Article de méthode

Caractériser Propriétés Multiscale mécaniques des tissus de cerveau en utilisant la microscopie à force atomique, Impact indentation et Rheometry

DOI :

10.3791/54201

⸱

6 septembre 2016

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1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un ensemble de techniques pour caractériser les propriétés mécaniques viscoélastiques du cerveau aux échelles micro, méso et macro.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour concevoir et ingénieur des matériaux inspirés par les propriétés du cerveau, que ce soit pour les simulants mécaniques ou pour les études de régénération des tissus, les tissus du cerveau lui-même doit être bien caractérisé à différentes échelles de longueur et de temps. Comme beaucoup de tissus biologiques, les tissus du cerveau présente une structure hiérarchique complexe. Cependant, contrairement à la plupart des autres tissus, le cerveau est de très faible rigidité mécanique, avec élastique des modules E de Young de l'ordre de 100s de Pa. Cette faible rigidité peut présenter des défis à la caractérisation expérimentale des propriétés mécaniques clés. Ici, nous démontrons plusieurs techniques de caractérisation mécaniques qui ont été adaptés pour mesurer les propriétés élastiques et viscoélastiques, les matériaux hydratés conformes biologiques tels que les tissus du cerveau, à différentes échelles de longueur et les taux de chargement. Au micrométrique, nous effectuons fluage-conformité et de relaxation de la force des expériences utilisant microscope à force atomique activé indentation. Au mesoscale, nous effectuons des expériences d'indentation d'impact en utilisant un pénétrateur instrumenté basé pendule. À l'échelle macroscopique, nous effectuons des plaques parallèles rhéométrie pour quantifier la fréquence dépendant de modules de cisaillement élastique. Nous discutons également les défis et les limites associées à chaque méthode. Ensemble, ces techniques permettent une caractérisation mécanique en profondeur du tissu cérébral qui peut être utilisé pour mieux comprendre la structure du cerveau et à l'ingénieur des matériaux bio-inspirés.

Introduction

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La plupart des tissus mous comprenant des organes biologiques sont mécaniquement et structurellement complexes, de faible rigidité par rapport à l'os minéralisé ou de matériaux d'ingénierie, et présentent une déformation non linéaire et dépendant du temps. Par rapport à d' autres tissus dans le corps, le tissu cérébral est remarquablement compatible avec les modules d' élasticité E de l'ordre de 100s de 1 Pa. Le tissu cérébral présente hétérogénéité structurelle de gris distincte et interdigitée et les régions de la substance blanche qui diffèrent également fonctionnellement. la mécanique des tissus cérébraux aideront à la compréhension de la conception des matériaux et des modèles informatiques pour simuler la réponse du cerveau au cours de blessure, de faciliter la prédiction des dommages mécaniques, et permettent l'ingénierie des stratégies de protection. En outre, de telles informations peuvent être utilisées pour examiner les objectifs de conception pour la régénération des tissus, et pour mieux comprendre les changements structurels dans le tissu cérébral qui sont associés à des maladies telles que la sclérose en plaques et l'autisme. Havant, nous décrivons et démontrons plusieurs approches expérimentales qui sont disponibles pour caractériser les propriétés viscoélastiques des tissus compatibles mécaniquement, y compris les tissus du cerveau, au micro, meso et macro-échelles.

Au micrométrique, nous avons mené fluage-conformité et la force des expériences de relaxation en utilisant microscope à force atomique (AFM) d'indentation -enabled. En règle générale, l' indentation AFM activé est utilisé pour estimer le module d' élasticité (ou rigidité instantanée) d'un échantillon de 2-4. Cependant, le même instrument peut également être utilisé pour mesurer viscoélastique micrométrique propriétés (temps ou taux dépendant) 5-10. Le principe de ces expériences, montré à la figure 1, est à mettre en retrait un AFM encorbellement sonde dans le tissu cérébral, de maintenir une amplitude déterminée de la force ou de la profondeur d'indentation, et de mesurer les changements correspondants dans la profondeur d'indentation et de la force, respectivement, au fil du temps. L'utilisation de ces données, nous pouvons calculer le fluage compliance J C et module de relaxation G R, respectivement.

A l'échelle méso, nous avons réalisé des expériences de mise en retrait d'impact dans des conditions de fluide immergé qui maintiennent la structure du tissu et le niveau d'hydratation, à l'aide d'un pendule à base nanoindenteur instrumenté. Le dispositif expérimental est illustré sur la figure 2. Comme le pendule oscille en contact avec le tissu, d'une sonde de déplacement est enregistrée en fonction du temps jusqu'à ce que le pendule oscillant vient en appui dans le tissu. De l'amortissement mouvement oscillatoire harmonique résultant de la sonde, on peut calculer la profondeur maximale de pénétration x max, la capacité de dissipation d'énergie K, et le facteur de qualité de dissipation Q (qui concerne le taux de dissipation d'énergie) du tissu 11,12.

À l'échelle macroscopique, nous avons utilisé une plaque rhéomètre parallèle à quantifier la fréquence de cisaillement dépend des modules élastiques,appelé le module de stockage G 'et le module de perte G ", du tissu. Dans ce type de rhéométrie, nous appliquons une souche angulaire harmonique (et la déformation de cisaillement correspondante) à des amplitudes et des fréquences connues et mesurer le couple réactionnel (et la contrainte de cisaillement correspondante) , comme le montre la figure 3. de l'amplitude et la phase résultant décalage du couple mesuré et les variables géométriques du système, nous pouvons calculer G 'et G "à des fréquences appliquées d'intérêt 13,14.

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Protocole

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Déclaration éthique: Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de recherche animale de l'Hôpital pour enfants de Boston et sont conformes aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Souris cerveau Procédures d'acquisition de tissus (pour l'indentation de l'AFM-permis et l'impact indentation)

  1. Préparer un mélange kétamine / xylazine pour anesthésier les souris. Combiner 5 ml de kétamine (500 mg / ml), 1 ml de xylazine (20 mg / ml) et 7 ml de 0,9% de solution saline.
  2. Injecter souris (Race: TSC1; Syn-Cre; plp-eGFP, Âge: p21; Sexe: Mâle ou femelle) avec 7 pi par gramme de poids corporel de la solution kétamine / xylazine.
  3. Une fois que la souris est entièrement anesthésié, comme en témoigne l'absence de réponse aux orteils et la queue pincements, euthanasier la souris par décapitation en utilisant grands ciseaux de dissection.
  4. Retirez le crâne en coupant au milieu en utilisant les petits ciseaux de dissection. À partir de cervelet, rempièces ove du crâne à l'aide des pinces incurvées. Après avoir retiré le crâne, le cerveau extrait à l'aide d'une spatule plate pour soulever le cerveau, en commençant par le cervelet et le cerveau placer sur une boîte de Petri. Éliminer le cervelet du cerveau en utilisant une lame de rasoir.
  5. Si vous utilisez un cerveau entier pour les tests d'indentation d'impact sur ​​les tissus frais, le transfert du cerveau dans un tube à fond rond avec du CO 2 milieu nutritif -indépendante pour le tissu neural adulte sur la glace et passez à la section 4. Sinon , passez à l' étape 1.6 pour trancher les procédures.
  6. Ajuster les paramètres de vibratome à une vitesse de 0,7 mm / s, une fréquence de vibration de 70 Hz et une épaisseur de tranche de 350 um. Entourez le plat de vibratome avec de la glace. Placez un peu de superglue sur la plaque vibratome et le cerveau monter de telle sorte que les tranches coronales peuvent être coupés, avec le cerveau orienté pour couper à travers la face dorsale d'abord.
  7. Remplissez le plat de vibratome avec du phosphate solution saline tamponnée de suffisamment de Dulbecco (DPBS) à un peu submerger le cerveau. Éleverle plat sur le vibratome de telle sorte que la lame est simplement immergée dans le DPBS.
  8. Appuyez sur start pour commencer à découper des coupes de cerveau coronales 350 um d'épaisseur.
  9. Utilisation de pinceaux pour éviter d' endommager le tissu, transférer les tranches de cerveau du bain vibratome de DPBS et dans un tube à fond rond avec du CO 2 milieu nutritif -indépendante pour le tissu neural adulte sur la glace et effectuer des mesures sur des tissus frais dans les 48 heures. Pour commencer les expériences d'indentation AFM-activée, passez à la section 3.

2. Pig cerveau Procédures d'acquisition de tissus (rhéologie)

  1. Obtenir un demi-cerveau de porc sagittale en tranches dans les ~ 1 heure du sacrifice d'un boucher local. Placez la moitié d'un cerveau en CO 2 milieu nutritif -indépendante pour le tissu neural adulte, et de stocker sur la glace.
  2. Utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour faire une épaisse tranche de cerveau coronale ~ 5 mm et stocker du CO 2 milieu nutritif -indépendante pour le tissu neural adulte. Assurez-vous que la surfac tranchee est aussi plat que possible. Utilisez des mouvements latéraux prudentes avec un rasoir / scalpel pendant la coupe.
  3. Magasin tissu cérébral de porc en CO 2 milieu nutritif -indépendante pour le tissu neural adulte sur la glace et effectuer des mesures de rhéométrie (section 5) sur des tissus frais dans les 48 heures.

3. Atomic Force Microscope-enabled indentation

  1. Préparer 60 mm de diamètre Pétri (P60) plats avec une bioadhésive dérivée de moules selon les instructions du fabricant.
    1. Préparer un stock de solution tampon neutre constitué de 0,1 M de bicarbonate de sodium dans de l'eau stérile avec un pH optimal de 8,0. Filtre-stériliser (0,2 micron) le tampon de bicarbonate de sodium et conserver à 4 ° C.
    2. Dans une hotte à flux laminaire, mélanger une solution de NaOH 6,25% bio-adhésive et 3,125% de moule dérivée dans le tampon de bicarbonate de sodium.
    3. Pipette 100 pi de la solution de bio-adhésif 3.1.2 sur une pointe de Pétri (P60) plat et pipette à usage 60 mm de diamètre pour répandre solution dans un cercle de 3-5 cm de diamètre.
    4. Laissez P60 plats découverts dans hotte à flux laminaire et laisser la solution à sec (~ 30 min). Laver la vaisselle 1x avec du PBS et 2x avec de l'eau stérile. Laisser sécher la vaisselle de l'air dans une hotte à flux laminaire et stocker dans un sac en plastique scellé à 4 ° C pendant 1 mois.
  2. Calibrer l'AFM et mise en place échantillon de cerveau dans l'AFM.
    REMARQUE: Suivez les instructions d'étalonnage de l'AFM selon le fabricant.
    1. charger avec précaution une sonde AFM avec une constante de ressort nominal de 0,03 N / m et un diamètre um borosilicate talon 20 dans le support de sonde.
    2. Calibrer la constante de ressort et inverse la sensibilité de levier optique (InvOLS) du cantilever AFM selon la méthode de mise au point thermique 15,16.
      NOTE: Une fois que la constante de ressort pour une sonde AFM est calculée, elle doit rester constante avec une utilisation répétée. Cependant, les InvOLS cantilever devront être recalibré à chaque fois que le laser est réaligné avec le cantilever. En outre, l'étalonnagedoit être effectuée sur un substrat de plusieurs ordres de grandeur plus rigide que la poutre, tel que le polystyrène.
    3. Allumez le chauffe-scène montée et la température réglée à 37 ° C.
    4. Monter la tranche de cerveau sur les plats P60 préparés dans la section 3.1.
      1. Verser délicatement une tranche épaisse de 350 um du cerveau, ainsi que le moyen -indépendante CO 2 dans le ballon à fond rond dans un plat de P60 revêtu du bioadhésif de moules dérivés.
      2. En inclinant légèrement le plat de P60, positionner la tranche de cerveau dans le centre du plat. Si nécessaire, la pipette lentement moyen d'une pipette manuelle à déplier une tranche de cerveau qui a replié sur lui-même ou de mieux positionner la tranche de cerveau dans le centre du plat.
      3. Retirez délicatement les supports en excès en utilisant un pipetteur P1000 (ne pas utiliser le vide).
      4. Placer le couvercle sur le plat de P60 et de laisser la tranche de cerveau adhérer pendant 20 min.
    5. Retirez la tête AFM, placez la tranche de cerveau monté dans le P60plat sur ​​la scène de l' AFM, et ajouter ~ 2 ml pré-réchauffés CO 2 moyennes -indépendante.
    6. Ajouter délicatement une goutte de support sur la sonde AFM pour le protéger de la rupture en raison de la tension superficielle quand il est descendu dans les médias entourant la tranche de cerveau.
    7. Repositionner la tête AFM sur la scène, et de commencer à baisser la tête jusqu'à ce qu'il soit immergé dans le milieu.
    8. Utilisation de la vue de dessus caméra CCD, repositionner le laser sur le cantilever.
      REMARQUE: L'alignement du laser sur la poutre sera légèrement modifiée en raison de la différence d'indice de réfraction de l'air et de support.
    9. Attendez 5 min pour le cantilever pour régler à être immergé dans un liquide chaud, puis réinitialiser l'alignement de miroir à une déviation libre de 0 V.
    10. Exécuter un spectre thermique sur la sonde AFM conformément aux instructions du fabricant 16. Utilisez l'ajustement du premier pic thermique pour recalculer les InvOLS de la sonde AFM dans les médias.
    11. À l'aide du microscope optique,déplacer la platine d'échantillon de telle sorte que la région du cerveau d'intérêt au-dessous de la sonde AFM.
      NOTE: Le corps calleux est sombre car il est plus opaque que la matière grise environnante. Le cortex est supérieure à celle du corps calleux.
    12. Réinitialiser l'alignement de miroir à une déviation libre de 0 V.
    13. Sur la Somme et des fléchissements Meter dans le logiciel de l'AFM, cliquez sur "Engage" pour engager la tête de l'AFM.
    14. Utilisation du sélecteur de position sur la tête AFM, baisser la tête jusqu'à ce que le contact entre le cantilever et l'échantillon est faite.
  3. (Facultatif) Si vous le souhaitez, mesurer le module d' élasticité de l'échantillon, comme décrit précédemment 4,17,18.
  4. Procéder à des expériences de mise en conformité de fluage.
    1. Construire une fonction de la force appliquée dans l'éditeur de fonction du logiciel. La fonction de la force se compose d'une rampe de 0,1 s à un point de 5 nN de jeu et maintenez-le pendant 20 secondes, suivi d'un 1 sec rampe vers le bas à une force appliquée de 0 nN.
      1. Sur le indentation Master Panel, selon la méthode d'indentation, sélectionner "Load" pour le mode pénétrateur; "N" pour les unités; et "éditeur de fonction" pour pénétrateur Fonction.
      2. Dans l'éditeur de fonction, sur le segment Panel Parms, créer un segment de la fonction de la force appliquée qui commence à 0 nN, se termine à 5 nN, avec un temps de 0,1 s. Cliquez sur "Insérer ->".
      3. Pour le segment suivant, réglez commencer à 5 nN, fin à 5 nN, et le temps de 20 sec. Cliquez sur "Insérer ->."
      4. Pour le dernier segment, réglez commencer à 5 nN, fin à 0 nN, et le temps de 1 sec. Cliquez sur "Dessiner" et fermez la fenêtre de l'éditeur de fonction.
    2. Dans l'onglet force du Groupe Master, cochez la case «pénétrateur rampe après déclenchement" et régler la fonction de la force appliquée pour déclencher après avoir atteint un point de 0,1 V. de déclenchement
    3. Cliquez sur "Force unique" sur le fond de l'onglet de travail du Groupe Master, qui va déclencher la fonction de la force appliquée construit pour la conformité au fluage.
    4. Après leseule indentation de force est terminé, relever la tête AFM de sorte qu'il est hors de contact avec l'échantillon, puis ré-engager la tête et remettre à zéro la déviation libre.
    5. Repositionner l'étape de l'échantillon pour localiser une nouvelle zone d'intérêt, et abaisser la tête de l'AFM pour prendre contact. NOTE: La tête de l'AFM doit être retirée de la surface de l'échantillon lorsque l'étape de l'échantillon est déplacé. Le non-respect peut entraîner des dommages à la console de l'AFM délicate.
    6. Répétez les étapes 3.4.3-3.4.5 jusqu'à ce que la quantité désirée de données ont été recueillies.
  5. Mener des expériences de relaxation de la force.
    1. Construire une fonction de retrait appliqué dans l'éditeur de fonction du logiciel. La fonction d'indentation se compose d'une rampe de 0,1 s à un point de 3 um de jeu et le maintenir pendant 20 secondes, suivi d'un 1 sec rampe jusqu'à une profondeur de 0 um d'indentation.
      1. Sur le panneau de Maître indentation, selon la méthode d'indentation, sélectionnez "indentation" pour le mode pénétrateur; "M" pour les unités; et "; Éditeur de fonction "pour pénétrateur Fonction.
      2. Dans l'éditeur de fonction, sur le segment Panel Parms, créer un segment de la fonction de la force appliquée qui commence à 0 pm, se termine à 3 pm, avec un temps de 0,1 s. Cliquez sur "Insérer ->".
      3. Pour le segment suivant, set commencer à 3 pm, fin à 3 pm, et le temps de 20 sec. Cliquez sur "Insérer ->."
      4. Pour le dernier segment, réglez commencer à 3 pm, fin à 0 pm, et le temps de 1 sec. Cliquez sur "Dessiner" et fermez la fenêtre de l'éditeur de fonction.
    2. Dans l'onglet force du Groupe Master, cochez la case «pénétrateur rampe après déclenchement" et régler la fonction de la force appliquée pour déclencher après avoir atteint un point de 0,1 V. de déclenchement
    3. Cliquez sur "Force unique" sur le fond de l'onglet de travail du Groupe Master, qui va déclencher la fonction d'indentation construite appliquée pour la relaxation de la force.
    4. Après l'indentation de force unique est terminé, relever la tête AFM afin qu'il soithors de contact avec l'échantillon, puis réengager la tête et la déviation de remise à zéro.
    5. Repositionner la scène pour localiser une nouvelle zone d'intérêt, et baisser la tête pour prendre contact.
    6. Répétez les étapes 5,3-5,5 jusqu'à ce que la quantité désirée de données ont été recueillies.
  6. Conclure expériences et de nettoyage.
    1. Après avoir conclu des expériences, relever la tête de l'AFM et le retirer de l'échantillon.
    2. Utilisez un tissu de laboratoire pour retirer soigneusement l'excès de liquide sans toucher le cantilever.
    3. Nettoyer soigneusement le support en porte à faux AFM en utilisant une petite quantité d'éthanol. Ne pas exposer les composants électroniques délicats sur le support en porte à faux à l'éthanol. Retirer le cantilever AFM et placer dans un conteneur de stockage.
    4. Jeter l'échantillon de tissu du cerveau en suivant les protocoles de biosécurité appropriées.
  7. MATLAB, calculer compliance au fluage et la force de relaxation en utilisant des modules géométrie de pénétrateur, selon la solution dérivée par Lee et Radok, 1960 19.
    1. Calculer la force F et la profondeur d'indentation figure-protocol-1 à partir des données sur la position en porte - z, déviation d, et constante de ressort, k c

      figure-protocol-2 et figure-protocol-3 .
    2. Localisez le point le long de la courbe d'indentation en utilisant l'algorithme décrit dans Lin et al. 20 de contact.
    3. Définir une fenêtre d'intérêt pour l'analyse des données. La fenêtre d'intérêt est la région où soit la force (pour le respect de fluage) ou la profondeur d'indentation (pour la relaxation de la force) est maintenue à une valeur de consigne (ie, la Région 3 comme le montre la figure 1C, D).
    4. Pour les expériences de mise en conformité de fluage, de calculer le module de fluage expérimental conformité J c (t), en réponse à une charge de l' étapen 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      figure-protocol-4 ,
      où H (t) est la fonction échelon Heavyside et R est le rayon de la sonde sphérique.
    5. Pour les expériences de relaxation de la force, de calculer le module expérimental de relaxation de la force G R (t), en réponse à une profondeur opération d'empreinte figure-protocol-5 :
      figure-protocol-6 .

4. Impact indentation

  1. Calibrer le nanoindenteur instrumenté et régler les paramètres par défaut pour permettre des expériences d'impact dynamique sur les tissus du cerveau hydratés selon les instructions du fabricant.
    1. Monter une sonde sphérique en le faisant glisser sur le pendule en utilisant une pince à épiler.
    2. Coller un échantillon de quartz fondu sur le poteau de l'échantillon, qui est vissée dans la traductionnelleétape.
    3. Allez dans le menu d'étalonnage et sélectionnez "Cell liquide." Suivez les instructions du logiciel pour prendre contact avec l'échantillon de quartz fondu.
    4. Sélectionnez "Normal" pour le type de pénétrateur et utiliser la valeur par défaut de 0,05 mN pour la charge pénétrateur. Cliquez sur «Continuer» pour effectuer l'étalonnage pour la configuration de pénétrateur normale.
    5. Déplacer la scène de l'échantillon de retour d'au moins 5 mm. Monter le bras de levier, ce qui permet à la sonde d'être abaissée dans la cellule liquide, et répéter l'étalonnage de la cellule liquide dans la nouvelle configuration en sélectionnant "Cell Liquid" pour le type de pénétrateur. Cliquez sur «Continuer» pour obtenir le facteur d'étalonnage de cellules liquide.
    6. Activez l'option logicielle cellulaire liquide en allant dans le menu Expérience et en sélectionnant "Options spéciales." Utilisez la dernière valeur d'étalonnage.
    7. Augmentez la distance entre les plaques de condensateur comme cela conduira à une plus grande profondeur maximale mesurable, ce qui est nécessaire lors de l'essai higmatériaux hly conformes.
      1. Dans le menu Système, sélectionnez "Paramètres protégées non" et "Paramètres machine" pour changer la vitesse de test du pendule de charge, le taux de charge nulle, et la rampe d'attente de décalage à 0,5 mN / sec, 0,1 mN / sec, et 3 V, respectivement.
      2. Avec une clé, tournez les trois écrous qui contrôlent l'espacement plaque de condensateur dans le sens horaire par petits incréments.
      3. Après chaque tour dans le sens horaire complet, sélectionnez "Réglage Pont Box" dans le menu de maintenance et d'obtenir un bon test du pendule, ce qui nécessitera de déplacer le poids contre-balance loin de la pendule.
      4. Répétez les étapes 4.1.7.2-4.1.7.3 jusqu'à ce que le calibrage de la profondeur approximative lit une valeur de 70.000 nm / V ou plus.
    8. Positionner une nouvelle butée au fond du pendule qui peut être activé et désactivé via une alimentation électrique. Dégager la butée d'origine assis derrière le pendule pour enlever une obstruction potentielle du mouvement pendulaire et permettre plusdes vitesses d'impact ainsi que des profondeurs de pénétration plus élevés dans les échantillons conformes.
    9. Laissez l'appareil pour atteindre l'équilibre thermique (prend environ 1 heure).
    10. Alors que le cabinet équilibrant, revenir au menu Système et sélectionnez "Paramètres non protégées» et «Paramètres de la machine." Régler la vitesse d'étalonnage (DCAL) de contact de la profondeur de 1 um / sec, la vitesse de contact d'empreinte primaire à 3 um / sec, et la vitesse de contact de charge à très faible à 1 um / s.
    11. Dans le menu d'étalonnage, effectuer un étalonnage de profondeur standard dans cette nouvelle configuration.
    12. Allumez l'alimentation de l'électro-aimant et le mettre à 10 V. Allez dans le menu Expérience et sélectionnez "Impact" et "Ajuster Impulse Déplacement." Suivez les instructions logicielles (invites automatiques) pour calibrer la distance d'oscillation du pendule.
  2. Monter le tissu du cerveau de la souris dans la cellule liquide.
    1. Après la récolte, l'ensemble du cerveau de step 1,5, rangez - le immédiatement CO 2 milieu nutritif -indépendante pour les médias de tissu neural adulte sur la glace.
    2. Lorsque la configuration de l' impact indentation est entièrement terminée, transférer soigneusement le cerveau dans une boîte de Pétri avec le CO 2 moyennes -indépendante. Trancher le cerveau en 6 mm d'épaisseur sections avec des surfaces planes de chaque côté.
    3. Adhérer le tissu en tranches à l'échantillon post-aluminium avec une fine couche de colle cyanoacrylate.
    4. Faites glisser la cellule liquide sur le second joint torique sur l'échantillon après, et remplir la cellule liquide avec 5 ml de CO 2 moyennes -indépendante pour immerger complètement le tissu. Cet échantillon poste est ensuite monté avec soin sur la scène de translation à l'intérieur du nanoindenteur instrumenté.
  3. Mesurer la réponse du tissu cérébral d'impact.
    1. Si nécessaire, retirez la sonde sphérique et le remplacer par la sonde d'intérêt sans enlever le bras de levier.
    2. Dans le menu Système, sélectionnez "non protégéParamètres "et" Paramètres de la machine. "Changer la vitesse de contact d'impact primaire à 5 um / sec.
    3. Avec le bain de l'échantillon bas (direction -z) et loin de la pendule (direction + x), se déplacer dans la direction -x jusqu'à ce que la pointe sur le bras de levier est bien situé au-dessus du bain. Se déplacer dans la direction + z jusqu'à ce que la pointe est complètement immergée dans le bain et en face de l'échantillon.
    4. Utilisation de la fenêtre de commande de l'étage de l'échantillon, prendre contact avec soin et puis de nouveau à l'écart de la surface de l'échantillon d'environ 30 um.
    5. Dans le menu Experiment, cliquez sur "Impact" pour mettre en place une expérience d'impact. Choisissez une charge impulsion spécifique qui se rapportent directement à la vitesse d'impact résultant sur la base du calibrage de la distance de swing. Exécutez l'expérience prévue.
    6. Lorsque le pendule oscille en arrière et la surface de l'échantillon continue à se déplacer vers le plan de mesure, tournez le bouton d'arrêt de limite inférieure off.
    7. Observez que le pendule forward à l'impact de l'échantillon. Le déplacement de la sonde en fonction du temps est enregistrée par le logiciel.
    8. Lorsque la fenêtre de l'étage de xyz apparaît, tournez le bouton d'arrêt de fin de course en marche.
    9. Répétez les étapes 3,4-3,8 pour tester autant de charges et endroits différents selon les besoins.
  4. Analyser le déplacement acquis contre le temps de réponse du pendule en utilisant des scripts MATLAB personnalisés pour déterminer la profondeur maximale de pénétration x max, la capacité de dissipation d'énergie K, et la dissipation facteur de qualité Q. 11
    1. Allez dans le menu d'analyse et d'exporter les données dans un fichier texte.
    2. Prendre la dérivée temporelle du profil de déplacement pour obtenir la vitesse en fonction du temps. Régler le déplacement zéro comme point de contact x o1.
      NOTE: Impact vitesse v en est la vitesse maximale immédiatement avant le contact x max correspond à la déformation à laquelle la sonde.première vitesse diminue jusqu'à zéro. x o2, ce qui est équivalent à x r, est la position requise pour réamorcer contact avec l'échantillon déformé lors du cycle suivant. Vitesse de rebond v out est la vitesse au déplacement x r.
    3. Définir K (sans unité) que l'énergie dissipée par l'échantillon normalisé par la somme des énergies d'échantillons récupérés et dissipée pendant le premier cycle d'impact. Calcul de K basée sur les propriétés intrinsèques du balancier 21 (telles que la rigidité et le coefficient d' amortissement de rotation), x o1, x max, x r, v in et v out.
      NOTE: Pour plus d' informations, on peut consulter le travail de Kalcioglu et al . , 2011.
    4. Depuis le déplacement peut être décrit comme un mouvement oscillatoire harmonique amorti, adapter une fonction de décroissance exponentielle des maxima des displacement par rapport à la courbe de temps.
    5. Calculer Q (sans unité) comme π multiplié par le nombre de cycles requis pour l'amplitude d'oscillation de diminuer par un facteur de e. Une valeur Q plus élevée signifie un taux de dissipation d'énergie.

5. rhéologie

  1. Mise en place et calibrer le rhéomètre selon les instructions du fabricant.
    1. Initialisation du rhéomètre en ouvrant le panneau périphérique / contrôle. Sous l'onglet du panneau de commande, cliquez sur "initialiser."
    2. Monter la plaque de 25 mm de diamètre mesure (PP25) et le système thermique.
    3. (Facultatif) Pour réduire le glissement entre les plaques de rhéomètre et le tissu, découper des tranches de papier de verre adhésif qui correspondent à la forme de la plaque de rhéomètre haut et adhèrent le papier de verre à la plaque supérieure et inférieure.
    4. Prenez contact entre la plaque supérieure et inférieure en cliquant sur "set écart zéro" sur le panneau de commande.
    5. Zéro, le capteur de force normale par clicking "reset force normale."
    6. Effectuer un test d'inertie en ouvrant l'onglet de service sur le panneau de commande, en cliquant sur "système de mesure», et puis en cliquant sur "test d'inertie". Enregistrez l'ancien et le nouveau inertie. Vérifiez que l'inertie est dans la limite admissible pour la sonde, comme indiqué par le fabricant.
  2. échantillon de charge en rhéomètre.
    1. Après la récolte , le tissu et couper un segment coronale du cerveau de porc à l' épaisseur ~ 5 mm, le stocker sur la glace en CO 2 moyennes -indépendante.
    2. Placer le cerveau entre les deux plaques. Enlever les grosses gouttelettes d'eau de la surface supérieure et inférieure de l'échantillon pour empêcher le glissement, mais ne sèchent pas l'échantillon.
    3. Abaissez lentement la plaque de mesure jusqu'à ce que la plaque est en contact avec la surface supérieure du tissu et de la force normale mesurée est conforme à 0,01 mN après une période de relaxation 5-10 min.
      1. Dans le panneau de commande, entrez hauteurs successivement inférieurs in la boîte et de la position de mesure cliquez sur "position de mesure» pour abaisser lentement la plaque de mesure.
      2. Lors de l'intérieur d'un millimètre de contact avec le tissu, abaisser la plaque de mesure par incréments de 0,1 mm jusqu'à ce que la plaque est totalement en contact avec la surface supérieure du tissu. Veiller à ce que la force mesurée à la normale est constante à 0,01 mN après une période de relaxation 5-10 min.
      3. Enregistrer la force normale mesurée initiale. Des mesures répétées doivent être prises à la même compression contraintes / souches.
    4. Découper l'échantillon avec une lame de plastique, si l'échantillon est supérieur au diamètre de la plaque. Pipeter un faible volume (~ 1-2 ml) de support sur les bords de l'échantillon pour hydrater le tissu.
    5. (Facultatif) Abaisser le capot thermique. Sur le panneau de commande, régler la température à 37 ° C, puis cliquez sur "set".
  3. Effectuez un balayage d' amplitude pour établir la plage viscoélastique linéaire du matériau ( à savoir le cisaillementsouches à laquelle G 'et G' 'sont constants) à des fréquences d'intérêt (par exemple, 1 rad / s).
    1. Sélectionnez "Fichier / Nouveau". Sous l'onglet gel sélectionnez «balayage Amplitude: LVE-gamme." Sélectionnez la fenêtre et cliquez sur "Mesure 1: balayage Amplitude." Double-cliquez sur la case d'oscillation. Entrez la souche initiale et finale (par exemple, de 0,01 à 105), la fréquence (par exemple, 1 rad / s) et le nombre de points par décennie (par exemple, 6 points / dec). Sélectionnez "ok" et cliquez sur Démarrer. "
    2. Répétez cette procédure pour plusieurs tranches avec des essais répétés pour assurer la cohérence de la gamme élastique linéaire. La compression axiale de l'échantillon doit rester constante entre les échantillons.
  4. Effectuer un balayage de fréquence du tissu à une déformation dans la plage viscoélastique linéaire du tissu (par exemple, une déformation de 1%) 22, et à une gamme de fréquences d'intérêt (par exemple, 0,1-100 rad / s).
    1. Cliquez "Fichier / nouveau" et sous l'onglet gel sélectionnez «balayage de fréquence." Cliquez sur la fenêtre / Mesure 1: balayage de fréquence. Double-cliquez sur la case d'oscillation. Saisissez la plage de fréquence (par exemple, 0,1 à 100 rad / s), la souche (par exemple, une déformation de 1%) et le nombre de points par décennie (par exemple, 6 points / dec). Sélectionnez "ok" et cliquez sur "Démarrer" pour lancer le balayage de fréquence.
  5. sweep Repeat de fréquence (étape 5.4) en double ou triple.
  6. Passez en revue les données qui sont automatiquement calculés et exportés par le rhéomètre: G 'et G "en fonction de la fréquence (fréquence de balayage) ou la déformation de cisaillement (balayage amplitude) NOTE:. G' et G '' sont calculés à partir de l'échantillon ( s maximum ) réactionnelle amplitude du couple T 0, et l' angle de déplacement en rotation (ou de l' angle de déviation) figure-protocol-7 Et le retard de phaseEquation 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, de la réponse de l'échantillon à la souche oscillatoire appliquée (Figure 3):
    figure-protocol-8
    figure-protocol-9
    dans laquelle R et h étant le rayon et la hauteur de l'échantillon.

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Résultats

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La figure 4 montre l' indentation et représentant la force en fonction des temps de réponse (figure 4B, E) pour la compliance de fluage et de relaxation des expériences de force, compte tenu de la force appliquée ou la profondeur de pénétration (figure 4A, D), respectivement. À partir de ces données et de la géométrie du système, la compliance de fluage J c (t) et la force de relaxation modules G R...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chaque technique présentée dans cet article mesure les différentes facettes de propriétés mécaniques des tissus cérébraux. respect Creep et la relaxation des contraintes des modules sont une mesure de propriétés mécaniques en fonction du temps. Le stockage et la perte des modules représentent des propriétés mécaniques taux dépendant. L'impact indentation mesure également les propriétés mécaniques dépendant du débit, mais dans le contexte de la dissipation d'énergie. Lorsque la caractérisation des propriétés méca...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous reconnaissons le soutien de ce travail par la National Multiple Sclerosis Society et le Simons Center for the Social Brain. BQ reconnaît le soutien du programme de bourses d’études supérieures en sciences et ingénierie de la défense nationale des États-Unis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
XylazineLloyd Laboratoriedmédicament d’ordonnance
KétamineAnaSed Injectionsmédicament d’ordonnance
Vibratome (Microtome à lame vibrante)LeicaVT1200
Hibernate-A MediumGibcoA1247501CO2-indépendant pour tissu adulte
Microscope à force atomique, MFP-3D-BIOAsylumResearch-Chauffage
boîte de PetriAsylumResearch-Sonde
AFM, 0,03 N/m, 10  ; et micro ; sphère borosilicate de rayon mNovascanPT. GS
Cell-TakCorning354240bioadhésif dérivé de moules
Bicarbonate de sodiumSigma-AldrichS5761d’autres fournisseurs peuvent être utilisés
Hydroxyde de sodium, 1 NSigma-Aldrich59223Cd’autres fournisseurs peuvent être utilisés
Indenteur instrumenté, NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-La pointe de la sonde doit être usinée (poinçon plat en acier, 1  ; mm de diamètre, 4-5  ; NanoTest
Liquid CellMicro Materials Ltd.-
Rhéomètre à plaques parallèles MCR501Anton-Parr-PP25
  ;Anton-Parr-25mm de diamètre plaque de mesure plate
Papier de verre adhésifMcMaster-Carr4184A48d’autres fournisseurs peuvent être utilisés
Loctite 4013 Adhésif instantanéHenkel20268d’autres fournisseurs peuvent être utilisés
de

Références

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Mots-clés

Brain Tissue CharacterizationAtomic Force MicroscopyImpact IndentationRheometryViscoelastic PropertiesMechanical CharacterizationCreep ComplianceForce RelaxationFrequency SweepHydrated Tissue

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