Complexe de polyélectrolyte pour Heparin Binding Domain Growth Factor ostéogénique Livraison

Résumé

Des complexes polyélectrolytiques (PEC) auto-assemblés fabriqués à partir d’héparine et de protamine ont été déposés sur des billes d’alginate pour piéger et réguler la libération de facteurs de croissance ostéogéniques. Cette stratégie d’administration permet de réduire de 20 fois la dose de BMP-2 dans les applications de fusion vertébrale. Cet article illustre les avantages et la fabrication des CEE.

Résumé

Pendant les chirurgies reconstructives osseuses, des quantités supraphysiologiques de facteurs de croissance sont empiriquement chargés sur des échafaudages pour promouvoir avec succès la fusion osseuse. De fortes doses d'agents biologiques très puissants sont nécessaires en raison de l'instabilité facteur de croissance par suite de la dégradation enzymatique rapide, ainsi que l'inefficacité de support en localisant des quantités suffisantes de facteur de croissance sur les sites d'implantation. Par conséquent, les stratégies qui prolongent la stabilité des facteurs de croissance tels que le BMP-2 / NELL-1, et de contrôler leur libération pourrait effectivement réduire leur dose efficace et de réduire ainsi le besoin de doses plus importantes lors de futures opérations de la régénération osseuse. Cela permettra de réduire les effets secondaires et les coûts des facteurs de croissance. PECs auto-assemblées ont été fabriqués pour fournir un meilleur contrôle de la BMP-2 / NELL-1 livraison par liaison à l' héparine et autre facteur bioactivité de croissance de potentialisent en améliorant la stabilité in vivo. Ici, nous illustrons la simplicité de fabrication PEC qui facilite la delivery d'une variété de facteurs de croissance des os lors d'interventions chirurgicales de reconstruction.

Introduction

L'incidence de la pseudarthrose a été rapporté comme étant aussi élevé que 10 à 45% en fusion spinale dégénérative et de révision des chirurgies de la colonne vertébrale ^1. Pour réduire le taux de pseudarthrose lors de la colonne vertébrale fusion et d' autres chirurgies reconstructives osseuses, des facteurs de croissance ostéogéniques tels que BMP-2, Nell-1 ¹ et facteur de croissance plaquettaire (PDGF) ont été introduites pour promouvoir de novo ostéogenèse. Parmi ceux - ci, la BMP-2 est un choix populaire pour la fusion vertébrale ^2. Bien que l'activité de BMP-2 pour induire et faciliter la formation d'os a été bien établi ^3; complications cliniquement significatives telles que la formation osseuse hétérotopique, sérome et formation d' un hématome, la réponse inflammatoire, radiculite, vertébral ostéolyse du corps, et l' éjaculation rétrograde continuent d'être sujets de préoccupation en raison des quantités utilisées supraphysiologiques ^4,5.

Par conséquent, en abaissant la dose de BMP-2 reste une stratégie pertinente àtente de réduire au minimum les effets secondaires. Par ailleurs, les systèmes de support efficaces sont nécessaires pour supprimer la libération de rafale initiale de la BMP-2 observée dans des systèmes de support de l'éponge de collagène contemporaine et en outre améliorer l'administration prolongée et localisée de cette cytokine puissante. L'auto-assemblage couche par couche d' une alternance de polyélectrolytes cationiques et anioniques peuvent être utilisés en tant que méthode accordable pour construire des complexes de polyélectrolytes sur la surface des matrices d'échafaudage ou de matériaux implantables ^6. A cet égard, l'héparine (connu pour avoir la plus forte densité de charge négative de tous les agents biologiques) a été reconnue pour lier avidement avec une variété de facteurs de croissance par l'intermédiaire des domaines de liaison électrostatique et l'héparine. En effet, l'héparine a été démontré que pour prolonger la demi-vie et donc de potentialiser l'activité biologique de plusieurs facteurs de croissance.

Sur cette base, notre groupe a adapté un protocole couche par couche auto-assemblage pour fabriquer un complexe polyélectrolyte à base d'héparine (PEC) qui les charges et conserve les activités biologiques de facteurs de croissance ostéogéniques lors de l' immobilisation ^7,8. Le noyau de microbilles d'alginate a été fabriqué par réticulation d'α-L-guluronate (G) des résidus d'alginate avec des ions calcium en cations divalents ou de strontium. Le noyau d'alginate est une matrice d'échafaudage biodégradable; qui, après l'implantation, il est résorbé dans le lit de fusion fournissant la place pour l'interposition osseuse. Poly-L-lysine (PLL) ou la protamine est utilisée comme couche cationique entrelacer à la fois avec la matrice d'échafaudage (dans ce cas, le noyau alginate de support de microbilles) et l'héparine chargée négativement; tandis que les fonctions anioniques de la couche d'héparine pour stabiliser et localiser les facteurs de croissance chargés. La triple couche PEC a été montré pour augmenter la capacité de chargement du facteur de croissance dans un modèle porcin ^9. Récemment, les transporteurs PEC ont été montré pour réduire avec succès la dose efficace de BMP-2 d'au moins 20 fois chez le rat ¹⁰ et modèles porcins de fusion rachidienne ^8.

ntent "> Ici, nous rapportons les méthodes de fabrication d'PECs pour une meilleure prestation de facteur de croissance dans la fusion spinale et les autres chirurgies reconstructives osseuses en utilisant BMP-2 en tant que facteur modèle de croissance ostéogénique.

Protocole

1. Préparation de la solution d'alginate

1. Dissoudre 200 mg d'alginate de sodium (non irradié) ou 400 mg de 8 Mrad irradié alginate de sodium dans 10 ml d'eau bidistillée et agiter pendant 1 h pour alginate non irradiée et 15 min pour l'alginate irradié. Stocker la solution d'alginate à 4 ° C pendant une nuit. Filtrer la solution d'alginate avec un filtre à seringue de 0,2 um stérile avant d'alginate microbille fabrication.

2. Alginate Microbead Fabrication

1. Désinfecter le générateur de perles électrostatique et pompe à seringue avec 70% d' éthanol et de les placer dans une classe II Cabinet de sécurité biologique (Figure 1).
2. Placez un bassin de verre avec une barre d'agitation magnétique à l'intérieur du générateur de perles.
3. Fixer l'électrode de bras du générateur de talon de 9 cm au-dessus du bassin.
4. Branchez le câble d'électrode du générateur de bourrelet à la vis moletée 2 de l'électrode de bras, et versez 80 ml ​​de _SrCl2 solution dans lebassin.
5. Charge 5 ml de 0,2 um solution d'alginate filtré dans le tube de la seringue et du caoutchouc. Après avoir branché le tube de caoutchouc à l'électrode de bras, activer la pompe seringue à 5 ml / h pendant 2 minutes pour expulser l'air à l'intérieur du tube et de fournir la solution d'alginate à la pointe de la buse. Eteignez la pompe seringue.
6. Ensuite, allumer le encapsulateur puis, la pompe à seringue pour commencer la génération microbille. Réglez le débit alginate à 5 ml / h et la tension à 5,8 kV sur le encapsulateur. Jeter les microbilles générés pendant les deux premières minutes (ou la solution d'alginate initiale 0,5 ml pompé hors de la seringue), ces microbilles ont tendance à être irrégulière galbée et dimensionnée.
7. Collecter des microbilles ultérieures dans une solution de chlorure de 0,2 M de strontium. Eteignez à la fois la pompe à seringue et l'encapsulateur (dans cet ordre) après le pompage du volume pré-planifiée de la solution d'alginate. Répétez cette opération pour les lots suivants de microbille fabrication. À la fin, tourner def la pompe à seringue en premier, suivie par l'encapsulateur.
8. Stocker les microbilles dans 20 ml d'une solution de chlorure de strontium 0,2 M à 4 ° C pendant une nuit pour achever la réticulation et la stabilisation du gel.

3. Mesure de la taille des microbilles alginate

1. Recueillir 0,5 ml de microbilles alginate avec une pipette en plastique et le placer sur une lame de verre. Voir les microbilles sous un microscope optique à un grossissement de 10X. Prenez dix images des microbilles avec une caméra microscope CCD. Enregistrer les images avec barre d'échelle (500 um) en format TIFF avec une résolution 2048 x 1536.
2. En utilisant les outils de longueur dans ImageJ, mesurer la taille des microbilles et barre d'échelle (figure 2). Convertir la longueur des microbilles de pixel au micromètre.
   1. Cliquez sur les outils en ligne et tracer une ligne à travers le milieu de la bille d'alginate.
   2. Cliquez sur "Analyser" dans la barre de menu et sélectionnez "Mesure". Une fenêtre pop-up apparaîtra.
   4. Convertir le diamètre du cordon d'alginate à la longueur réelle en utilisant la formule: longueur du cordon d'alginate / longueur de la barre d'échelle x 500 um. Par exemple, 1.420 (diamètre mesuré par ImageJ) / 2.657 (échelle de longueur de la barre mesurée par ImageJ) * 500 um = 267 um.
3. Pensez à la taille moyenne de 100 microbilles (moyenne ± écart-type) que la taille représentative de chaque lot de microbilles.

4. Stérilisation

1. Collecter les microbilles en utilisant un nylon crépine 100 um et laver les billes avec de l'eau distillée deux fois.
2. Avec une spatule, transférer tous les microbilles fabriqués à partir de 0,1 ml de solution d'alginate dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml et couvrir avec de la gaze pour éviter le dessèchement.
3. Enfin, les stériliser par autoclavage microbilles en utilisant le mode de liquide (115 ° C, 15 min) ou en conformité avec mles spécifications abricant. Ajouter 1,5 L d'eau distillée à la chambre pour empêcher les perles de séchage.

5. protamine et Heparin Coating

1. A l'intérieur du BSL-2 capot, incuber les microbilles stériles avec 1 ml de 2 mg / ml de solution de protamine (stérilisé en utilisant un filtre à seringue de 0,2 pm) pendant 1 heure à température ambiante.
2. Après incubation des microbilles pendant 1 heure (étape 5.1), de recueillir 150 ul de la solution de protamine pour l'acide bicinchoninique (microBCA) Test micro (article 6).
3. Laver les protamines enduit microbilles deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Isoler l'aide d'une centrifugeuse de banc à 200 xg pendant 3 min à température ambiante. Après centrifugation, aspirer l'eau à l'aide d'une seringue.
4. Incuber protamine microbilles revêtues avec 1 ml de 0,5 mg / ml de solution d'héparine (stérilisé en utilisant un filtre à seringue de 0,2 um) pendant 30 min pour créer complexe polyélectrolyte (PEC).
5. Après incubation de la protamine revêtue microbilles fou 30 min (étape 5.4), recueille 400 ul de la solution d'héparine pour déterminer la teneur en héparine (section 7).
6. Après incubation, laver l'héparine non lié de CBV par deux lavages avec de l'eau distillée deux fois.

6. protamine Content

1. Effectuer le test microBCA selon les instructions du fabricant. En bref, ajouter 150 solution de protamine ul (recueillies avant et après incubation avec des microbilles) dans une plaque de 96 puits. Ajouter 150 pi de solution de travail microBCA.
2. Utiliser une solution d'albumine (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 et 200 pg / ml) comme étalons.
3. Laisser incuber le mélange pendant 60 min à 60 ° C. Mesurer l'absorbance avec un spectrophotomètre à 562 nm.
4. Utiliser la courbe d'étalonnage pour déterminer la concentration de protamine de chaque échantillon inconnu selon les instructions du fabricant.
5. Déterminer la teneur en protamine des microbilles en soustrayant la quantité totale de protamine dans leSolution de revêtement (avant l'incubation avec des microperles) à partir de la quantité de protamine restant dans la solution de revêtement (après incubation avec des microperles).

7. Héparine Content

1. Préparer les 10 ml de la solution de travail en dissolvant 4 mg de bleu de toluidine et de 20 chlorure de sodium 0,01 mg dans de l'acide chlorhydrique.
2. Ajouter 400 ul d'échantillon (étape 5.5) à la solution de travail à un rapport de 2: 3 et vortexer pendant 30 secondes.
3. Ajouter 600 ul de n-hexane (volume équivalent à la solution de réactif de travail) et vortexer le mélange pour extraire le complexe d'héparine bleu de toluidine.
4. Aspirer 200 ul de la phase aqueuse par la seringue après séparation des phases.
5. Mesurer la quantité de non-extrait bleu de toluidine contenu dans la phase aqueuse à l'aide d'un spectrophotomètre à 631 nm.
6. Préparer des solutions étalons d'héparine de 0 à 20 pg / ml.
7. Tracer la lecture 631 nm de chaque norme par rapport à la concentration d'héparine de l'héparine en ug / ml. Utiliser la courbe d'étalonnage pour déterminer la concentration d'héparine de chaque échantillon.

8. confocale Image de la structure de couche par couche

1. Fabriquez protamine, l'héparine et NELL-1 / BMP-2 analogue fluorescent CF-405 protamine (bleu), CF 594 héparine (rouge) et FITC étiqueté NELL-1 / FITC marqué (vert) BMP-2 + héparine + protamine selon fabricant fiche technique.
2. Coat 100 ug microbilles avec 300 pi de analogue fluorescent (de procédé de revêtement tel que décrit dans 05/03 au 05/06) CF-405 protamine (bleu) (2 mg / ml, 1 h d'incubation), CF 594 héparine (rouge) (0,5 mg / ml, 30 min) et marqué au FITC NELL-1 / marqué au FITC (vert) BMP-2 (1,5 mg / ml, pendant la nuit). Laver les microbilles deux fois avec de l'eau distillée pour éliminer le non lié fluorescent protamine, l'héparine et NELL-1 / BMP-2.
3. Observer la structure couche par couche (figure 3) à l'aide d' un microscope confocal à un grossissement 10X. ⁷

9. BMP-2et NELL-1 Uptake and Release

1. Charge 13,3 pi de 1,5 mg / ml de BMP-2 ou NELL-1 sur une solution de 100 ug de PEC. Incuber PEC à 4 ° C de moins de 30 rpm tremblantes pendant 10 heures.
2. Immerger les microbilles dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C avec agitation constante (30 tpm).
3. Prélever 1 ml du surnageant et de la remplacer par 1 ml de PBS après 1, 3, 6, 10 et 14 jours.
4. Évaluer l'efficacité de l'absorption et la libération de la BMP-2 en utilisant la méthode ELISA selon le protocole du fabricant. Évaluer l'absorption et la libération de l'efficacité NELL-1 en utilisant le carboxybenzoyle quinoléine-2-carboxaldéhyde (CBQCA) Méthode de dosage des protéines selon le protocole du fabricant.
5. Déterminer la libération cumulative au temps (t):
   libération cumulative au temps (t) = sortie au temps (t) + Communiqué précédent à l'instant (t-1).
6. Tracer la libération cumulative de BMP-2 et NELL-1 contre le temps.

10. La bioactivité in vitrode NELL-1

Remarque: La bioactivité de NELL-1 libéré du PEC a été évaluée en mesurant sa capacité à augmenter l'expression de la phosphatase alcaline (ALP) dans les cellules souches de la moelle osseuse (lapin rBMSC).

1. Seed 20.000 rBMSCs par puits dans une plaque de 24 puits et leur permettre de se développer pendant une journée avec 1 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Au bout de 24 heures, remplacer le milieu par 1 ml d'un milieu ostéogénique (DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2% de pénicilline streptomycine, 50 pg / ml d' acide ascorbique, 10 mmol / l de bêta-glycérophosphate et de 10 ^-8 mol / L dexaméthasone ) pendant 7 jours à 37 ° C et 5% de CO _2.
3. Placer 300 ug PEC-NELL-1 (de l'étape 8.2) et PEC à l'intérieur des inserts de culture cellulaire (TC insert) pour garder les PECs séparés des cellules (ce qui évite le lessivage de microbilles PEC pendant le changement de milieu ostéogénique). Lieu TC insérer dans le 24 et plmangé pendant 14 jours.
4. Une fois tous les trois jours, aspirée 1 ml du milieu ostéogénique en plaçant une aiguille en dehors de l'insert de TC, et remplacer par 1 ml de milieu ostéogénique frais.
5. Après 7 et 14 jours d'incubation, de déterminer l'activité ALP avec un kit de dosage de l'ALP en conformité avec le protocole du fabricant du kit.
   1. lyser les cellules avec du tampon d'essai contenant 0,1% de Triton X-100 à 4 ° C pendant 10 min. Grattez les cellules adhérentes à l'aide d'un grattoir cellulaire. Incuber la suspension de cellules à 4 ° C sous agitation pendant au moins 60 min.
   2. Centrifuger la suspension cellulaire à 2500 g à 4 ° C pendant 10 min. Recueillir le surnageant pour le dosage de l'ALP.
   3. Ajouter 50 ul d'une solution alcaline diluée en série de la phosphatase norme 200-0 ng / ml dans les puits d'une plaque à 96 puits. Les montants définitifs de la norme de la phosphatase alcaline sont 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15, et 0 ng / puits.
   4. Ajouter le surnageant de l'étape 10.5.2 (50 pl / puits) et diluer avec de dilution buffer.
   5. Ajouter 50 pi de solution phosphate (pNPP) de substrat p - nitrophényle dans chaque puits. Mélanger les réactifs en agitant doucement la plaque pendant 30 secondes. Laisser incuber le mélange pendant 30 minutes dans l'obscurité. Mesurer l'absorbance à 405 nm par un lecteur de plaque.
   6. Calculer l'activité ALP en utilisant la courbe d'étalonnage.
6. Déterminer la teneur en protéines en utilisant le kit de dosage de protéine microBCA selon les instructions du fabricant. Normaliser l'activité de l'ALP en divisant l'activité d'ALP par la teneur en protéines.

11. Viabilité cellulaire

1. Incuber 200 mg de PEC-NELL-1 avec 1 ml de DMEM + 10% de FBS à 37 ° C pendant 24 h pour la 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) essai.
2. Seed 2000 rBMSCs par puits (dans 100 ul de DMEM avec 10% de FBS) dans une plaque de 96 puits et incuber pendant 1 jour à 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Remplacer DMEM + 10% de FBS avec 100 pi d'extrait PEC-NELL-1 / PEC et incuberà 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Après 1 jour à 3 jours d'incubation, ajouter 10 ul de 5 mg / ml de solution de MTT et on incube encore à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 4 heures dans l' obscurité.
5. Ajouter 100 ul solution de DMSO dans chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan.
6. Déterminer l'absorbance à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
7. Calculer le taux de croissance relative:
   

12. Emballage en Échafaudages et BMP-2 & NELL-1 Loading

1. Emballer les CBV dans les pores d'une polycaprolactone de grade médical biorésorbable - phosphate de tri-calcium (TCP MPCL) échafaudage à l'aide d'une spatule stérile à l'intérieur d'une chambre BSL-2.
2. Ajouter 1,5 mg / ml de solution de BMP-2 ou NELL-1 sur l'échafaud MPCL-TCP emballé avec PEC et incuber une nuit à 4 ° C.

Résultats

Dans notre transporteur, protamine a été choisi comme un substitut de poly-L-lysine comme il a des propriétés chimiques similaires et il est approuvé par la FDA comme un antidote de l'héparine. résultats au microscope optique montre que les microbilles non irradiés ont une forme sphérique avec un diamètre de 267 ± 14 um. (0,35 mm buse, débit de 5 ml / h et 5,8 kV). La majorité des microbilles irradiés sont de forme de larme. Le diamètre mesuré sur la partie ronde des microbilles irradiée...

Discussion

Ce protocole présente un procédé pour la préparation de CBV à travers la couche par couche auto-assemblage. La structure couche par couche est visualisée en utilisant des analogues fluorescents de protamine, l'héparine, la BMP-2 et NELL-1 et microscopie confocale. Captage et libérer les tests montrent que l'héparine sur le PEC médie l'absorption du facteur de croissance ostéogénique et la libération. L'efficacité de l'absorption de la méthode PEC est: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Le suppo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acrodisque des sciences de la vie 25  ; mm Filtre seringue avec 0,2  ; et micro ; m Supor Membrane	PALL  ;	PN4612	Protamine stérile, solution d’héparine par ultrafiltration
Plaque à 24 puits	Cell Star  ;	662160
96 plaque de puits Nuclon Delta Surface	Thermo Fisher Scientific	167008
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphényltétrazolium Bromure), MTT	Sigma Aldrich	M5655	Mesurer la cytotoxicité de PEC-NELL-1
Acétone	Fisher Scientific	A/0600/17	Précipité CF-405 Protamine marquée
Alamar Blue	Invitrogen, Life Technologies	DAL 1025	PEC-BMP-2
(ALP)	Anaspec	AS-72146
Chlorure d’ammonium	Merck	Art 1145	Réactif d’arrêt dans le marquage FITC Diméthyl
Sulfoxyde anhydre (DMSO)	Invitrogen, Life Technologies	D12345	Solvant pour isothiocyanate fluorescent I
Diméthyl Sulfoxyde ( DMSO)	Sigma Aldrich		Dissolve  ; formazan  ;
Autoclave	Hirayama	HU-110	Stériliser les billes d’alginate à la vapeur
Bêta-glycérophosphate	Sigma Aldrich	G9422
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit)  ;	Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, États-Unis	7510800	Facteur de croissance ostéogénique, la dialyse est nécessaire pour éliminer le composant stabilisant qui interfère avec le couplage FITC
Carboxybenzoyl quinoléine-2-Carboxaldéhyde (CBQCA)  ;	Thermo Fisher Scientific	A-6222	Pour quantifier la protéine NELL-1
Cell Strainer (100  ; et micro ; m)	BD Science	352360	Hold PEC pour le dosage ALP
Cell Scraper 290  ; mm largeur de lame 20  ; mm	SPL Life Science	90030	Détachez la cellule de la plaque à 24 puits
CF 405S, Succinimidyl Ester	Sigma Aldrich	SCJ4600013	Colorant fluorescent bleu pour le marquage de la protamine
CF 594, Hydrazide	Sigma Aldrich	SCJ4600031	Colorant fluorescent rouge foncé pour le marquage à l’héparine
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Microscope confocal	Olympe  ;	FV1000
Dexaméthasone	Sigma Aldrich	D4902	Composant du milieu de croissance ostéogénique
Colonnes de dessalage Dextran	Pierce (Thermo Scientific)  ;	43230
DMEM	Gibco  ;	12320
BMP-2 Quantikine ELISA Kit	R& D System	DBP200	Déterminer la libération de BMP-2
Sérum de veau fœtal FBS	Hyclone	SV30160.03
Fluoescéine Isothiocyananate, Isomère I	Sigma Aldrich	F7250	Colorant fluorescent vert pour l’étiquetage NELL-1 et BMP-2 Inserts
culture cellulaire ThinCert, Pour plaques à 24 puits, Greiner stérile	;	662630	Empêche le lavage de la CEE lors du changement de milieu ostéogénique
Pousse-seringue Havard Appartus (11 plus)	Appareil Havard	70-2208
n-Hexane (>99 %)	Sigma Aldrich	139386
Héparine	Sigma Aldrich	H3149	Se lie au facteur de croissance ostéogénique avec le domaine de liaison à l’héparine
Acide chlorhydrique (37 %)	Merck	100317	Liant d’incubateur hautement corrosif
		C8150
Kit de dosage des protéines MicroBCA	Thermoscientific	23235
Lecteur de microplaques	Tecan	Infinite M200	Pour les dosages ALP et microBCA
Encapsulateur de cellules Nisco Nisco	Engineering Inc	Unité d’encapsulation VAR V1
Microscope fluorescent	Olympus	Échafaudage IX71
mPCL-TCP (la taille des pores est de 1,3 mm)	Osteopore	PCL-TCP 0/90	Hold PEC pour in vivo étude
Pénicilline-Streptomycine 10 000 unités/ml, 100  ; ml	Hyclone Culture Cellulaire	SV30010	Antibiotique
10x Saline Tamponnée au Phosphate (PBS)	Vivantis	PB0344-1L	10x Solution,
Poly-L-Lysine Ultra Pure Grade MW 15,000-30,000	Sigma Aldrich	P2568
Polycation Sulfate de Sulfate de Protamine, de Salmon	Sigma Aldrich	P4020	Polycation
Shaker	Labnet	S2025
Tube de dialyse en peau de serpent 3 500 MWCO 22  ; mm x 35 pieds	Thermo Fisher Scientific	68035	Éliminer le FITC n’ayant pas réagi par dialyse
Chlorure de sodium	Merck	1.06404.1000
Hydroxyde de sodium	Qrec	S5158
Bicarbonate de sodium	US Biological	S4000	Tampon
Carbonate de sodium	Sigma Aldrich	S7795-500G	Chlorure
strontium Hexahydrate	Sigma Aldrich 255521		Réticulant pour alginate
Spatule	3dia
Seringue 5 ml	Terumo	140425R	Le diamètre de la seringue affecte le débit
75 cm2 Fiole de culture cellulaire à col incliné	Corning	730720
Bleu toluidine	Sigma Aldrich	52040	Dosage de
Trypsine 1x	Hyclone Culture	cellulaire SH30042.01
Alginate de sodium	Novamatrix (biopolymère FMC, Princeton, NJ)	Pronova UPMVG	Matériau de base des microbilles