Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

Résumé

Nous décrivons ici des procédés pour la dissection de tissus foetaux et maternels à partir de placenta humain à terme, suivie par l'isolement et l'expansion des cellules souches / cellules stromales (MSC) à partir de ces tissus.

Résumé

Les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) sont des candidates prometteuses pour une utilisation dans les thérapies cellulaires. Dans la plupart des cas, la réponse thérapeutique semble dépendre de la dose cellulaire. Le placenta humain est riche en CSM et est un tissu physiquement grand qui est généralement jeté après la naissance. Le placenta est un matériau de départ idéal pour la fabrication à grande échelle de doses cellulaires multiples de CSM allogéniques. Le placenta est un organe fœtomaternel à partir duquel les tissus fœtaux ou maternels peuvent être isolés. Cet article décrit l’anatomie placentaire et la procédure pour disséquer le tissu décidua (maternel), les villosités choriales (fœtales) et la plaque choriale (fœtale). Le protocole décrit ensuite comment isoler les CSM de chaque région tissulaire disséquée et fournit une analyse représentative des CSM élargies dérivées des types de tissus respectifs. Ces méthodes sont destinées à l’isolement préclinique des CSM, mais ont également été adaptées à la fabrication clinique de CSM placentaires à des fins thérapeutiques humaines.

Introduction

Cellules stromales souches / mésenchymateuses (MSC) sont en train de devenir un candidat prometteur pour une utilisation dans les thérapies à base de cellules ^1. La plupart des applications semblent viser la réparation des tissus MSC médiée ou la régulation immunitaire ^2. Dans beaucoup de ces applications, allogénique MSC peut être aussi efficace que MSC autologues ^3. L'utilisation de MSC allogéniques a l'avantage économique d'être compatible avec la fabrication à grande échelle de doses multiples de cellules à partir d' un seul tissu source ⁴ pour traiter de nombreux patients.

Historiquement, les études pré-cliniques et cliniques ont utilisé MSC dérivées de la moelle osseuse ^4. La moelle osseuse est généralement collectées à partir de la crête iliaque d'un donneur volontaire. Ce processus est invasif, et seulement un petit volume de moelle (~ 20 ml) sont recueillies au moyen d'une seule piqûre. Générer des nombres cliniquement significatives de MSC nécessite une dans l' expansion in vitro. Cellule puissance diminue avec le nombre de passage ^{3, ce qui crée un paradoxe , où le nombre théorique des cellules nécessaires pour une efficacité clinique augmente plus la population de cellules est agrandi. Contrairement à aspirats de moelle osseuse, placenta à terme est un physiquement grand tissu de départ (typiquement 500-750 g 4), qui peut être récolté aseptique pendant la césarienne sans risque pour le donneur. MSC dérivé de placenta ont prolifération 5 et immunomodulateur capacité à long terme 6, supérieure à MSC dérivées de moelle osseuse. Dans une étude précédente, nous avons montré qu'un seul placenta à terme contenait MSC suffisante pour la fabrication de jusqu'à 7000 4 doses cliniques. Ces caractéristiques en font un tissu de placenta source idéale pour la fabrication de MSC allogéniques.}

Le placenta est un organe foeto - maternelle comprenant à la fois le tissu fœtal et maternel ^7, et donc MSC d'origine foetale ou maternelle peut être, théoriquement, isolé. Les références suivantes fournissent deinformations à queue sur le développement et la pathologie, ainsi que l' examen microscopique et macroscopique du placenta humain et de ses annexes ^8,9. Le placenta approprié est constitué en grande partie des vaisseaux sanguins du foetus et sécrétoires et les cellules de soutien appelées trophoblastes, qui constituent les villosités choriales couvertes par les frondosum chorionique (plaque) ^8. Les villosités placentaires ramifiés sont baignées dans le sang maternel délivré des artères utérines en spirale, ce qui permet des éléments nutritifs, l'hormone et l'échange de gaz entre le fœtus et la mère. Le placenta est ancré sur l'endomètre par les cellules stromales déciduales maternelles et des trophoblastes foetaux sont entrecoupées extravillious dans une matrice extracellulaire ^8. Les villosités convergent sur ​​la plaque chorionique foetal où ils forment le cordon ombilical ^8.

Un résultat du premier atelier international sur les cellules souches placentaires dérivées (2008) est une appréciation de la nécessité de normaliser l'isolement et characterization de cellules de placenta humain à terme ^10. En raison de l'anatomie du placenta, la dissection des tissus différents, l'isolement du MSC et les résultats de culture prévus peut être écrasante pour les nouveaux arrivants sur le terrain. Dans ce protocole, la récolte des tissus placentaires choriales, suivie par MSC isolement et l'expansion est bien détaillée. MSC caractérisation par cytométrie en flux et dans la différenciation in vitro sont considérés comme routine ^5,11-13, et donc que brièvement détaillé ici.

Comme l'a souligné dans une revue systématique de la littérature récente ^14, MSC obtenu à partir des villosités choriales placentaires sont généralement supposés être fœtal. Bien que, seulement 18% des études ont examiné l'origine du MSC obtenu, et de ceux, seulement la moitié des études a rapporté MSC foetal et l'autre moitié ont déclaré les populations de MSC maternels ou mixtes. Chacun des trois composants de tissus décrits ici (villosités choriales, plaque et decidua basalis choriales) sont compOSED principalement du fœtus membrane / villosités, et une petite proportion de cellules maternelles utérines dérivées, qui restent attachées au placenta livré. Nous fournissons des données démontrant que l' isolement MSC du côté maternel du placenta, plutôt que du côté foetal du placenta, comme nous l' avons signalé précédemment ^5,11, est un matériau de départ plus approprié si MSC maternelle sont souhaités. Ce protocole décrit également l'utilisation de XY FISH pour valider la contribution foetale ou maternelle à des cultures cellulaires. Bien que ce soit un protocole standard du fabricant, cette analyse est souvent négligée et son importance sous - estimée ^14.

Protocole

Les comités des recherches d'éthique à des services de santé Mater, le Royal Brisbane et l'Hôpital des femmes, Université de technologie du Queensland et l'Université du Queensland a approuvé la recherche et la collecte d'échantillons de placenta humain utilisés dans l'étude. Tous les protocoles respectés aux directives nationales de recherche. Les patients à condition informé consentement écrit pour l'utilisation de tissus à des fins de recherche.

Troisième trimestre de placentas ont été obtenus à partir de mères en bonne santé après césarienne (CS) naissances de routine à terme des hôpitaux mentionnés ci-dessus à Brisbane, en Australie. grossesses discordants mâles pour les échantillons de durée ont été utilisés dans cette étude pour distinguer foetal à partir de cellules maternelles. le sexe du fœtus a été déterminé par échographie avant la naissance et / ou inspection visuelle du nouveau-né à la naissance par le personnel clinique. X et Y chromosome hybridation fluorescente in situ (FISH) a été utilisée pour valider davantage le sexe et l' origine foetale ou maternelle de tissus préservés de laplacentas d'origine.

1. Avant la récolte, Préparer la Suite

Remarque: Lorsque vous effectuez des solutions enzymatiques, les exigences et les concentrations spécifiques fournies par le fabricant pour chaque produit doivent être suivies. Les enzymes sont souvent fournis comme un mélange brut de protéines, donc des enzymes similaires de différentes entreprises sont susceptibles d'avoir différentes activités / concentrations. Pour cette raison, les conseils du fabricant doit être reconnu et préparation de la solution peut être modifiée en conséquence.

1. Préparer ou acheter 1,5 à 2 L totale stérile solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour ce protocole.
2. Préparer la solution collagénase I du stock en pesant le type collagénase I et dissoudre 1 mg / ml dans du HBSS et vortex doucement pour assurer une dissolution complète. Déterminer le volume de HBSS (contenant du calcium et du magnésium) nécessaire pour amener une solution de collagénase à 100 unités (U) / ul (solution 1,000x de stock), puis filtrer en utilisant un 0,2 &# 181; m filtre seringue. Aliquotes volumes de 1 ml dans 1,5 ml tubes et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Préparer dispase solution mère en dissolvant dispase non stérile à 10 mg / ml dans un tampon phosphate solution saline de Dulbecco (DPBS) sans calcium ni magnésium. En outre diluer avec du DPBS sans calcium ni magnésium à une concentration finale de 2,4 U / ml. Stériliser par filtration à travers un filtre à seringue de 0,2 pm. Aliquotes volumes de 1 ml dans 1,5 ml tubes et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
4. Préparer désoxyribonucléase (DNase) solution mère -I en dissolvant DNase-I à 10 mg / ml dans 0,15 M de NaCl. Filtre à disposition par un filtre à seringue de 0,2 um. Aliquotes volumes de 1 ml dans 1,5 ml tubes et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
5. Préparer la solution de travail de digestion en combinant 100 U / ml de collagénase de type I, I.5 ug / ml de désoxyribonucléase I, et 2,4 U / ml de dispase dans un milieu DMEM exempt de sérum. Fraîchement décongeler et diluer les stocks d'enzymes immédiatement avant l'utilisation. Environ, un rapport 1: 1 de solution de digestionvolume à volume tissulaire est requise (par exemple 10 ml de tissu, mesuré dans un tube de 50 ml, on a besoin de 10 ml de solution de digestion).
6. Préparer une solution de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS et ajuster le pH à 7,4 ^15. Magasin 25 aliquotes ml à -20 ° C pour une longue durée ou à 4 ° C pendant 1 semaine.
7. Préparer MSC milieu de culture DMEM-Low glucose (DMEM-LG) supplémenté avec une solution antibiotique et antimycosique 1x et sérum bovin 10% non-inactivé par la chaleur du fœtus. FBS MSC-qualité peuvent être achetés auprès de nombreux fournisseurs de FBS.
8. Autoclave stériliser le matériel de dissection à l'avance, conformément aux directives institutionnelles. Ceux-ci incluent des ciseaux, pinces, scalpels, et un grand plateau de dissection métallique. Collecter plasticware supplémentaire stérile de culture de tissus et de consommables (par exemple des lames de scalpel, 50 ml et 15 ml tubes, 25 ml, 10 ml et 5 ml pipettes, et 75 ou 175 cm ² flacons de culture cellulaire).
9. Utiliser un équipement de laboratoire de culture cellulaire primaire standard: un b classe IIMeuble iosafety adapté pour l' isolement de cellules primaires, une culture de cellules incubateur réglé à 5% de CO ₂ et 37 ° C, une bascule dans un incubateur à 37 ° C, et une centrifugeuse avec une capacité de tubes de 50 ml.
10. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié: une blouse de laboratoire, 2 paires de gants (en tout temps), des lunettes de sécurité et chaussures gros doigts, conformément aux directives institutionnelles.
11. Préparer des solutions de décontamination appropriées pour les échantillons de sang humain, conformément aux directives institutionnelles et les conteneurs de déchets biologiques liquides à l'avance.

2. Isolement du placentaire MSC

1. Préparation du placenta
   1. Habillez dans l'équipement de protection individuelle requis. Mettre en place l'enceinte de sécurité biologique avec des matériaux nécessaires, les solutions et les conteneurs de déchets pour mener à bien la procédure jusqu'à la digestion enzymatique (section 2.5.6).
   2. Obtenir un placenta avec le consentement éclairé et l'approbation éthique. Recueillir le placenta par césarienne section dans des conditions chirurgicales aseptiques, et le paquet dans un sac stérile ou un seau pour le transport au laboratoire.
   3. Pendant le transport et avant la dissection, stocker le placenta à la température ambiante ou à 4 ° C.
      Remarque: tissus peuvent être conservés jusqu'à 6 heures sans affecter les performances de culture cellulaire.
      1. Limiter le temps entre le prélèvement de placenta et le traitement des tissus lorsque cela est possible. Cette recommandation est basée sur des questions pratiques. Dans certains cas, on a retardé le processus d'isolement des cellules pendant jusqu'à 6 heures après la naissance. Dans ces cas, les placentas ont été conservés à la température ambiante ou à 4 ° C (en laboratoire ou au centre de collecte). Aucune différence n'a été observée détectables, au-dessus de la variation générale du donneur, dans le MSC obtenu à partir de placentas quand ils ont été stockés à 4 ° C ou à la température ambiante.
   4. Placer le récipient avec le placenta dans l'enceinte de sécurité biologique. Ouvrir le récipient et transférer le placenta dans un bac stérile.
   5. Ouvrez les membranes fœtales (sac amniotique ou amnios-chorionique laeve) ^8. Devenir orienté avec les parties du placenta. Du côté du fœtus a l'insertion du cordon ombilical, ce qui est en général inséré centralement dans le placenta. Le côté maternel (bordée de basalis decidua), qui est opposé au côté du fœtus, a cotylédons évidentes (ou lobes).
   6. Pour commencer la dissection, orientez le placenta, le cordon ombilical vers le haut dans le plateau stérile.
      Remarque: Ce protocole est conçu pour produire suffisamment de cellules pour la semence dans une fiole T175 de chacun des trois types de tissus. Chaque digestion commence avec environ 10 g de tissu. Ceci est un numéro de départ similaire de flacons que des cultures de MSC initiées à partir d'une ponction de moelle 20 ml d'os. Si plusieurs cellules sont désirées, alors davantage de tissu peut être récolté, et le protocole peut être mis à l'échelle de façon linéaire. Les tailles des tissus à récolter sont qu'à titre indicatif de ce qui est pratique avec le tissu placentaire. Il y a quelques defining caractéristiques du villosités placentaires, qui peut être utilisé comme point de référence. Les dimensions indiquées servent une estimation et le cordon ombilical est utilisé comme un point de repère sur la surface du fœtus.
2. Dissection de la déciduale (D) Tissue
   1. Retournez le placenta au cours de sorte que la surface maternelle (de basalis decidua) est orientée vers le haut. Assurez-vous que le côté du fœtus avec le point d'insertion du cordon ombilical est orientée vers le bas.
   2. Coupez des morceaux de 0,5 cm d'épaisseur du côté maternel du placenta (contenant du tissu decidua de basalis).
   3. Placer les morceaux de tissu dans une boîte de Pétri contenant HBSS lors de la dissection pour garder les morceaux de tissu hydraté.
   4. Transfert tissu suffisant pour remplir un tube jusqu'à la marque 10 ml dans un tube de 50 ml (ce qui est d'environ 10 g de tissu).
3. Dissection de la plaque chorionique (CP) Tissue
   1. Mécaniquement retirer de la membrane amniotique de la surface fœtale du placenta (pas le sac amniotique), laissant le chofrondosum rionic (plaque chorionique) intacte.
   2. Couper des morceaux ~ 1 cm de large par 0,5 cm de profondeur de la plaque chorionique. Récolter la plaque choriale de la région la plus proche du cordon ombilical, à l'écart du bord du placenta.
   3. Placer les morceaux de tissu dans une boîte de Pétri contenant HBSS lors de la dissection pour les garder hydraté.
   4. Transfert tissu suffisante pour remplir un tube de 50 ml jusqu'à la marque 10 ml (~ 10 g de tissu).
4. Dissection du villosités choriales (CV) Tissue
   1. Disséquer CV tissu ~ 1 cm ² x 0,5-1 cm de profondeur à partir du tissu placentaire où le CP a déjà été supprimé. Encore une fois, la récolte CV de la région la plus proche du cordon ombilical, à l'écart du bord du placenta. Essayez de rester au moins 1 cm du côté maternel du placenta (contenant du tissu decidua de basalis); l'objectif est de récolter un tissu provenant de l'intérieur du tissu de villosités placentaires.
   2. Placer les morceaux de tissu dans une boîte de Pétri contenant HBSS pendant la dissection pour les garder hydraté.
   3. Transfert tissu suffisante pour remplir un tube de 50 ml jusqu'à la marque 10 ml (~ 10 g de tissu).
5. Mincing et Enzymatic Digestion du D, CP et CV placentaires Tissues
   1. Comme il y a ~ 10 g de D, les tissus de CP ou de CV en trois différents tubes de 50 ml, remplir chaque tube avec environ 40 ml de HBSS et inverser de façon répétée le tube afin de laver le tissu (répéter pour ~ 10 sec).
   2. Décanter le surnageant et répéter cette étape de lavage 2-3 fois jusqu'à ce que la solution est en grande partie exempte de sang. Utiliser une pipette de 10 ml ou des pincettes longues pour assurer que les morceaux de tissu ne sont pas perdues du tube (s) lors de décanter le surnageant.
   3. Retourner les morceaux de tissu dans une boîte de Pétri de 10 cm avec le transfert de liquide minimal. Chop / mâche le tissu en petits morceaux d'environ 1-5 mm ³ avec des ciseaux ou une lame de rasoir.
   4. Transférer les tissus émincés de nouveau dans étiquetés de façon appropriée (D, CP ou CV) tubes de 50 ml.
   5. Ajouter fraîchement prépared digérer support dans au moins un rapport 1: 1 avec le tissu (par exemple 10 ml de tissu plus 10 ml de digérer les médias). Replacez le capuchon sur chaque tube et inverser les tubes plusieurs fois pour mélanger.
   6. Incuber les tissus dans les tubes avec les médias digérer pendant 1-2 heures à 37 ° C. Une atmosphère humidifiée à 5% de CO ₂ ne sont pas nécessaires pour cette étape.
      Remarque: agitation rapide est nécessaire pour dissocier efficacement les cellules du tissu et de maximiser le rendement en MSC. rendement limité sera évident par très peu de cellules attachées au récipient de culture à 48 h et un premier temps de passage plus long que 1-2 semaines. Le temps d'incubation et la méthode secouage dépend de la couveuse 37 ° C disponible au laboratoire et peuvent nécessiter une optimisation.
      1. Pour un incubateur avec un mécanisme de secouage rapide et contrôlable, le lieu et le tissu digérer dans un tube de 50 ml ou flacon conique stérile, dans l'incubateur à moyen et à mettre en secouant la vitesse à 250 rpm. Cela se traduira par une digestion complète dele tissu en 1 h.
      2. Sinon, pour un incubateur avec un doux balancement ou pas de mécanisme à bascule, agiter manuellement le tube rapidement et vigoureusement à la main pendant 10 secondes toutes les 30 minutes pendant 1,5 à 2 heures. La période d'incubation enzyme est un moment approprié pour jeter les déchets, nettoyer l'armoire de biosécurité des éléments inutiles, changer blouse de laboratoire si elle est souillée et se préparer pour la prochaine partie de la procédure.
6. Collection de cellules mononucléaires et Placage en Flacons
   Note: A partir de l'étape précédente, il y a trois tubes de 50 ml (D, CP ou CV) avec la digestion de morceaux de tissu. Lorsque la solution de digestion de tissu évolue un aspect trouble et les vaisseaux sanguins blancs sont évidents dans le tissu, la digestion est terminée.
   1. Ajouter 30 ml de milieu MSC contenant du FBS à chaque tube pour inactiver les enzymes contenues dans la solution de digestion.
   2. Pour séparer les cellules mononucléaires du gros débris non digérés, pouls centrifuger le tube de 50 ml. En bref, permettrela centrifugeuse pour atteindre 340 x g pendant 5 s puis arrêter. Cela obligera les gros débris au culot au fond du tube, tout en laissant les cellules mononucléaires en suspension liquide.
      Remarque: Les cellules mononucléées resteront dans la phase liquide si le tube est brièvement (pulsée) centrifugé. Si la centrifugation est prolongée, les cellules mononucléées sont également culot au fond du tube avec les morceaux de tissu, ce qui entraîne une perte de cellules indésirables.
   3. Collecter le surnageant contenant les cellules mononucléaires et de transférer cette dans un nouveau tube de 50 ml avec une pipette.
   4. Ajouter 30 ml de milieu ou HBSS aux débris de tissu placentaire restant et agiter vigoureusement. Cela apportera autres cellules mononucléaires isolées en suspension et permettre une seconde récolte de MSC putative à partir du tissu.
   5. Pulse centrifuge le tube une seconde fois, et encore transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 ml. Répéter cette étape une troisième fois afin de maximiser l'efficacité de collectiondes cellules mononucléaires provenant de chaque source de tissu.
   6. Mutualiser les surnageants provenant de chacun des types de tissus individuels dans deux tubes de 50 ml. Cela donnera 6 tubes total (2 tubes de chaque D, CP et CV). Centrifuger chaque tube pendant 5 min à 340 x g. Cette étape va sédimenter les cellules mononucléaires au fond des tubes.
   7. carafer ou pipette le surnageant dans les déchets avec soin. Il est inutile d'essayer d'éliminer chaque goutte de surnageant.
      Remarque: Le culot cellulaire sera fragile, en raison d'un grand nombre de globules rouges. Veillez à ne pas jeter accidentellement la pastille si vous décanté directement à partir du tube de 50 ml.
   8. Après avoir enlevé la majeure partie du surnageant, effleurer doucement le tube plusieurs fois avec un doigt pour déloger le culot cellulaire. Mélanger les granulés, de sorte qu'il y a un seul tube pour chaque D, CP ou CV tissu et remettre en suspension dans 35 ml de chaque MSC médias.
   9. Facultatif: Filtrez la fraction mononucléaire à travers une cellule de tamis à mailles de 100 um u réglép dans un tube de 50 ml pour éliminer les amas de cellules ou d'un matériau fibreux.
      Remarque: Il faut veiller que les filtres peuvent facilement obstruer et plus de remplissage. En outre, des bulles d'air peuvent obstruer les filtres de drainage. Si cela se produit, soulevez lentement le filtre hors du tube pour permettre à l'air de circuler sous le filtre, laver le filtre à travers avec les médias ou l'échange de culture cellulaire à un nouveau filtre. En excluant l'étape de filtrage ne semble pas altérer le rendement ou la qualité des cultures MSC ultérieures.
      1. Éventuellement, un globule rouge (RBC) la lyse ou la centrifugation en gradient de densité peut être réalisée à ce stade ^15. Cependant, notre expérience est que RBC ne pas interférer avec MSC l'attachement ou la prolifération et donc RBC lyse est pas nécessaire. Les cellules mononucléaires peuvent être comptées à cette étape si le retrait RBC a été réalisée ^15. Bien que la grande majorité des cellules à ce stade, ne sera pas MSC, mais il faut trophoblastes foetaux d'origine, les cellules endotheliales et les cellules hématopoïétiques, ainsi que males cellules d'origine hématopoïétique et les cellules stromales internes déciduales.
   10. Transférer la suspension cellulaire pour chaque D, PC ou d'un tissu CV dans un flacon T175 unique et la culture dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO _2.
7. Expansion Isolation cellule post
   1. A 48 heures après l'isolement initial, éliminer le milieu de chacun des flacons (D, CP et CV) et le remplacer par 35 ml de milieu de MSC frais. Le milieu usé et des cellules individuelles peuvent être jetés, comme MSC putative sont présumés être attaché au flacon de culture tissulaire ^16. flacons Retour à l'incubateur pendant encore 24 heures.
   2. Après un 24 heures supplémentaires de la culture, se laver les flacons deux fois avec DPBS (25 ml) pour éliminer les débris et les globules rouges. Agiter le liquide autour du fond du flacon pour déloger les globules rouges. Utiliser une pipette pour enlever le liquide et les débris. Ajouter 35 ml de MSC médias pour les flacons et retourner les flacons dans l'incubateur.
   3. Remplacer les médias deux fois par semaine, etles cultures cubate jusqu'à ce que les monocouches de cellules sont confluentes à 80 à 90%. Cette expansion initiale prend 4-14 jours, en fonction de la qualité du tissu, la quantité de matière et de l'efficacité et de la durée d'incubation en commençant par la solution de digestion.

3. Subculture des EMSP

1. Lorsque les cultures sont 80-90% confluentes, laver deux fois avec 20 ml 1x HBSS ou DPBS et jeter lavages. Ajouter trypsine substitut à chaque flacon (utiliser soit 5 ml pour un flacon de T175).
2. Les flacons sont incubés pendant 5 min à 37 ° C pour libérer le MSC de la surface de culture tissulaire. Appuyez sur les parois du ballon tous ~ 2 minutes pour faciliter le détachement.
3. Lorsque les cellules se détachent de la surface et d'une suspension cellulaire unique, laver les cellules du flacon avec des milieux de MSC et recueillir les cellules dans des tubes. Les médias MSC vont diluer et désactiver la trypsine substitut (utilisation ~ 15 ml de MSC médias par flacon T175).
4. Transférer le contenu de chaque flacon de culture tissulaire à 50ml tube.
5. Tubes à centrifuger à 340 xg pendant 5 min pour sédimenter les cellules.
6. Jeter le surnageant et remettre en suspension les culots de cellules dans 1 ml de MSC médias.
7. Diluer 10 pl de suspension cellulaire dans 10 pi de bleu trypan. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et calculer le nombre total de cellules ^15.
8. Transférer les cellules à de nouveaux flacons à 1.150 cellules / cm ² dans les milieux MSC frais et incuber dans un incubateur de culture tissulaire. A cette densité de semis, les semences de 200.000 MSC dans chaque nouveau flacon de T175 dans 35 ml de MSC médias. Nourrissez cellules deux fois par semaine jusqu'à 80-90% confluentes. Seed passages ultérieurs à 1.150 cellules / cm ² ou 200.000 MSC dans chaque flacon T175.
9. Lorsque le passage 1 (P1) ou des cellules P2 sont confluentes, cryoconservation la majorité des cellules pour une utilisation future, et réensemencer un seul flacon de T175 destiné à la multiplication et la caractérisation. Les cellules propagées peuvent être utilisés à P3 ou P4 pour des essais de différenciation mésodermique et la caractérisation des cellules par l'intermédiaire de flow cytométrie.
   Note: Dans les premiers passages, il peut y avoir très peu de colonies faiblement séparées, mais la densité cellulaire locale dans chaque colonie peut être très élevé. Cela ne veut pas idéale puisque le remplissage dense locale des cellules entraîne l'inhibition de contact, ce qui retarde la croissance et la réduction de la performance de la culture. Nous recommandons lorsque les colonies denses sont observées, les cellules doivent être récoltées et réensemencées dans un nouveau flacon. Ce processus de redistribution fournit des cellules avec salle de proliférer, et la performance globale de la culture sera améliorée.
10. Pour la cryoconservation MSC, recueillir ~ 1 x 10 ⁶ cellules dans 1 ml de 90% de FCS et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) et le gel en utilisant des protocoles standard.
    Remarque: Dans la section des résultats représentatifs, il y a des descriptions de caractérisation MSC en utilisant la cytométrie de flux, la différenciation mésodermique et XY analyse FISH pour déterminer le sexe des trois différents (D, CP et CV) des populations de cellules expansées. Dans notre étude, placentas étaient des bébés de sexe masculin; ainsi touteles cellules foetales peuvent être distinguées comme mâle (chromosome Y) et toutes les cellules maternelles peuvent être distinguées comme femelle (chromosome X uniquement).

Résultats

La procédure d'isolement du MSC placentaire est résumée dans la figure 1. Les trois domaines de l'anatomie placentaire à partir de laquelle MSC ont été isolés sont mis en évidence dans la figure 2. Ce sont les decidua maternelle, ainsi que les tissus en grande partie fœtales de la plaque chorionique et villosités choriales. Beaucoup de livres de texte, des articles et en ligne détail des ressources du développement et le rôle fonctionnel des divers tissus placentaires (voir référence s'il vous plaît ^8).

La morphologie des cultures 48 heures après l'isolement et l'enlèvement des débris de tissu.
À la suite de 48 h de culture, les cellules souches mésenchymateuses sera attachée à la matière plastique de culture de tissu, alors que les globules rouges et de la plupart des autres débris cellulaires ne se sont attachés. A ce moment, le milieu doit être remplacé par 35 ml de milieu de culture frais. Avant cet échange moyen, il est difficile de faire des observations précises en raison de laun grand nombre de globules rouges, qui obstruent l'évaluation visuelle. L'apparition du surnageant de culture peut varier considérablement entre les donneurs placenta. Cette variation peut être vu visuellement dans l' exemple 1 et 2 (figure 3A). Ces deux isolements de MSC, qui semblaient être très différentes, ont été effectuées simultanément à partir de deux placentas différents. Cependant, une fois lavés, les deux cultures semblent similaires (voir exemple lavé 3, figure 3A).

Sous un microscope, après l'échange du milieu de 48 heures, seules quelques cellules seront fixés sur le flacon (figure 3B), et les cellules apparaissent significativement différents de cellules souches mésenchymateuses plus largement étendues. Certains débris et les globules rouges seront visibles comme flottants ou fixés touffes et ceux-ci ne seront pas interférer avec la croissance du MSC. Les cellules fibroblastiques plus collées au fond de la fiole sont susceptibles d'être un mélange de cellules comprenant MSC, hématopoïétique,trophoblaste ou des cellules endothéliales. Encore une fois, les cellules non MSC ne compromettent pas les cultures de MSC, étant donné que ces cellules ne survivent généralement plus de 1-2 passages dans les conditions de culture MSC. Malgré une certaine variation dans l'apparence initiale de cultures, les résultats d'expansion ultérieures sont généralement conformes.

Morphologie des cultures de MSC au fil du temps.
Dans cet exemple représentatif, sept jours après l' isolement, de petites colonies de MSC fibroblastiques étaient visibles, bien que les cellules non-MSC pourraient également être considérés comme des ronds ou des cellules faiblement attachées (figure 4A). Les cellules attachées sont ce qui a été initialement appelés une «unité formant colonie -fibroblast "(CFU-F) ¹⁷ et plus tard appelé MSC ^18. Treize jours après l' isolement, les colonies de MSC fibroblastiques étaient grandes (figure 4B). En général, la monocouche sera 80-90% confluentes à ce stade et les cellules doivent être Passa ged. De passage 2 et suivantes, le MSC monocouche placentaire développera la morphologie tourbillon comme caractéristique à la confluence (figure 4C). A moins que les cellules sont soumises à des passages à faible densité, la formation de CFU-F ne sera plus observée. A faible densité, MSC placentaire dérivés ont une apparence plus petit carré que la moelle osseuse adulte dérivé MSC ^1. Alors que MSC placentaire dérivé et MSC dérivées de moelle osseuse présentent des taux de prolifération similaires, les cellules placentaires dérivées sont moins sujettes à la sénescence rapide ^5.

Caractérisation du MSC placentaire in vitro.
Chaque population cellulaire expansée doit être caractérisée pour s'assurer qu'il est conforme aux critères du MSC standards ^16, comprenant (1) l' adhérence en matière plastique (2) la présence de marqueurs de surface mésenchymateuses et l'absence de marqueurs de surface hématopoiétiques, et (3) la capacité à subir mésodermique différenciation.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> placentaire MSCs sont adhérentes en plastique.
Comme on le voit sur ​​la figure 4, les cellules souches mésenchymateuses dans la culture sont en plastique adhérent et ont une morphologie ressemblant à des fibroblastes; cela valide que les cellules répondent aux premiers critères qui définissent MSC ^16.

affichage MSC marqueurs de surface mésenchymateuses placentaires.
La seconde caractéristique définissant le MSC est la présence de marqueurs de surface mésenchymateuses et l'absence de marqueurs de surface ¹⁶ hématopoiétiques. Comme il n'y a pas de marqueur unique capable d'identifier définitivement un MSC, des panneaux de marqueurs sont généralement utilisés en conjonction avec une analyse de cytométrie de flux pour identifier des cellules qui sont mésenchymateuses, mais non hématopoïétique. Dans l'ensemble de données représentatives fournies ici (figure 5A), nous avons évalué l' expression de cellules de marqueurs mésenchymateuses CD73, CD105, CD90, CD146 et CD44, les marqueurs hématopoïétiques CD45 et CD34 et HLA-DR, comme well comme le marqueur CD31 endothéliale. Tous les anticorps utilisés dans ce processus de caractérisation MSC placentaire sont énumérés dans le tableau des matériaux / équipement. La coloration a été effectuée selon les instructions du fabricant, avec des méthodes d'analyse décrites ici ^19.

Les cellules étaient positives pour les marqueurs mésenchymateuses CD73, CD105, CD44, et négatifs pour les marqueurs de surface cellulaire CD45, CD34, HLA-DR et CD31, comme attendu ^5,20. Environ, 37% et 57% des cellules dans notre ensemble de données représentatives étaient positives pour CD90 et CD146 ^21, respectivement. Les deux CD90 et CD146 sont couramment utilisées MSC marqueurs ^21. Profils de marqueurs de surface cellulaire MSC peuvent être différents selon la source MSC de tissu, la composition du milieu, ou le numéro de passage ^22. Dans nos nombreuses années d'expérience, on n'a pas observé la contamination à long terme des placentaire dérivés MSC avec des cellules non-mésenchymateuses suivante 1-2 passages ^5,11.

affichage MSC placentaire potentiel de différenciation mésenchymateuses
Par définition, MSC doit posséder in vitro mésodermique capacité de différenciation ^5,13. potentiel de différenciation mésodermique est couramment évaluée soit par des essais de différenciation tri- ou bi-lignage. essais Bi-lignage évaluent généralement ostéogénique et la capacité de différenciation adipocytaire, tandis que les essais tri-lignage évaluent en outre la capacité de différenciation chondrogénique. Dans les résultats représentatifs présentés ici, nous montrons que les populations de MSC expansés forment les dépôts de calcium, indiquant une différenciation ostéogénique et des vacuoles lipidiques, indiquant adipogenèse (figure 5B).

Pour caractériser les populations de MSC rapportées ici, nous tête de série dans les cellules de 24 puits de culture à 6 x 10 ⁴ cellules dans 1 ml de milieu d' induction. Le Compo moyensants sont répertoriés dans le tableau des matériaux / équipement. Alors que les formulations moyennes induction sont fréquentes dans la littérature, il existe une variabilité considérable dans les formulations publiées. Pour cette raison, nous listons brièvement nos formulations à induction moyenne et les approches de coloration ici. ostéogène milieu d'induction contient DMEM-HG, 10% de FBS, 1 x solution antibiotique antimycotique, 10 mM de β-glycérol au phosphate 100 nM de dexaméthasone et 50 uM d'acide L-ascorbique 2-phosphate. milieu d'induction adipogéniques contenait DMEM-HG, 10% de FBS, 1 x solution antimycosique antibiotique, 10 pg / ml d'insuline, 100 nM de dexaméthasone, 200 uM d'indométhacine et 500 uM xanthine-3-isobutyl-1-méthyl. Ici, les cultures ont été maintenues à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur et mises en culture pendant 14 jours. moyen d'induction a été échangé deux fois par semaine pendant la période de culture. Après 14 jours d'induction, les cultures ont été caractérisées par une ou l'autre matrice osseuse comme (ostéogenèse) ou vacuoles lipidiques (adipogenèse) selon notre prevpublication ious ^5. Ostéogène analyse de dépôt de la matrice de calcium a été obtenue en premier aspirer hors du support, fixant les cultures avec du paraformaldehyde à 4% pendant 20 min, on lave la monocouche avec du DPBS, puis coloration avec du rouge d'alizarine S selon les instructions du fabricant. l'induction adipocytaire a été évaluée par aspiration hors du support, fixant les cultures avec du paraformaldehyde à 4% pendant 20 min, on lave la monocouche, et la coloration avec une solution de rouge d'huile O selon les instructions du fabricant. dépôts de calcium Stained et vacuoles d'huile ont été ensuite visualisées avec un microscope optique, et les images enregistrées pour référence future.

Dans les publications antérieures, nous avons caractérisé le potentiel de différenciation des MSC dérivées du placenta plus largement ^4,5. Placentaire dérivé MSC ostéogenèse est similaire à MSC dérivées de moelle osseuse, tandis que l' adipogenèse est généralement moins efficace dans le MSC placentaire dérivé ^{5 <}/ Sup>. Nous ne réalisons pas systématiquement sur ​​la différenciation chondrogénique pour plusieurs raisons, même si cela a été rapporté précédemment par nous pour placentaire-MSC ^5. Tout d' abord, alors que la capacité de différenciation mésodermique est une caractéristique déterminante du MSC, il est probable d' une importance secondaire ^23-25, en particulier lorsque le bénéfice thérapeutique est susceptible d'être dérivé des sécrétions paracrines MSC ^26. Deuxièmement, bien que dominici et al. A proposé des critères minimaux pour la production clinique de l' os adulte MSC dérivées de moelle humaine ^16, des études plus récentes indiquent MSC de différentes niches ont des propriétés inhérentes et les capacités de différenciation ^5,13,27-32. En fait, Parolini et al. A proposé que MSC dérivée du placenta doit se différencier en lignées "un ou plusieurs mésodermiques» plutôt que tous les trois lignées ^10. Enfin, de nombreuses études MSC excluent la différenciation chondrogénique comme cela se produit à travers un mêmevoie intracellulaire de signalisation que l' ostéogenèse (voie de la famille TGFß) ^33-35.

MSC placentaires sont à l'origine maternelle en utilisant cette méthode de culture, en dépit de la localisation anatomique de la matière de départ.
De nombreuses publications supposent que les cellules isolées du rendement chorion MSC foetal foetal sur la culture ^14. Cependant, comme nous l' avons signalé précédemment ^5, toutes les cultures dérivées de chorion foetal, en utilisant ce protocole, rapidement devenir enrichi pour MSC maternelle comme cela intuitivement être prévu pour les cultures MSC déciduales maternelles. Dans ces résultats représentatifs, nous avons utilisé le tissu placentaire de bébés de sexe masculin de sorte qu'il était possible de délimiter facilement la contribution maternelle et fœtale cellulaire dans les populations de cellules expansées. Pour ces études , nous avons utilisé le kit FISH XY énumérés dans le tableau des Matériaux / Équipement et suivi les instructions du fabricant.

Dans les données représentatives fournies ici, les cultures dérivées de decidua maternelle étaient ~ cellules maternelles 90% (XX) et ~ 10% de cellules fœtales (XY) au passage 0 (Figure 6) . Par le passage 2, les populations cellulaires dérivées de tissus maternels étaient des cellules maternelles ~ 100% (XX) et les cellules fœtales (XY) étaient indétectables. Ceci suggère que la dissection physique du tissu maternel a conduit à l'enrichissement des cellules maternelles dans les cultures ultérieures. Cependant, il est essentiel de tenir compte des résultats de la culture de la villosités choriales du foetus et les cultures dérivées de la plaque chorionique. Le passage à 0, les deux cultures dérivées plaque villosités choriales du foetus et choriales étaient ~ 85% XY, ou d'origine foetale, ce qui indique que la dissection ciblée enrichie pour les cellules fœtales (figure 6). Au passage 0, les deux cultures contenaient ~ 15% cellules maternelles (XX) contamination. De manière surprenante, au passage 2, les deux cultures ont été remplies avec foetaux des cellules ~ 100% maternels (XX), et des cellules foetales (XY)ne sont plus détectables. XY analyse FISH révèle que les cellules maternelles (chromosomes XX) rapidement et systématiquement reprise des cultures dérivées des tissus fœtaux choriales. Cette observation est de culture critique qui est souvent négligé ^5. Le détail de cette analyse est inclus dans ce protocole, car elle démontre l'observation très important que les cellules maternelles peuplent rapidement toutes les cultures quand DMEM supplémenté avec 10% de FBS est utilisé sans facteurs supplémentaires destinées à soutenir les populations fœtales dérivées.

Figure 1:. Résumé de la procédure d'isolement du MSC placentaire (Etape 1) Orientez - vous avec l'anatomie du placenta. (Étape 2) disséquer manuellement 10 g de tissu soit de la decidua, villosités choriales ou la plaque chorionique avec des ciseaux. (Étape 3) Hacher til disséquée parties de decidua, villosités choriales ou les tissus de la plaque choriales en petits morceaux avec des ciseaux ou un scalpel.
(Étape 4) Liberate cellules des pièces fines par une digestion 1-2 h dans dispase et collagénase I.
(Etape 5) séparer les cellules du tissu fibreux par centrifugation d'impulsion et / ou en les lavant à travers un tamis cellulaire. Recueillir et resuspendre les cellules dans un milieu de culture et placés dans des flacons de culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

cellules stromales mésenchymateuses (MSC) seront sélectionnés en fonction de leur propension à l'adhésion en plastique et de la capacité de survivre et de proliférer dans le milieu de culture. Enfin, dans la section des résultats, le MSC expansé peut être caractérisée et stockée pour une utilisation dans des expériences ultérieures.

Figure 2:. Anatomie du placenta et des tissus humains isolés terme dans cette procédure Le premier tissu à récolter est decidua maternelle. Déciduale est un tissu qui reste sous forme de couche mince sur la surface du placenta après qu'il a été libéré de la paroi utérine (déciduale est identifié par les marqueurs verts). Le deuxième tissu qui sera récolté à partir de l'intérieur du placenta est le trophoblaste fœtal (marqueurs bleus). Le troisième tissu à récolter est la plaque foetal chorionique (marqueurs rouges) (adapté de la référence ^36). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Morphologie des cultures 48 heures après l' isolement et redéplacer les débris de tissu (A) . L'apparition du surnageant de la culture peut varier considérablement entre les donneurs de placenta avant de rincer les débris. Exemple cultures 1 et 2 montrent cette variation. Ces deux isolements ont été effectuées simultanément, mais à partir de deux placentas différents. Une fois que les cultures lavées seront claires des globules rouges et des débris de tissu comme indiqué dans l'exemple 3. Les résultats d'expansion ultérieures sont généralement conformes. (B) Après l'échange du milieu de 48 heures, seules quelques cellules sera attaché au flacon. Barre d' échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4:. Morphologie des cultures MSC au fil du temps (A) Sept jours après l' isolement, petite fcolonies MSC ibroblastic sont visibles bien que les cellules non-MSC seront également présents en rond ou cellules faiblement attachées. (B) 13 jours après l' isolement, les colonies de MSC fibroblastiques sont grandes et souvent la monocouche de MSC est confluentes et prêt à passage. (C) De passage 2 et suivantes, la monocouche MSC développera une morphologie tourbillon comme caractéristique à la confluence. Barre d' échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5:. MSC caractérisation par cytométrie en flux et la différenciation mésodermique (A) chorionique MSC dérivées villosités placentaires afficher un profil de marqueur MSC classique par analyse de cytométrie de flux, bien que pour ces marqueurs de surface cellulaire, expression est similaire pour tous les types de MSC humaine. Chaque histogramme montre l'intensité du signal (axe x) par rapport à la numération cellulaire normalisée sur l'axe Y (en% du maximum). Dans ces données représentatives établies les cellules étaient positives pour CD73, CD105 et CD44, et négatif pour les marqueurs hématopoïétiques CD45 et CD34 et HLA-DR. (B) placentaire MSC subissent généralement solide différenciation ostéogénique, cependant (C) la différenciation adipocytaire peut être moins efficace qu'avec MSC dérivées de moelle osseuse. Images dans les légendes B et C ont été prises à un grossissement de 40X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Le MSC placentaires sont à l' origine maternelle en utilisant cette méthode de culture, en dépit de la localisation anatomique de la matière de départ.Les courbes montrent la quantification du foetus (mâle, XY) et de la mère de composition (femelle, XX) de cellules des cultures de MSC isolées à partir du placenta décidual villosités choriales et dans les tissus de la plaque choriales à chaque second passage. cellules maternelles (XX) rapidement et de façon reproductible prendre en charge les cultures dérivées des tissus fœtaux choriales. Fœtal = mâle = chromosomes XY détectés dans une cellule individuelle, maternelle = femelle = XX chromosomes détectés dans une cellule individuelle. Les données présentées ici était de N = 3 placentas indépendants de bébés de sexe masculin des donateurs, avec un minimum de 100 cellules colorées pour XY FISH et comptés pour chaque point de données. Les barres représentent les moyennes et les barres d'erreur reflètent un écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le placenta est un organe physiquement grand foeto - maternelle, à partir de laquelle MSC foetale ou maternelle peut être isolé ^22. Ici, nous avons fourni un aperçu détaillé de l'anatomie du placenta et des instructions sur la façon de disséquer spécifiquement decidua (maternelle), villosités choriales (de fœtus), et la plaque chorionique (foetal) tissu (étape 2,2-2,4). Par la suite, nous avons décrit un protocole robuste qui permet MSC l'isolement de chacun de ces trois tissus (étape 2,5-2,6). L' expansion placentaire MSC est efficace et les cultures semblent similaires à la moelle osseuse dérivés MSC cultures (figures 3 et 4). Une différenciation ostéogénique est fiable (figure 5B), tandis que la différenciation adipocytaire est généralement moins efficace (figure 5C) ^5.

Beaucoup de nouveaux arrivants sur le terrain vont présumer que les cultures dérivées de villosités choriales foetal ou des tissus de la plaque choriales seront enrichies en MSC foetal. Cependant, dans nos mains fel' enrichissement cellulaire tal est seulement transitoire lorsque le milieu d'expansion de MSC standard tel que DMEM-LG + 10% de FBS est utilisée ^5. Ici, nous fournissons des résultats représentatifs à l'aide de tissus placentaires provenant d'un bébé de sexe masculin. En utilisant le tissu placentaire d'un bébé de sexe masculin, les cellules foetales sont facilement identifiable comme ayant des chromosomes XY, tandis que les cellules maternelles sont identifiables comme ayant des chromosomes XX. La figure 6 montre les résultats de FISH XY pour une culture représentative. Alors que le MSC fœtal (XY) sont enrichis (jusqu'à 80%) dans les cultures initiales dérivées de villosités choriales du foetus ou de tissus de la plaque choriales, les mêmes cultures sont rapidement rattrapés (~ 100%) par la mère (XX) du MSC au cours des deux premiers passages . Dans un milieu standard, composé de DMEM-LG + 10% de FBS, le MSC maternel dérivé rares qui contaminent les tissus foetaux outcompete les cellules foetales dérivées de la culture.

Une étape critique décrite dans ce protocole est une appréciation de l'anatomie du placenta et d'où foetalet le tissu maternel peut être le plus efficacement récolté. Comme il est indiqué dans la section des résultats représentatifs, la dissection du tissu fœtal ne permet l'enrichissement transitoire pour MSC fœtaux dérivés. L'amélioration de la croissance à moyen formulation, par le biais exogène facteur de croissance moyen de suppléments spécifiques devraient permettre une expansion sélective des populations de MSC fœtaux dérivés, et la production d'un produit cellulaire qui est enrichi pour foetal plutôt que des cellules maternelles (notre groupe est en train de développer de telles formulations moyennes). La fabrication des populations de MSC foetales peut avoir un certain nombre d'avantages, comme MSC foetal sont censés avoir une plus grande angiogenèse et des propriétés immunosuppressives que les populations de MSC maternels équivalents ^37.

Dans chacun des protocoles d'isolement décrits, on a utilisé environ 10 grammes de tissu. Tout un placenta est typiquement 500-750 g, et dans le travail précédent, nous avons démontré que, grâce à un tissu automatisé condensé et un bioréacteur proc d'expansion cellulaireesses qu'il devrait être possible de fabriquer plus de 7000 doses de cellules cliniques d'un seul placenta ^4. Ces chiffres mettent en évidence la pertinence potentielle de MSC placentaire dérivés dans les thérapies de MSC allogéniques, et l'importance de cette méthode sans distinction d'origine MSC (foetale ou maternelle). Du point de vue thérapeutique, il est plus important que les utilisateurs ont une compréhension complète du produit cellulaire et la capacité de fabriquer de manière fiable ce produit cellulaire. Nous espérons que notre vidéo aidera les chercheurs à comprendre l'anatomie du placenta, isoler MSC à partir du placenta, et anticiper la composition cellulaire foetale ou maternelle probable de leurs cultures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Reagents
HBSS	Gibco/Invitrogen	14185-052	Nom long : Hanks Balanced Salt Solution
FBS	Gibco/Invitrogen		Nom long : Fetal Bovin Serum
trypsin-substitute	Gibco/Invitrogen	12563-029	Nom long : TrypLE Select
DMEM-LG	Gibco/Invitrogen	11885-092	Nom long : Dulbecco' s Aigles modifiés Teneur moyenne-faible en glucose
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Nom long : Dulbecco' s Eagles modifiés Glucose moyennement élevé (4,5 g/L)
PBS (sans Mg+Ca+)	Gibco/Invitrogen	14190-250	Nom long : Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, sans magnésium ni calcium
Anti-anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Nom long : solution antibiotique-antimycotique x100
poudre de paraformaldéhyde ou solution à 4 %	n’importe laquelle ;
Collagénase I	Invitrogen	17100-017  ;	2 500 U/ml
Dnase I	Sigma	D5025	10 mg/ml in  ; 0,15 M NaCl
Dispase	Invitrogen	17105-041  ;	10 mg/ml dans l’eau (20 000 U/ml).
Material	Company	Numéro de catalogue	Comments
>Disposables :
Tubes à centrifuger de 50 ml	Falcon ou boîtes
, plastique stérile (25 cm et 10 cm de diamètre)	Nunc
Crépines cellulaires (100 &mu ; m)	Becton Dickinson	352340
175 et 75 cm2 (T175 et T75) flacons de culture tissulaire	Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml pipettes sérolgiques	stériles de toute marque
Material	Company	Numéro de catalogue	Comments
Equipement :
; Centrifugeuse  ;   ;
; incubateur de culture tissulaire 37 ° ; C, 5 % CO2
Enceinte
; Ciseaux et pinces
stériles Porte-tubes
Pipette-boy ou équivalent
, pipettes de type Gilson et pointes stériles 1 000 & micro ; l, 200 et micro ; l, 20 µ ;l.
incubateur à bascule ou à secousses (37 ° ; C)
Solutions de nettoyage de l’équipement
Conteneurs à déchets, bacs d’élimination corrects pour les tissus/sang
réactifs pour la caractérisation des CSM
	Fabricant	N° de catalogue	Isotype
CD73 (AD2)	Miltenyi Biotec	130-095-183	Souris IgG1
CD105 (43A4E1)	Miltenyi Biotec	130-094-941	Souris IgG1
CD90/Thy-1 (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-403	Souris IgG1
CD45 (5B1)	Miltenyi Biotec	130-080-202	Souris IgG2a
CD34 (AC136)	Miltenyi Biotec	130-090-954	Souris IgG2a
HLA-DR (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-298	Souris IgG2a
CD31 (PECAM-1)	BD Pharmingen	555446	souris IgG1
CD146 (541-10B2)	Miltenyi Biotec	130-092-849	Souris IgG1
CD44 (DB105)	Miltenyi Biotec	130-095-180	Souris IgG1
Isotype Controls (Clone ID)	Fabricant	N° de catalogue
Souris IgG1 Isotype (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-214
Isotype IgG1 de souris (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-212
Isotype IgG1 de souris (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-213
IgG2a de souris (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-091-837
IgG2a de souris (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-098-849
Tampon MACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Différenciation ostéogénique	Fabricant	N° de catalogue
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Nom long : Dulbecco' s Eagles modifiés Glycémie moyenne-élevée (4,5 g/L)
FBS	Gibco/Invitrogen		Nom long : Sérum de veau fœtal
Anti-anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Nom long : solution antibiotique-antimycosique x100
Dexaméthasone	Sigma	D4902
&beta ;-Glycérol Phophate	Sigma	50020
L-ascorbique 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
Rouge d’alizarine S	Sigma	A5533-25G	Pour la coloration de la matrice calcique
Différenciation adipogénique	Fabricant	N° de catalogue
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Nom long : Dulbecco' s Aigles modifiés Glycémie moyenne-élevée (4,5 g/L)
FBS	Gibco/Invitrogen		Nom long : Sérum de veau fœtal
Anti-anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Nom long : solution antibiotique-antimycosique x100
insuline	Sigma	I2643
Dexaméthasone	Sigma	D4902
Indométacine	Sigma	I7378
3-isobutyl-1-méthyl xanthine	Sigma	I5879
Oil Red O solution	Sigma	O1391-250ML	Pour la coloration des vacuoles lipidiques
XY FISH kit pour déterminer l’origine fœtale ou maternelle des cellules
XY chomosome FISH kit	Vysis (Abbott Molecular)	07J20-050	Nom long : CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Kit de sonde d’ADN fluorescente à marquage direct