Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

Résumé

Ce protocole fournit des instructions étape par étape sur la façon de générer des embryons de poisson-zèbre parabiotique de différents antécédents génétiques. Lorsqu’elle est combinée aux capacités d’imagerie inégalées de l’embryon de poisson-zèbre, cette méthode fournit un moyen unique et puissant d’étudier les fonctions autonomes cellulaires par rapport aux fonctions non autonomes cellulaires pour les gènes candidats d’intérêt.

Résumé

parabiose chirurgicale de deux animaux de différentes origines génétiques crée un scénario unique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des rôles de cellules extrinsèque pour les gènes candidats d'intérêt, les comportements migratoires des cellules, et des signaux sécrétées dans les milieux génétiques distincts. Parce que les animaux parabiose partagent une circulation commune, de sang ou d'un facteur par le sang d'un animal ne sera échangée avec son partenaire et vice-versa. Ainsi, les cellules et les facteurs moléculaires dérivées d'un fond génétique peuvent être étudiés dans le cadre d'un deuxième arrière-plan génétique. Parabiose des souris adultes a été largement utilisé pour le vieillissement de la recherche, le cancer, le diabète, l'obésité et le développement du cerveau. Plus récemment, parabiose des embryons de poisson zèbre a été utilisé pour étudier la biologie du développement de l'hématopoïèse. Contrairement aux souris, la nature transparente des embryons de poisson zèbre permet la visualisation directe des cellules dans le contexte parabiose, ce qui en fait une méthode unique et puissant pour étudier fmécanismes cellulaires et moléculaires FONDAMENTAUX. L'utilité de cette technique, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte pour générer les embryons de poisson zèbre parabiose. Ce protocole fournit une méthode étape par étape sur la façon de fusionner chirurgicalement l'blastulas de deux embryons de poisson zèbre de différentes origines génétiques pour étudier le rôle des gènes candidats d'intérêt. En outre, les embryons de poisson zèbre parabiose sont tolérants au choc thermique, ce qui rend le contrôle temporel de l'expression du gène possible. Cette méthode ne nécessite pas un système sophistiqué set-up et a de larges applications pour l' étude de la migration des cellules, la spécification du destin, et la différenciation in vivo au cours du développement embryonnaire.

Introduction

Création de mosaïques génétiques (chimères) entre type sauvage et les animaux génétiquement modifiés est une stratégie bien établie et classique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des fonctions cellulaires extrinsèque de gènes candidats ^1-6. Blastula transplantation chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des embryons chimères pour les études de cellules-autonomie ^7-9. Selon le tissu d'intérêt, cependant, il peut être difficile de cibler de manière prévisible les cellules du donneur au tissu désiré (par exemple, le sang) ^{1-3, 7-9.} Généticiens souris ont longtemps utilisé des méthodes chirurgicales parabiose pour générer des organismes conjoints avec une circulation partagée ^10-14. Étant donné que les animaux parabiose partagent un flux sanguin commun, les interactions entre les cellules qui proviennent d'un animal avec des cellules d'un autre animal d'un arrière - plan génétique différent peuvent être étudiés ^10-16. Récemment, le groupe de Karima Kissa a démontré avec élégance la capacité de cremangé embryons de poisson zèbre conjoints et ensuite utiliser ce système pour étudier souches hématopoïétiques et cellules progénitrices (HSPC) migration ^15. En outre, parabiose zebrafish a récemment été utilisé pour étudier le rôle de la cadhérine endothéliale 5 dans la cellule souche hématopoïétique (CSH) émergence et la migration, ¹⁶ et d'étudier le rôle des cellules stromales dans le créneau HSPC au cours du développement zebrafish ^17.

Contrairement à des souris, des embryons de poisson zèbre sont transparents et permettent une visualisation directe des cellules au cours du développement parabiose, ce qui rend le système unique et puissant. L'utilité de parabiose zebrafish, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte, et la chirurgie parabiose sur les embryons délicats peuvent être techniquement difficile sans instructions détaillées et démonstration visuelle. L'objectif de ce protocole est de fournir un ensemble d'instructions étape par étape claires pour accompagner des didacticiels vidéo sur la façon de générer des embryons de poisson zèbre pour étudier parabiosetemporelle de cellule intrinsèque, ou des fonctions cellulaires extrinsèque d'un gène (s) candidat par fusion chirurgicale de développer blastulas. Les modifications clés et des recommandations supplémentaires pour augmenter la survie des parabiont et de nouvelles applications expérimentales sont incluses.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité soin et l'utilisation Animal Hospital de Boston Children. Ce protocole est modifié à partir d' une méthode précédemment publiée le ^15.

1. Préparation des réactifs (jours ou semaines à l'avance)

1. Préparer des plats d'agarose revêtues de 1,5%. Ajouter 1,5 g d'agarose à 100 ml de milieu Zebrafish E3 dans un flacon Erlenmeyer. Chaleur, dissoudre l'agarose, puis verser environ 5 ml en 100 mm de diamètre x 20 mm de boîtes de Pétri profondes.
   Note: Ils sont utilisés pour dechorionation d'embryons (étape 3.1) et pour la chirurgie parabiose (étape 3.3). Rangez plats agarose revêtues à 4 ° C pendant quelques semaines; les sortir du réfrigérateur et réchauffer à température ambiante, le matin du jour de la chirurgie parabiose.
2. Préparer 4% de méthylcellulose. Dissoudre 4 g de poudre de cellulose de méthyle dans 100 ml de E3 dans une fiole Erlenmeyer avec un barreau d'agitation. Placer le ballon sur une plaque d'agitation à 4 ° C, réglé à la vitesse la plus basse, et laissez-le mélangerjusqu'à 2 jours.
   1. utiliser par intermittence une spatule pour briser les mottes blanches de la méthylcellulose. Les cristaux de méthylcellulose ne se dissolvent pas complètement à cette concentration. Lorsque la solution devient claire et semble homogène, sans grumeaux blancs restants, aliquote de la solution dans 1,5 ml microtubes et congeler à -20 ° C pour le stockage à long terme.
      Note: Des concentrations plus faibles de la cellulose de méthyle peuvent être utilisés; cependant, ce pourcentage plus élevé, la méthylcellulose plus visqueuse a donné les meilleurs résultats.
3. Préparer Ringer (HCR) solution High Calcium. Pour 400 ml de solution HCR, mélanger 8 ml de NaCl 5M (116 mM final), 400 pi de KCl 3M (2,9 mM final), 800 pi de 5 M CaCl ₂ (10 mM final), et 2ml de 1M HEPES (5 mM final) avec 390 ml de E3 médias.
   Remarque: solution magasin HCR à 4 ° C pendant quelques semaines; réchauffer à température ambiante, le matin du jour de la chirurgie parabiose.
4. Préparer 5 - 6 pipettes Pasteur modifiés pour le transfertanneau blastula paires. chauffer brièvement l'extrémité de la pipette sur un brûleur Bunsen. Ensuite, en utilisant de grandes pinces, plier l'extrémité de la pipette à environ 45 ° C, tandis qu'il est encore chaud.
   1. Pour assurer qu'il n'y a pas de bords tranchants qui pourraient endommager les embryons, tenir la pointe de la pipette brièvement dans la flamme pendant environ 3 sec. Cela facilitera / polish la fin de la pipette. Cette pipette Pasteur en verre modifié est utilisé en conjonction avec une pompe 10 ml de pipette (figure 1) à l' étape 3.5.
5. Préparer des outils d'aiguille de verre pour la couture chirurgicale de paires de blastula. Tirez 2 - 3 aiguilles de verre comme cela se fait pour la microinjection d'embryons de poisson zèbre. Utilisez laboratoire film pour fixer chaque aiguille de verre à l'extrémité d'une aiguille de taquineries bois ou en plastique manche (figure 1A). En utilisant des pinces, brisez l'extrémité de l'aiguille à un diamètre d'environ 20 - 30 um. Utiliser un micromètre pour guider cette étape (figure 1B).
   Note: La taille de la needle pointe est importante. Si la pointe est trop grand, il devient difficile de contrôler avec précision et peut causer des dommages excessifs. Si la pointe est trop petit, il est difficile de suffisamment blesser les embryons.

2. Mise en place de couples reproducteurs de Zebrafish et Collection de Embryons (Jour -1 à jour 0)

1. Mettre en place couples reproducteurs de poisson zèbre adulte. Mettre en place des poissons la nuit avant la chirurgie de parabiose doit être effectuée. Utilisez diviseurs pour séparer les mâles et les femelles. Pour augmenter les chances que les embryons désirés seront obtenus, mis en place plusieurs paires de chaque ligne. Nous constatons que généralement de 20 - 50% des couples se reproduire.
2. Le lendemain matin, tirez les diviseurs et permettre l'accouplement. Recueillir des embryons en utilisant une passoire à thé fin de maille, puis les transférer sur une boîte de Pétri contenant du milieu de l' embryon E3 ^18.
3. Micro-injecter les embryons comme souhaité (par exemple avec 25 pg d' ADN de plasmide, 200 pg d' ARNm ou à 1 - 6 ng morpholino) à 1 h de recouvrement. Leur permettrecroître jusqu'à ce stade 256 cellules. Si la construction d'expression d'ADN est placée sous le contrôle d'un promoteur de choc thermique (par exemple, hsp70, figure 4B), contrôler le moment de l' expression génique par la chaleur choquer les parabionts à 37 ° C à un stade ultérieur (par exemple., À 36 HPF ).
   Remarque: Comme une alternative à un transgène fluorescent, le dextran fluorescent peut être ajouté à l'ADN, l' ARN, ou la combinaison d'injection morpholino (par exemple, le dextran, le bleu cascade à 2 mg / ml). Le colorant dextran ne sera pas interférer avec le développement normal et permettra de l'embryon injecté à être identifié sous la lumière fluorescente appropriée après la fusion parabiose. En variante, la parabiose d'une souche pigmentée (par exemple, AB) avec une souche non pigmentée (par exemple, Casper) pourrait être utilisé pour identifier l'embryon injecté à des stades ultérieurs.
4. Incuber les embryons à 28,5 ° C.Utilisation un stéréoscope pour surveiller leur développement périodiquement comme ils près de la dev 256 cellulesstade elopmental (environ 2,5 HPF).
   Remarque: Si nécessaire, déplacer des embryons à des températures différentes pour assurer l' appariement de scène entre les partenaires parabiose (par exemple, des embryons de morpholino-injecté développent souvent plus lents que leurs homologues de l' ONU-injecté Shifting les embryons un-injecté à la température ambiante tandis que les embryons de morpholino-injecté sont placés. à 28,5 ° C entraînera dans leurs phases d'alignement après quelques heures de développement).

3. Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

1. Comme les embryons approchent le stade 256 cellules (environ 2,5 HPF), transférer les embryons de l'arrière - plan génétique (c. -à- mutant génétique, lignées transgéniques et / ou manipulation génétique) dans des boîtes d'agarose revêtues distinctes (par exemple, un plat pour morpholino- embryons injectés et un second plat pour les embryons de contrôle). Vous pouvez également transférer les embryons à nettoyer, béchers de verre sans rayures ou verre boîtes de Pétri.
   Remarque: Évitez d'utiliser des plats en plastique non couchés que les embryons vont coller à la matière plastique et être endommagé une fois hors de leurs chorions.
2. Décanter les médias E3 jusqu'à ce que suffisamment de liquide reste à couvrir les embryons (environ 7 - 10 ml). Ajouter 200 ul de 50 mg / ml de mélange de proteases isolées du liquide extracellulaire de Streptomyces griseus (protéases). Agiter les embryons doucement toutes les deux minutes.
   1. Lorsque 50% des embryons sont sortis de leurs chorions, ce qui prend généralement de 5 - 10 minutes, rincez-les trois fois avec un volume généreux (environ 15 - 20 ml) de milieu E3 d'embryons frais.
      1. Dechorionate tous les embryons restants dans leurs chorions en les tirant doucement dans la pipette Pasteur en verre modifié et puis doucement les dissiper. Une fois que les embryons ont été dechorionated et lavé, remplacer les médias E3 avec une solution HCR. Comme alternative aux protéases, retirez les chorions manuellement à l'aide d'une pince fine. But d'avoir 60 - 100 dechorembryons ionated disponibles pour chaque condition expérimentale.
         Note: Ceci est plusieurs fois plus que sera finalement utilisé, mais de nombreux embryons sont susceptibles d'être endommagés lors de la manipulation ou la chirurgie pour parabiose. Une fois que les embryons sont dechorionated, gardez-les submergées et ne leur permettent pas de toucher la surface de l'eau, comme la tension superficielle provoque leur destruction. Gardez à l'esprit que l'utilisation d'une dose plus élevée de protéases permet aux embryons de sortir de leurs chorions plus tôt et d'une manière plus synchronisée. Lors de l'utilisation d'une dose plus faible de protéases, les embryons prennent plus de temps pour sortir de leurs chorions et de le faire d'une manière synchrone moins, ce qui peut entraîner une partie des embryons soient endommagés par une exposition prolongée aux protéases.
3. Décongeler la méthylcellulose (faite à l'étape 1.2 ci-dessus) et centrifuger dans une centrifugeuse de table sur la vitesse max pendant 10 min pour sédimenter cristaux non dissous qui peuvent endommager les embryons ou la rupture de leur jaunes.
   1. Après centrifugation, utiliser la fraction supérieure claire (environ 75% du volume). Transfert 1 - gouttes de diamètre 1,5 cm de methylcellulose dans une boîte de Petri 1,5% d'agarose revêtues. Prenez soin d'éviter l'élaboration de l'un des cristaux granulées du fond du tube.
   2. Utiliser un marqueur pour prédéterminer la position de chaque gouttelette sur la face inférieure de la coupelle. Placez 12 - 15 gouttes (2 - worth de 3 aliquotes) de méthylcellulose par boîte de 100 mm de diamètre de Pétri. Préparer autant de plaques, au besoin, par expérience.
      Remarque: Utilisez chaque gouttelette pour la fusion d'une paire de blastula unique. La marque désignera l'emplacement de chaque gouttelette une fois que le support est ajoutée à quel point les gouttes deviennent presque invisibles.
4. Préparer un 40 ml aliquote de solution antibiotique supplémenté HCR par plat d'agarose revêtu préparé ci-dessus à l'étape 3.3. 40 ml à chaque aliquote d'ajouter HCR pénicilline-streptomycine à 50 U / ml d'ampicilline, à 50 U / ml et de la kanamycine à 0,5 pg/ Ml.
   1. Lorsque vous êtes prêt à effectuer blastula fusions, remplissez soigneusement chacun des plats contenant de la méthyl gouttelettes de cellulose avec 40 ml de la solution d'antibiotique supplémenté HCR. Si la solution HCR est ajouté trop rapidement, il peut perturber les gouttelettes.
5. Fixer le verre modifiée pipette Pasteur (faite à l'étape 1.4 ci-dessus) à une pompe à pipette de 10 ml. Dans le cadre d' un stéréoscope recueillir un embryon dechorionated de l'arrière - plan (par exemple, un embryon de morpholino-injecté et un embryon de type sauvage).
   1. Avant de distribuer les deux embryons, utiliser la pipette Pasteur pour faire une petite dépression dans le milieu de la chute de la méthylcellulose, puis doucement déposer les deux embryons dans la dépression.
      Remarque: Au cours du processus de transfert, tourner la pipette Pasteur légèrement vers le haut pour que les embryons se déposent dans le virage de la pipette Pasteur afin d'éviter leur prise de contact avec la surface du liquide en haut ou en bas de la pipette (qui peut conduire à their rupture).
6. Immédiatement après le dépôt des embryons dans la cellulose de méthyle, en utilisant une aiguille de taquin bois ou de matière plastique traitée avec une pointe de pipette de gel de chargement à l'extrémité (figure 1A) afin de repositionner soigneusement les embryons au sein de la méthyl cellulose de telle sorte que leurs pôles d'animaux sont directement toucher les uns les autres.
   1. Utiliser des mouvements de balayage doux à travers la méthylcellulose à proximité des embryons pour les repositionner sans les toucher directement. Laissez les embryons reposer pendant 5 min de sorte que la méthylcellulose réglera autour d'eux. Pendant ce temps, charger la paire suivante dans une autre goutte.
      Remarque: Éviter tout contact direct avec les embryons et de prendre soin de ne pas toucher une partie de la vésicule ombilicale, qui sera facilement se rompre.
7. Utilisation de l'outil aiguille de verre, enroulé soigneusement chaque embryon à leur point de contact. Avec un mouvement de couture douce, les cellules du premier embryon peut être tiré dans le second embryon, puis de nouveau.A la fin de ce mouvement, maintenir l'aiguille en place pendant 2 - 3 sec puis dessiner loin très lentement.
   Note: Il y a une période d'environ 2 - 3 sec après que les embryons sont blessés où les deux tissus semblent être plus adhésif et plus susceptibles de joindre les uns aux autres. Ainsi, nous croyons que la tenue de l'aiguille en place brièvement après la blessure aide à garder les tissus blessés de chaque embryon en contact pendant la période initiale de temps immédiatement après la blessure.
8. Permettre à ces embryons reposer pendant 10 - 15 min à température ambiante. En attendant, continuer d'assembler des nouvelles paires dans d'autres gouttes de méthylcellulose. Au bout de 10 - 15 min, évaluer si la première paire est resté attaché (figure 2A).
   Remarque: Si les embryons sont plus attachés, répétez le processus de couture aussi longtemps que les embryons sont plus jeunes que autour de la scène épibolie 30%. Typiquement, cela permet jusqu'à trois tentatives pour assembler les embryons ensemble. Si les embryons semblent avoir maintenu une pièce jointe, mais le connection ne sont pas importantes, effectuer des coutures supplémentaires au niveau du bord de la connexion pour le renforcer. Évitez de secouer ou de déplacer la vaisselle durant les périodes de chirurgie et d'incubation parabiose.
   Note: En dépit de leur stade de développement précoce et la fragilité perçue, les masses cellulaires des embryons peuvent tolérer une quantité substantielle de manipulation (ie, blessant et couture), et encore se développer normalement. Le jaune, cependant, peut se rompre avec seulement le moindre contact, tuant l'embryon. Lorsque coudre les deux blastulas avec l'aiguille de verre, ne pas entrer en contact avec l'interface entre la masse cellulaire et le jaune de chaque embryon.
9. Incuber les embryons O / N à 28,5 ° C dans le même plat et les médias (ne pas changer les médias). Le matin suivant, les embryons se sont déplacés hors des gouttelettes de méthylcellulose essentiellement dissous. Retirez tous les embryons qui ne sont pas fusionnés avec succès. Décanter les médias et le remplacer par un nouveau 25 ml E3.
   Remarque: Si vous travaillez avec unsouche pigmentée, ajouter 500 ul de 0,15% (50x) phénylthiourée (PTU) à une concentration finale de 0,003% pour bloquer la pigmentation. Embryons devront rester en permanence en PTU pour maintenir la suppression de la pigmentation.

4. Microscope Setup, l'acquisition d'images, traitement et analyse

1. Préparer 0,8% à faible point de fusion (LMP) agarose: Ajouter 0,8 g d'agarose LMP à 100 ml E3 et de la chaleur jusqu'à dissolution complète. Bien chaud, aliquote 1 ml d'agarose LMP dans 1,5 ml microtubes dans un C bloc 37 ° de chauffage. L'agarose LMP restera fondu à 37 ° C. Ajouter 40 pi de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaïne à chaque aliquote de 1 ml d'agarose LMP à 37 ° C. Remarque: Si vous travaillez avec une souche pigmentée, ajouter 20 pi de 0,15% (50x) PTU à chaque aliquote 1ml.
   1. Stocker l'agarose LMP restant pendant plusieurs mois dans scellés tubes de 50 ml à 4 ° C.
2. Anesthésier les embryons parabiose devant être imagé par l'addition de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaïneaux 25 ml de l'E3 que les embryons sont déjà.
3. Remuer doucement le plat de sorte que les embryons en commun dans le milieu. Puis, à l'aide d'une pipette de transfert en plastique large pointe établit les embryons en aussi peu de liquide que possible. Tournez la pipette en position verticale et rebondir doucement les embryons afin qu'ils déposent au fond même de la pipette.
   1. Les embryons au fond de la pipette, transférer à une aliquote de 1 ml d'agarose LMP en touchant légèrement la pointe de la pipette à la surface de l'agarose. Évitez le transfert du liquide en excès car cela va diluer l'agarose.
4. Après l'expulsion de l'excès de liquide de la pipette, utiliser la pipette pour mélanger doucement les embryons dans le agarose, puis utilisez la pipette pour transférer la totalité de l'agarose et des embryons pour le bien d'un fond de verre (n ° 1,5 lamelle), 6- bien assiette.
   Remarque: Assurez-vous de jeter la pipette après le transfert des embryons à la plaque d'imagerie. agarose résiduel sera fixé à l'intérieur de la pipette, rendering inefficace pour une utilisation ultérieure. Au contraire, utiliser une nouvelle pipette à chaque fois.
5. Dans le cadre d'un stéréoscope, utilisez une pointe de pipette gel chargement fixé sur l'extrémité d'une aiguille de taquineries bois manipulé pour positionner les embryons vers le bas vers le couvercle en verre (pour assurer qu'ils sont dans la distance de travail de l'objectif du microscope) et dans l'orientation souhaitée pour l'imagerie.
   Remarque: Repositionner en continu jusqu'à ce que l'agarose est complètement réglé. Prendre soin de monter les embryons parabiose selon lequel l'embryon de la paire est à imager. Compte tenu de l'orientation aléatoire des embryons conjoints, pour certaines paires, il peut être difficile d'imaginer les deux embryons. Dans ce scénario, récupérer les embryons à partir de l'agarose à l'aide d'une pince et une pipette de transfert en plastique large pointe puis remontez pour l'imagerie d'une perspective différente.
6. Une fois que l'agarose a fixé, couvrir avec 2 - 3 ml de E3 supplémenté avec tricaïne (et PTU si nécessaire).
7. Image les embryons en utilisant un grand champ epi-fluorescence inversée, lasconfocal er-balayage, ou tourner le disque microscope confocal. Sélectionnez l'objectif le plus approprié pour l'imagerie souhaitée. Pour un champ de vision entier embryon, utiliser un objectif 4x. Sélectionnez un grossissement plus élevé, comme un objectif 20x, à l' image d' un tissu spécifique ^{16, 19.}
   Remarque: Si vous utilisez un microscope droit, monter en agarose LMP (comme ci-dessus) sur une lamelle de verre. Inversez la lamelle de verre sur une lame de microscope en verre qui a un anneau de graisse à vide rempli avec le même E3-tricaïne-PTU ^{16, 19.}
8. Processus images acquises en utilisant des logiciels d'analyse d'images libres tels que NIH Image J / FIDJI ^{16, 19.}
   Remarque: Comptez le nombre de cellules et de quantifier la dynamique tels que la migration cellulaire et la division cellulaire en utilisant la segmentation et le suivi des algorithmes ^{16, 19.}

Résultats

Conformément aux études publiées antérieurement ^15, avec succès la fusion parabiose des embryons de poisson zèbre dépend de la mise en scène et l' orientation des deux embryons et la concentration de méthylcellulose. Avec seulement quelques outils simples et peu coûteux, blastulas développement chirurgicalement fusionnées ont été générés qui a grandi dans des embryons parabiose avec la circulation partagée. Ces outils comprennent une pipette modifiée Pasteur, une pompe à pipet...

Discussion

Fusion parabiose a été un outil puissant pour étudier les fonctions cellulaires de gènes candidats dans des modèles murins adultes et d' embryons de poulet ^10-14. Plus récemment, une méthode blastula de fusion a été décrite pour la génération d' embryons de poisson zèbre conjoints ^15. Dans le présent protocole, des didacticiels vidéo sont utilisés pour démontrer et mieux décrire la méthodologie pour la création d'embryons de poisson zèbre parabiose de différentes origines génétiques afi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Méthylcellulose	Sigma	M0387
Composants individuels pour E3/HCR :		Pour 1L : 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
NaCl (chlorure de sodium)	Sigma-Aldrich	S9888
KCl (chlorure de potassium)	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2 (Chlorure de calcium dihydraté)	Sigma-Aldrich	223506
MgSO4 (Sulfate de magnessium heptahydraté)	Solution tampon Sigma-Aldrich	230391
Hepes (1M )	ThermoFisher	15630-080
Nom	Entreprise	Catalog Nombre <
strong>Antibiotiques :
Pen/Strep	gibco by Life technologies	15140-120
Sel sodique d’ampiciline	Sigma Life Science	A0166
Sulfate de kanamycine de Streptomyces kanamyceticus	Sigma Life Science	K1377
Name	Company	Numéro de catalogue
50 mg/ml Pronase de Streptomyces	griseus Roche	11459643001
verre capillaire utilisé pour les aiguilles (Capillary Glass & Filaments)	Instrument Sutter	ARTICLE# : BF 100-50-10
Aiguilles de taquinage avec poignées en bois	Fisher Scientific	S07894
Pipettes Pasteur en verre	Fisherbrand	13-678-20A
Pompe à pipette de 10 ml (vert) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000
Boîtes de Pétri en plastique de 100 mm de diamètre / 20 mm de profondeur (PARABOLE PETRI, 100/20 MM, PS, TRANSPARENT, AVEC ÉVENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )	Greiner Bio-one	664102
Dextran, Bleu Cascade, 10 000 MW, Anionique, Lysine Fixable	ThermoFisher	D-1976
PTU. La charge de travail est de 0,003 % (50x est 0,15 %). pour 500 ml, 0,75 g N-Phénylthiourée	Sigma-Aldrich	P7629
Tricaïne (poudre) (Tricaïne, Méthanesulfonato, Tricaïne-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Agarose LMP (Agarose LMP ultrapure)	Invitrogen	16520100
(juste l’extrémité large je pense)	Fisherbrand	137115AM
Plaques à 6 puits à fond de verre utilisées pour l’imagerie	MatTek	P06G1.5-20-F
pointe de chargement en plastique western gel fixée à l’extrémité d’une aiguille de dissection à manche en bois (pointes GELoader)	Eppendorf	22351656
couvercle en verre, lames et graisse sous vide si montage pour un microscope droit :
Graisse sous vide ( Dow Corning® ; graisse silicone sous vide poussé incolore, poids 5,3 oz (tube) )	Dow Corning	Z273554
Couvercles	en verreCorning Sciences de la vie	2960-244