Ici, nous décrivons une méthode simple d’injection intraventriculaire et intravasculaire de particules virales ou de microbilles fluorescentes dans le cerveau de souris néonatale. Le modèle de localisation du virus et des nanoparticules a pu être détecté par évaluation microscopique ou par hybridation in situ.
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Article de méthode
Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans l'étude sur la pathogenèse de l'encéphalite virale, la méthode d'infection est critique. La première des deux voies principales infectieuses vers le cerveau est la voie hématogène, ce qui implique l'infection des cellules et les pericytes du cerveau endothéliales. Le second est le intracérébroventriculaire (ICV) itinéraire. Une fois dans le système nerveux central (SNC), les virus peuvent se propager dans l'espace sous-arachnoïdien, des méninges et plexus choroïde par le liquide céphalorachidien. Dans des modèles expérimentaux, les premiers stades de la distribution virale CNS ne sont pas bien caractérisées, et il est difficile de savoir si seules certaines cellules sont initialement infectées. Ici, nous avons analysé la distribution du cytomégalovirus (CMV) particules pendant la phase aiguë de l'infection, appelée virémie primaire, suivant ICV ou intravasculaire (IV) l'injection dans le cerveau de souris néonatale. Dans le modèle d'injection ICV, 5 pi de CMV murin (MCMV), ou des microbilles fluorescentes ont été injectées dans le ventricule latéral du midpoint entre l'oreille et l'oeil en utilisant une seringue de 10 ul avec une aiguille 27G. Dans le modèle d'injection intraveineuse, une seringue de 1 ml avec une aiguille de 35 G a été utilisée. Un transilluminateur a été utilisé pour visualiser le temps (faciale) veine superficielle de la souris néonatale. Nous infusé 50 pi de MCMV ou microbilles fluorescentes dans la veine temporale superficielle. Les cerveaux ont été récoltés à différents moments après l'injection. Génomes Mcmv ont été détectés en utilisant la méthode dans d'hybridation in situ. microbilles fluorescentes ou protéine fluorescente verte exprimant des particules Mcmv recombinantes ont été observées par microscopie à fluorescence. Ces techniques peuvent être appliquées à de nombreux autres agents pathogènes pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite.
Introduction
Lorsque l'on étudie l'encéphalite virale, la distribution initiale des particules virales est très important de comprendre la pathogenèse de la maladie et d'identifier des cibles virales dans le cerveau. La plupart des virus varient en taille de 20 à 300 nm, bien que la pandoravirus est supérieure à 700 nm de taille 1. La distribution des particules virales dans la phase aiguë de l'infection peut dépendre de la taille des particules, la distribution des récepteurs cellulaires, ou l'affinité des récepteurs cellulaires pour le virus. Dans les modèles animaux, intracérébroventriculaire (ICV), intrapéritonéale, placentaires directe, et par ....
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Protocole
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de l'Université Hamamatsu de l'École de médecine de soins aux animaux.
1. Préparation de MCMV (souche Smith) et recombinant M32-protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) -MCMV
- Générer des recombinants M32-EGFP MCMV selon le procédé de la manière suivante (1.2 - 1.9) et 8 comme décrit précédemment.
- Utilisez des virus recombinants dérivés de la souche Smith de type sauvage MCMV (numéro d'accession: U68299). Insérer EGFP (4,361 paires de bases; pb) entre 37089 et 41450 pb (M32 - locus M31) dans le génome MCMV par....
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Résultats
Dans les études sur la pathogenèse de l'encéphalite virale, la méthode d'infection est importante. La voie hématogène représente une infection aiguë des cellules et des pericytes du cerveau endothéliales, alors que la route ICV représente une infection aiguë propagation via le CSF à travers l'espace méningée, atteignant les méninges et le plexus choroïde. À analyser la première distribution de particules dans l' encéphalite aiguë, une hybridation in situ pour la .......
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Discussion
Dans les modèles animaux, ICV, intrapéritonéale, placentaire directe, et les infections IV ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite virale. Nous nous sommes concentrés sur les modèles de ICV et d'injection IV de souris néonatales pour la simplicité des procédures et l'avantage de l'injection directe de particules dans la région cible. Bien que l' infection intrapéritonéale est une méthode facile, les particules virales se propagent de manière systémique par l' intermédiaire .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient M. Masaaki Kaneta, Mme Hiromi Suzuki et Mme Mitsue Kawashima (Département de pathologie régénérative et infectieuse, Faculté de médecine de l’Université de Hamamatsu) pour leur excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science, KAKENHI numéro de subvention 23590445.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| tris ; tris(hydroxyméthyl)- aminométhane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vecteur ; | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Polystyrène fluorescent rouge du Nil 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. ; | FP-2056-2 | |
| 10 % sérum de souris | DAKO ; | X0910 | |
| C57BL/6 souris | SLC, Inc. | ||
| Souris ICR | SLC, Inc. | ||
| Seringues modifiées d’un microlitre (série 7000) | Hamilton | ||
| Saito Medical | |||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| Tampon de citrate (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsine | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Sulfate de dextran sel de sodium | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt’s Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Levure tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus verre | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| Griffonia simplicifolia conjugué à la FITC isolectine B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-souris CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong ; Or | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
Références
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al.
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