Caractérisation fonctionnelle des macrophages réglementaires qui inhibent l'immunité réactive du greffe

Résumé

Les macrophages sont des cellules plastiques du système hématopoïétique qui jouent un rôle crucial dans l'immunité protectrice et l'homéostasie. Dans ce rapport, nous décrivons des techniques in vitro optimisées pour caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les macrophages régulateurs infiltrants de greffe qui s'accumulent dans l'organe transplanté dans des conditions tolérantes.

Résumé

L'accumulation de macrophages dans les organes transplantés a longtemps été reconnue comme une caractéristique du rejet d'allogreffe ¹ . Les monocytes immunogènes infiltrent l'allogreffe au début de la transplantation, montent une réponse réactive du greffon contre l'organe transplanté et initient le rejet d'organe ² . Les données récentes suggèrent que les macrophages suppressifs facilitent la transplantation réussie à long terme ³ et sont nécessaires pour l'induction de la tolérance à la transplantation ⁴ . Cela suggère un concept multidimensionnel de l'ontogenèse, de l'activation et de la fonction des macrophages, qui exige une nouvelle feuille de route pour l'isolement et l'analyse de la fonction macrophage ⁵ . En raison de la plasticité des macrophages, il est nécessaire de fournir une méthodologie pour isoler et caractériser les macrophages, selon l'environnement tissulaire, et pour définir leurs fonctions selon différents scénarios. Ici, nous décriÊtre un protocole pour la caractérisation immunitaire des macrophages infiltrés par greffon et les méthodes que nous avons utilisées pour évaluer de manière fonctionnelle leur capacité à inhiber la prolifération de CD8 ⁺ T et à favoriser l'expansion Treg de CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ in vitro .

Introduction

Ce protocole décrit des techniques in vitro pour étudier la fonction des macrophages infiltrant les tissus isolés à partir d'allogreffes cardiaques, selon leur capacité à moduler les réponses des lymphocytes T. Dans la littérature, les colorants fluorescents de suivi des cellules en combinaison avec la cytométrie en flux sont des outils puissants pour étudier la fonction suppresseur de types de cellules spécifiques in vitro et in vivo. Notre protocole suit la méthode de l'ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes in vitro .

Lorsqu'u....

Protocole

Dans cette étude, les souris sont logées conformément aux directives du ministère de l'Agriculture des États-Unis et aux recommandations du Guide du service de santé publique pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les techniques expérimentales impliquant l'utilisation d'animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) de la Mount Sinaï School of Medicine.

1. Préparation des médias

1. Préparer le milieu RPMI 1640 complet avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine (10 000 U / mL) en utilis....

Résultats

Les résultats représentatifs montrent la stratégie de verrouillage décrite dans le protocole ci-dessus. Les résultats montrent également l'analyse de l'activité de prolifération des lymphocytes T après la co-culture avec des macrophages infiltrant le greffon. La capacité suppressive in vitro des sous-ensembles de macrophages a été analysée à la figure 4 . Les résultats indiquent que Ly6C ^lo Ly6G ^- macrophages obtenus à partir de récepteurs .......

Discussion

Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour immuno-caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes infiltrantes de greffe dans un modèle murin expérimental de transplantation cardiaque, qui s'applique également à d'autres tissus dans différents modèles expérimentaux murins. Le triage cellulaire à basse pression à 20 psi était la méthode préférée pour isoler un bon rendement de sous-ensembles de cellules pures. Le maintien de la pureté de chaque sous-ensemble myéloïde est essentiel pour établir des résu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1 000 x 2-mercaptoéthanol	Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-glutamine	Life Technologies	25030081
100x Non Acides aminés essentiels	Corning	25025039
1 M HEPES buffer  ;	Corning	25060CL
100 mM Pyruvate de sodium	ThermoScientific	SH30239.01
Péniciline/Streptavidyn	ThermoScientific	15140122
Collagénèse A	Roche	70381322
DPBS (sans calcium et magnésium)	Corning	21031CV
70 µ ; m Filtre cellulaire	Fisher	22363548
Tampon de lyse ACK	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Souris Activateur de cellules T CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 puits  ; Plaque à fond en U	Corning	353077
Anticorps :
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII Cytomètre en flux	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J  ;	Le Laboratoire Jackson	008374
C57BL/6	Le Laboratoire Jackson	000664
Balb/c	Le Laboratoire Jackson	000651

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