécrotiques. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner thest le problème en fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l'oxygène. Ces bioréacteurs sont constitués d'une base de la coiffe qui sert à supporter et faire tourner deux formats différents de récipients de culture qui diffèrent par leur type de source d'aération: (1) Lent Turning navires latéraux (STLVs) avec un oxygénateur de co-axiale dans le centre, ou (2 ) rapport d'aspect élevé des navires (Harvs) avec l'oxygénation via une membrane de transfert de gaz en caoutchouc de silicone plat. Ces navires permettent le transfert de gaz efficace tout en évitant la formation de bulles et de la turbulence conséquente. Ces conditions se traduisent par un écoulement laminaire et de la force de cisaillement minimale que les modèles réduits gravité (microgravité) à l'intérieur du récipient de culture. Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes cultivés en microgravité fourni par le bioréacteur RWV. </ P>

Introduction

La première percée dans la construction d' un modèle 3-D a été signalé au début des années 1980 , lorsque les scientifiques ont commencé à étudier les différents types de l'échafaudage (par exemple., La laminine, le collagène de type I, le collagène IV, et la fibronectine) et des cocktails de facteurs de croissance pour améliorer cellule à cellule interactions ECM de modèles 3-D "statique" et ^1-7. Depuis lors, le principal problème avec ces modèles a été limitations dans le transfert des nutriments et de l' oxygène dans les moyennes et les tissus des constructions ^8. Contrairement aux cellules dans l'environnement in....

Protocol

Déclaration éthique: Tous les échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires qui ont participé au numéro de protocole HP-00040025-1. L'Université du Maryland Institutional Review Board a approuvé ce protocole et a autorisé le prélèvement d'échantillons de sang provenant de volontaires sains pour les études incluses dans ce manuscrit. Le but de cette étude a été expliqué aux volontaires, et tous les bénévoles ont informé, signé le consentement avant la prise de sang.

Note: Voir le tableau 1 pour la préparation du supplément de milieu. Voir le tableau 2 pour la préparation des milieux de culture en 3-D.

Results

Précédemment , nous avons conçu un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine constituée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes en culture en conditions de microgravité ²⁴ (figure 1). Les fibroblastes et les cellules endothéliales ont été noyées dans une matrice de collagène I enrichi avec intestin supplémentaire sous - sol protéine.......

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons le développement d'un modèle transgénique de la muqueuse intestinale humaine composée de multiples types cellulaires incluant les lymphocytes humains primaires, des fibroblastes et des cellules endotheliales, ainsi que des lignées de cellules épithéliales intestinales ^24. Dans ce modèle 3-D, les cellules sont cultivées dans une matrice extracellulaire riche en collagène dans des conditions de microgravité ^24.

Comme précédemment décr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioréacteur à quatre rotateurs/cuves à paroi tournante indépendante (RWV)  ;	Synthecon	RCCs-4DQ	Pour jusqu’à 4 vaisseaux. Des modèles avec plus ou moins de cuves sont également disponibles.
Boîte jetable de 50 ml de	Synthecon	D-405	avec 4 vaisseaux
HCT-8 cellules épithéliales  ;	Fibroblastes ATCC	CCL-244
CCD-18Co  ;	ATCC	CRL-1459
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Facteur de croissance des fibroblastes - Basic  ;	Sigma	F0291	bFGF
Facteur de cellules souches  ;	Sigma	S7901	SCF
Facteur de croissance des hépatocytes  ;	Sigma	H1404	HGF
Endothéline 3	Sigma	E9137
Laminine	Sigma	L2020	Isolé de la souris Tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire  ;	Sigma	V7259	VEGF
Facteur inhibiteur de la leucémie  ;	Santa Cruz	sc-4377(	LIF
Adenine	Sigma	A2786
Insuline	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine  ;	Sigma	T-6397	T3
Toxine cholérique	Sigma	C-8052
Fibronectine	BD	354008	Isolé du plasma humain
apo-Transferrine	Sigma	T-1147
Héparine	Sigma	H3149
Sulfate d’héparane Protéoglycane	Sigma	H4777	Isolé de la membrane basale de souris  ; Tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm
Collagène IV	Sigma	C5533	Isolé du placenta humain
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur  ;	Invitrogen	10437-028
D-MEM, poudre	Invitrogen	12800-017
10 % formolo. PBS  ;	Fisher Scientific	SF100-4
Collagène bovin de type I  ;	Invitrogen	A1064401
Trypsine-EDTA  ;	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Pyruvate de sodium	Invitrogen	11360-070
Gentamicine  ;	Invitrogen	15750-060
Pénicilline/streptomincine  ;	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham’s F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endothélial Milieu basal	Lonza	CC-3156	EBM-2
Supplément de croissance des cellules endothéliales	Millipore	02-102	ECGS