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Article de méthode

Optimal Lentivirus Production et culture cellulaire Conditions nécessaires pour réussir Cellules transduction humains primaires épithéliales bronchiques

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⸱

DOI :

10.3791/54176

⸱

22 juillet 2016

 ,  , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care, and Sleep Medicine, University of Miami, Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology, University of Miami, Miller School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Les cellules épithéliales bronchiques humaines primaires sont difficiles à transduire. Ce protocole décrit la production de lentivirus et leur concentration ainsi que les conditions de culture optimales nécessaires pour réaliser des transductions très efficaces dans ces cellules tout au long de la différenciation vers un épithélium pseudo-stratifié.

Résumé

La culture in vitro de cellules humaines primaires épithéliales bronchiques (HBE) en utilisant des conditions d'interface air-liquide fournit un modèle utile pour étudier les processus de différenciation et de la fonction des cellules des voies respiratoires. Au cours des dernières années, l'utilisation de vecteurs lentiviraux pour la livraison de transgène est devenu pratique courante. Bien qu'il existe des rapports de transduction des cellules épithéliales des voies aériennes complètement différenciées avec certains lentivirus pseudo-typés non-VIH, l'efficacité globale de transduction est habituellement inférieure à 15%. Le protocole présenté ici fournit un procédé fiable et efficace pour produire des lentivirus et pour transduire des cellules épithéliales bronchiques humaines primaires. En utilisant des cellules epitheliales bronchiques non différenciées, une transduction dans un milieu de croissance épithéliale bronchique, tandis que les cellules se fixent, avec une multiplicité d'infection par le facteur de 4 fournit des rendements proches de 100%. Ce protocole décrit, étape par étape, la préparation et la concentration de titre élevé vecteurs lentiviraux et eprocessus de transduction de e. Il examine les expériences qui ont déterminé les conditions de culture optimales pour atteindre transductions très efficace de cellules épithéliales bronchiques humaines primaires.

Introduction

Le développement de la réplication défectueuse, lentivirus pseudotypés (LV) a fourni aux chercheurs une méthode sûre et efficace pour délivrer des transgènes in vitro 1. En raison de leur expression à long terme, celles - ci LV pourrait également être utilisé pour la délivrance d'agents thérapeutiques in vivo 2,3. La production de LV nécessite co-transfection de rein embryonnaire humain (HEK) cellules avec plusieurs plasmides: vecteur de transfert, emballage gag / pol, emballage rev et enveloppe vésiculaire glycoprotéine du virus de la stomatite (VSV-G) plasmides. Les systèmes d'emballage de troisième génération sont considérés comme plus sûrs que les systèmes de seconde génération , car le gène rev est codé sur un plasmide séparé emballage, réduisant ainsi la possibilité d' une recombinaison pour produire un lentivirus compétent pour la replication. Bien que les systèmes d'emballage de deuxième génération donnent cinq unités de pliage totales plus élevées de transduction, la scission du génome viral d'origine pour créerle système de troisième génération a diminué le niveau de transduction que très peu 3,4.

Bien que les lignées de cellules peuvent être transduites plus facilement et efficacement, les chercheurs ont déplacé leur attention vers les cellules primaires, car ceux - ci sont plus représentatifs de tissus in vivo 5,6. Cependant, les cellules primaires sont réfractaires à la transduction. Alors que la transduction des cellules de l' épithélium des voies respiratoires totalement différenciées ont été rapportés, le rendement global ne dépasse pas 15% 7.

Décrite ici est un protocole qui permet la production de LVs à titre élevé. Une approche étape par étape est décrite pour atteindre près de 100% d'efficacité de transduction dans les cellules HBE primaires. Plus précisément, le protocole décrit les conditions optimales de culture instrumentales pour réussir 3. En bref, les cellules HEK 293T sont transfectées en utilisant le lentiviral pCDH vecteur d'expression avec l'EF-1 promoteur dirigeant l'expression d'une meilleure fluorescente verteprotéine (EGFP) ou mCherry, une protéine fluorescente rouge, et un système d'emballage de troisième génération. LVs libérés dans les médias sont collectés 24-72 heures plus tard. Les particules virales sont concentrées avec du polyéthylène glycol (PEG), un procédé commode et rapide de la concentration virale, avant l'estimation du titre en utilisant un dosage par immunosorbant antigène p24 lié à une enzyme (ELISA) trousse. Par la suite, les cellules HBE primaires non différenciées sont transduits dans un milieu de prolifération (milieu de croissance de l' épithélium bronchique ou BEGM) 8, tandis que la fixation (après avoir été trypsinisées), à une multiplicité d'infection (MOI) facteur 4, en ajoutant le bromure d'hexadiméthrine et incubation pendant 16 heures ( pendant la nuit). Les cellules sont ensuite autorisées à se différencier. Étant donné que le transgène viral est exprimé à long terme (au moyen du promoteur approprié, voir la discussion), l'expression sera maintenue tout au long de la différenciation dans un épithélium respiratoire pseudostratifié ou peut être induite (en utilisant un promoteur inductible) après la différenciation.

Ce protocole est d'un grand intérêt pour les chercheurs qui veulent utiliser les cellules HBE primaires au lieu de lignées cellulaires, et pourrait être adaptable à d'autres difficiles à transduction types de cellules.

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Protocole

1. Étape 1: Culture de HEK 293T

  1. Préparer des cellules HEK supports (désignés comme HEK médias) en ajoutant 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% (v / v) de pénicilline / streptomycine à haute teneur en glucose milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM).
  2. Revêtez un 10 cm de boîte de culture de tissu avec collagène I. Mix 30 pi de collagène I dans 2 ml d'eau distillée. Étaler le mélange sur le plat et incuber pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  3. Retirer le mélange et laisser le plat sec dans une hotte à flux laminaire pendant 15 min.
  4. Plaque cellules HEK sur le plat revêtu à une densité de 1 x 10 6 cellules dans 10 ml de milieu HEK et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Lorsque les cellules HEK sont 50-60% confluentes (figure 1a, 2-3 jours après le placage), passez à l' étape 2. L' évaluation visuelle de confluence est suffisante. Aucune quantification est nécessaire.
    Remarque: les cellules HEK sont cultivées dans des milieux de HEK (voir ci-dessus). Quand ils atteignent la confluence, they peut être divisé (par exemple 1/5) ou congelés vers le bas pour une utilisation ultérieure.

2. Etape 2: Production et concentration des lentivirus (EFV) dans les cellules HEK

Remarque: Les protocoles doivent être exécutés en conformité avec les règlements institutionnels et gouvernementaux sous + (Enhanced BSL-2) conditions aux Etats-Unis BSL-2.

  1. Transfecter en utilisant une procédure de précipitation au calcium (lipofectamine et d'autres agents de transfection ne sont pas aussi efficaces que la procédure de précipitation de calcium). Utilisation d'un kit de transfection commercial est recommandé pour assurer la reproductibilité, bien que le mode opératoire est modifié comme suit. Amener tous les réactifs à température ambiante. Ceci est le jour 0.
  2. Pour chaque boîte de 10 cm de cellules HEK293, mélanger 4,5 pg d'enveloppe ADN PMD2-VSVG, 7,5 pg d'emballage ADN pMDLg / pRRE, 3,75 pg d'ADN pRSV--rev, 10 pg d'ADN du vecteur d'expression lentiviral, 86 pl d'une solution 2 M de calcium et de l'eau stérile dans un tube de centrifugation de 15 ml à un volume final de 700 ul(Les deux dernières solutions sont fournies dans le kit de transfection commerciale).
  3. Goutte à goutte, ajouter 700 ul de solution saline 2x tamponnée HEPES (HBS, fournies dans le kit de transfection), tandis que vortex (dans l'armoire à flux laminaire) et incuber à température ambiante pendant 30 min (effectuer l'étape 4 en attendant).
  4. Au cours de la période d'incubation précoce, dépôt de 5 ul du mélange sur une lame. Vérifiez la gouttelette sous un microscope avec un objectif 10X, en se concentrant lentement de haut en bas. Un précipité fin doit être visible, ce qui confirme le processus de précipitation de phosphate de calcium (figure 1b).
  5. Arrêter la précipitation après 30 min par addition de 10 ml de cellules HEK médias et pipette haut et bas pour mélanger.
  6. Prenez le plat de cellules HEK de l'étape 2,1-2,5, et éliminer le milieu (jour 0). Ajouter la solution de précipité de l'étape 2,5 soigneusement et lentement le long du bord du plat.
  7. Le lendemain (jour 1), enlever et jeter le milieu contenant le précipité et le remplacer wi-ième 10 ml de milieu HEK. Vérifier l'amende précipité sous le microscope: elle doit être visible dans le plat dans les espaces vides entre les cellules (figures 1c et d).
  8. Le jour 2, collecter des supports avec une seringue, filtrer à travers un filtre à seringue de 0,45 um dans un tube de 15 ml contenant 3,8 ml de centrifugeuse d'un polyéthylène-glycol à 40% (PEG) solution. Invert 5x pour mélanger et stocker à 4 ° C pendant au moins 24 heures (pour le PEG précipite pour former, mais pas plus de 5 jours) jusqu'à ce que toutes les collections de virus sont complets.
  9. Répétez l'étape 2.8 aux jours 3 et 4. Le jour 4 ne remplace pas avec le milieu HEK mais décontaminez avec 10% de l'eau de Javel et jeter le plat.
  10. Centrifuger tous les tubes de collecte (habituellement toutes les collections ensemble le jour 5) à 1.650 xg pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter le virus. Retirer et jeter le surnageant, et tourner à nouveau à 1.650 xg pendant 5 min à 4 ° C pour recueillir et enlever tout reste de PEG surnageant.
  11. ResusPend le culot de chaque tube dans 200 ul de milieu de croissance de l' épithélium bronchique (BEGM) sans amphotéricine B 8. Les réunir et aliquote à 200 pi. virus de magasin à -80 ° C. Aliquoter supplémentaires 10 pi pour effectuer la Gag (p24) antigène test VIH-1 ELISA.
  12. En utilisant un kit ELISA du commerce, effectuer un dosage de l'antigène p24 selon le protocole du fabricant. L'essai donne une estimation de la p24 virale en pg / ml.

3. Étape 3: Cellules Culture HBE primaire

  1. Plaque de cellules HBE dans 10 ml BEGM milieu (avec 100 ul d' amphotéricine B si le passage 0 cellules sont utilisées pour éliminer la possibilité d'une contamination fongique) à une densité de 1 x 10 6 cellules d'un collagène de type I enduisais 10 cm de boîte de culture tissulaire. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. Le lendemain, retirez le support et le remplacer par 10 ml BEGM (avec 100 ul amphotéricine B pour le passage 0 cellules) pour un total de 4 jours. Retour à l'incubateur.
  3. Après 4 days, utilisez uniquement BEGM sans amphotéricine B. Changer les médias tous les jours.
  4. Lorsque les cellules sont 80-90% confluentes (Figure 2a; ~ 7 jours après le placage), procéder à la transduction (attention à 3,5 pour la préparation avant la transduction). Encore une fois, une évaluation visuelle de confluence est suffisante. Aucune quantification est nécessaire.
  5. Avant la transduction, enduire les inserts de support perméable à une solution de collagène IV, dilué à 1/10 avec de l'eau distillée stérile. Ajouter 200 pi à chaque insert et laisser sécher pendant la nuit dans la hotte à flux laminaire.

4. Etape 4: transduction des cellules HBE

  1. Retirer le support, ajouter 3 ml de trypsine à 0,1% dans de l' acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM dans du tampon phosphate salin (EDTA / PBS) et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Vérifiez sous le microscope (objectif 10X) pour voir si toutes les cellules sont détachées. Sinon, retournez à l'incubateur pendant 5 minutes supplémentaires.
  2. Lorsque toutes les cellules sont détachés, ajouter 3ml d'inhibiteur de trypsine de soja (SBTI 1 mg / ml), mélanger et transférer dans un tube centrifuger de 15 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 460 g pendant 5 min à température ambiante.
  3. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 3 ml de BEGM et procéder à comptage.
  4. Resuspendre les cellules HBE (maintenant passage 1 ou P1) à un rapport de 2 x 10 5 cellules par 12 mm , une pièce rapportée de support perméable dans 400 ul de BEGM (voir le tableau 2). Extrapoler ces valeurs en fonction de la quantité d'inserts de support perméable qui sera transduites.
Surface Surface Nombre de cellules Médias Volume (médias)
Boîte de 10 cm 52,7 cm 2 1 x 10 6 BEGM 10 ml
filtre 12 mm 1,13 cm 2 2 x 10 5 BEGM 400 ul
filtre 24 mm 4,52 cm 2 8 x 10 5 BEGM 800 pi

Tableau 2: extrapolation des médias par le nombre de cellules.

  1. En utilisant une multiplicité d'infection (MOI) de facteur 4, ajouter le volume approprié de virus à la suspension cellulaire.
  2. Ajouter le bromure hexadimethrine à un 2 pg / ml de concentration finale.
  3. Distribuer 400 ul du mélange (BEGM, HBE cellules, le virus et le bromure de hexadimethrine) par insertion de support perméable dans le compartiment apical, et ajouter 1 ml de BEGM seul le compartiment basolatéral. Incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. cellules Toujours plaque de HBE sans virus que le contrôle et la sélection de puromycine de test le cas échéant.
  4. Le lendemain, remmédias apical et basolatéral ove, lavage avec du PBS, et remplacer les deux compartiments avec l' interface air-liquide (ALI) médias 8.
  5. Lorsque les cellules sont confluentes, éliminer le liquide apicale (connu comme l'établissement d'une interface air-liquide). Continuer de changer le milieu (ALI) dans le compartiment inférieur tous les deux jours jusqu'à ce qu'ils atteignent leur pleine maturité; généralement 3 à 4 semaines plus tard.
    Remarque: Si le vecteur lentiviral contient un gène de sélection tel que la puromycine, les cellules peuvent être sélectionnées par l'addition de puromycine selon une courbe de concentration de sélection. Pour les cellules HBE, une concentration de 1 ug / ml a été déterminé comme idéal pour la sélection de cellules transduites cohérente. Cependant, cette concentration peut être différente pour d'autres cellules ou conditions et devrait être déterminée en tuant des courbes. L'addition de puromycine peut commencer dès le lendemain de la presse a été remplacé par les médias ALI ou plus tard (2-3 jours) pour permettre la pleine expression du gène de sélection. Soyez sûr d'ajouter puromycine à un insert hcomme non transduites. Puromycine peut être ajoutée jusqu'à ce que les cellules sont complètement différenciées.

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Résultats

La figure 1 illustre les différentes étapes clés d'évaluation de cellules et de solutions pendant le processus de transfection. La figure 1a représente la confluence optimale des cellules HEK293T avant la transfection pour la production de virus. Il est important que les cellules sont réparties uniformément dans le plat. La figure 1b montre le précipité dans une goutte du mélange de transfection utilisant une optique de champ lumineu...

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Discussion

Le protocole décrit ici assure près de 100% l'efficacité de transduction. Cependant, il y a des étapes au cours du processus qui sont importants pour atteindre cet objectif. Par exemple, pendant le processus de transfection, la présence de précipités dans le mélange de transduction (goutte) ou dans le plat du jour après transduction (figures 1 b et d) sont pertinents pour une bonne transfection. L'absence d'un précipité ou la présence d'agglomérats peut être due à une om...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions l'Agence de l'Université de Miami vie Alliance Organ Recovery pour fournir les poumons. Nous remercions également le Dr Lisa Künzi pour la préparation de l'ADN utilisé pour les expériences présentées dans la figure 2B et 3-D, le Dr Ben Gerovac et Lisa Novak pour le virus mCherry utilisé pour les expériences sur les figures 3A à C. Nous remercions également Gabriel Gaidosh de l'installation d'imagerie, Département d'ophtalmologie à l'Université de Miami.

Cette étude a été parrainée par des subventions du NIH, la Fondation de la mucoviscidose et de l'agent de bord Institut de recherche médicale au Dr Matthias Salathé.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
HEK293T/17 cellulesATCCCRL-11268
Sérum fœtal bovin (FBS)  ;Sigma12306Cà 10 %
DMEMThermo Scientific11995-040
Pénicilline/Streptomycine (100x)Thermo Scientific15140-122utiliser à 1x
Collagen IBD Biosciences354231diluer 1:75 dans de l’eau distillée
CalphosClontech631312Kit de transfection contenant 2 M de solution de calcium, 2x solution tamponnée HEPES (HBS) et stérile H2O
Polythylène glycol 8000VWR scientific101108-210stock de 40 %
BSigmaA9528utilisation à 1x
TrypsineSigmaT4799
Inhibiteur de trypsine de sojaSigmaT9128
Transwell 12 mmCorning3460
Collagen IVSigmaC7521diluer 1:10 dans de l’eau distillée
Bromure d’hexadiméthrineSigmaH9268stock de 2 mg/ml
Puromycine (10.000x)Thermo ScientificA11138-03utilisation à 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISAPerkinElmerNEK050001KT
F12Thermo Scientifique11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-PuroSystem BiosciencesCD532A-2vecteur d’expression lentivirale
pMD2-VSVGAddgene12259ADN d’emballage
pMDLg/pRREAddgene12251ADN d’emballage
pRSV-revAddgene12253ADN d’emballage
à d’amphotéricine

Références

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