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Article de méthode

Laboratoire de simulation d'un fer (II) riche système Upwelling précambrien Marine à explorer la croissance des bactéries photosynthétiques

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DOI :

10.3791/54251

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24 juillet 2016

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1Department of Geosciences, University of Tuebingen, 2Department of Geological and Atmospheric Sciences, Iowa State University

Dans cet article

Résumé

Nous avons simulé un système d'upwelling marine ferrugineuse précambrien dans une colonne d'écoulement vertical l'échelle du laboratoire. L'objectif était de comprendre comment les profils géochimiques de O 2 et Fe (II) évoluer en tant cyanobactérie produits O 2. Les résultats montrent la mise en place d'un chimiocline due à Fe (II) par oxydation photosynthétique O produit 2.

Résumé

Un concept classique pour le dépôt de certains précambriens Banded Iron Formations (BIF) part du principe que le fer ferreux [Fe (II)] upwelling de sources hydrothermales dans l'océan précambrien a été oxydé par l' oxygène moléculaire [O 2] produit par les cyanobactéries. Les BIFs les plus anciens, déposés avant la Grande Oxydation Event (GOE) à 2,4 milliards ans (Gy) il y a, auraient formé par oxydation directe de Fe (II) par anoxygéniques photoferrotrophs dans des conditions anoxiques. En tant que méthode pour tester les modèles géochimiques et minéralogiques qui se développent selon différents scénarios biologiques, nous avons conçu une colonne d'écoulement vertical 40 cm de long pour simuler un Fe anoxique (II) riche système d'upwelling marines représentatives d'un ancien océan sur une échelle de laboratoire . Le cylindre a été emballé avec une matrice de billes de verre poreux pour stabiliser les gradients géochimiques, et les échantillons liquides pour la quantification de fer pourrait être prise dans la colonne d'eau. L'oxygène dissous étaitdétecter de manière non invasive par l'intermédiaire optodes de l'extérieur. Les résultats des expériences biotiques impliquant des flux d'upwelling de Fe (II) du fond, un dégradé de lumière distincte de haut, et les cyanobactéries présentes dans la colonne d'eau, montrent des preuves claires pour la formation de Fe (III) précipités et le développement d'un chimiocline minéraux entre Fe (II) et O 2. Cette colonne permet de tester des hypothèses pour la formation des BIF en cultivant les cyanobactéries (et dans les futurs photoferrotrophs) dans des conditions précambriens marines simulées. En outre, nous émettons l'hypothèse que notre concept de colonne permet la simulation de divers environnements chimiques et physiques - y compris marins ou lacustres sédiments superficiels.

Introduction

Le Précambrien (4,6 à 0,541 Gy il y a) atmosphère a connu une accumulation progressive de la photosynthèse produit l' oxygène (O 2), peut - être ponctuée par des changements progressifs à la soi-disant "Great Oxydation Event" (GOE) à environ 2,4 Gy il y a, et à nouveau dans le Néoprotérozoïque (1 à 0,541 Gy il y a) que O 2 atmosphérique approché les niveaux modernes 1. Les cyanobactéries sont les restes de l' évolution des premiers organismes capables de photosynthèse oxygenic 2. Études de preuves et de modélisation géochimiques soutiennent le rôle des milieux côtiers peu profonds dans l' hébergement des communautés actives de cyanobactéries ou organismes capables de photosynthèse oxygéné ou phototrophs oxygénés, générant oasis d'oxygène locales dans l'océan de surface inférieure à une atmosphère essentiellement anoxique 3-5.

Le dépôt de Banded Iron Formations (BIF) à partir de l'eau de mer à travers les points de précambriens en fer (II) (Fe (II)) comme un géochimique majeur constituent eau de mer, au moins localement, lors de leur dépôt. Certains des plus grands BIFs sont des dépôts d'eau profonde, formant au large du plateau continental et de la pente. La quantité de Fe déposé est incompatible du point de vue de l' équilibre de masse avec prédominance continentale (c. -à- intempéries) la source. Par conséquent, une grande partie du Fe doit avoir été fournie par l' altération hydrothermale de mafiques ou ultramafiques fond marin croûte 6. Les estimations du taux de Fe déposé à l' extérieur des milieux côtiers sont compatibles avec Fe (II) fourni à l'océan de surface via upwelling 7. Pour Fe à transporter dans les courants d'upwelling, doit avoir été présent dans la forme mobiles réduite - sous forme de Fe (II). L'état d'oxydation moyenne de Fe conservé dans BIF est de 2,4 8 et il est généralement admis que BIF préserver Fe déposé sous forme de Fe (III), formé lorsque upwelling Fe (II) a été oxydé, éventuellement par l' oxygène. Par conséquent, l'exploration Fe (II) les mécanismes d'oxydation potentiels le long de la pente environments est important de comprendre comment BIF formé. De plus, la caractérisation géochimique raffinée des sédiments marins a identifié que les conditions ferrugineux, où Fe (II) était présent dans une colonne d'eau anoxique, étaient une caractéristique persistante des océans à travers le Précambrien, et peuvent ne pas avoir été limités à un peu le temps et le lieu où ont été déposés BIF 9. Par conséquent, pour au moins deux milliards d' années de l'histoire de la Terre, les interfaces redox entre Fe (II) et O 2 dans les océans peu profonds étaient monnaie courante probable.

De nombreuses études utilisent des sites modernes qui sont des analogues chimiques et / ou biologiques des différentes caractéristiques de l'océan précambrien. Un bon exemple sont des lacs ferrugineuses où Fe (II) est stable et présente dans les eaux de surface éclairée par le soleil tandis que l' activité photosynthétique (y compris par les cyanobactéries) a été détectée 10-13. Les résultats de ces études permettent de mieux comprendre les caractéristiques géochimiques et microbiennes d'un oxic à anoxique / ferchimiocline ruginous. Cependant , ces sites sont généralement physiquement stratifiés avec peu de mélange vertical 14, plutôt que les interfaces chimiques qui se produisent dans un système d'upwelling, et sont pensés pour soutenir la production plus d'oxygène dans le temps précambrien 4.

Un analogue naturel pour explorer le développement d'une oasis marine d'oxygène sous une atmosphère anoxique, et à un Fe (II) système d'upwelling riche dans la colonne d'eau de surface éclairée par le soleil ne sont pas disponibles sur la Terre moderne. Par conséquent, un système de laboratoire qui permet de simuler une zone d'upwelling ferrugineuse et également soutenir la croissance des cyanobactéries et photoferrotrophs est nécessaire. La compréhension et l'identification des processus microbiens et leur interaction avec un milieu aqueux upwelling qui représente l'eau de mer précambrien favorise la compréhension et peuvent compléter les informations obtenues à partir du disque de rock afin de bien comprendre les processus biogéochimiques distinctifs sur l'ancienne Terre.

À cette fin, une colonne échelle du laboratoire a été conçu dans lequel Fe milieu riche en eau de mer (II) (pH neutre) a été pompée dans la partie inférieure de la colonne, et pompée à partir du haut. Illumination a été fourni en haut pour créer une largeur de 4 cm "zone photique" qui a soutenu la croissance des cyanobactéries dans le top 3 cm. Les milieux naturels sont généralement stratifiés et stabilisé par des gradients physicochimiques, comme la salinité ou la température. Afin de stabiliser la colonne d'eau sur une échelle de laboratoire, le cylindre de la colonne a été emballé avec une matrice de billes de verre poreux qui a contribué à maintenir la mise en place de modèles géochimiques qui se sont développées au cours de l'expérience. Un flux continu de gaz N 2 / CO 2 a été appliquée pour vider l'espace de tête de la colonne afin de maintenir une atmosphère anoxique réfléchissante d'un océan avant le GOE 15. Après un flux constant de Fe (II) a été mis en place, les cyanobactéries ont été inoculées dans toute la colonne, ainsi que leur growth a été contrôlée par le nombre de cellules sur les échantillons prélevés par les ports d'échantillonnage. On a surveillé l' oxygène in situ en plaçant des feuilles optode sensibles à l' oxygène sur la paroi intérieure du cylindre de la colonne et des mesures ont été faites avec une fibre optique à partir de l' extérieur de la colonne. Aqueux Fe spéciation a été quantifiée par des échantillons retrait à partir des ports d'échantillonnage horizontaux profondeur résolue et analysé avec la méthode Ferrozine. Les expériences et les résultats du contrôle abiotiques démontrent la preuve de concept - qu'un analogue à l'échelle de laboratoire de la colonne d'eau antique, maintenu dans l'isolement de l'atmosphère, est réalisable. Cyanobactérie a augmenté et produit de l'oxygène, ainsi que les réactions entre Fe (II) et de l'oxygène étaient résolubles. Ici, la méthodologie pour la conception, la préparation, le montage, l' exécution et l' échantillonnage d'une telle colonne sont présentés, ainsi que les résultats d'une course de 84 heures de la colonne alors inoculés avec la cyanobactérie marine Synechococcus sp. PCC 7002.

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Protocole

1. Préparation de la mise en culture Medium

Note: Informations sur les équipements nécessaires, des produits chimiques et des fournitures pour la préparation du milieu de culture est répertorié dans le tableau 1 italiques codes alphanumériques entre parenthèses renvoient à l'équipement détaillé dans le tableau 2 et la figure 1..

  1. Préparer 5 L de la Marine phototrophe (MP) moyen (appelé ci - après «moyen») suivant le protocole de Wu et al. 16. Ajuster le pH à 6,8 en utilisant du HCl anoxique et stérile 1 M ou 0,5 NaCO 3. En tant que source de Fe (II), ajouter 3,5 ml d'une anoxie 1 M stérile et FeCl 2 -solution pour atteindre une finale de Fe (II) une concentration de 500 pm après filtration de la solution de milieu dans l'étape suivante.
  2. Conserver la solution moyenne à 5 ° C pendant 48 heures afin de précipiter Fe (II) carbonate et de phosphate minéraux. Fe (II) et Fe addition des résultats de précipitation minérale dans un pH changement, donc réajuster le pH à 6,8. Filtrer le milieu dans une anoxie (100% N 2) glovebox à travers une unité de 0,22 um filtre. Répartir le milieu filtré dans un 5 L flacon stérile en verre (E.'1) à l' intérieur d' une boîte à gants, et le bouchon avec un bouchon en caoutchouc butyle stérile.
  3. Purger l'espace de tête du flacon milieu avec de la N 2 / CO 2 (v / v 90/10) en insérant une aiguille à usage unique raccordée à la conduite de gaz dans le bouchon, et une seconde aiguille qui agit comme un évent. Assurez-vous de modifier le volume de l'espace libre 10 fois. Par exemple, avec un débit de gaz constant de 10 ml / sec, rincer le volume de l' espace libre de 50 ml pendant au moins 50 sec (comparer Hungate et Macy 17).
  4. Couvrir la bouteille moyenne (E) qui est maintenant prêt à utiliser avec du papier d'aluminium et conserver à la température ambiante dans des conditions sombres pour empêcher photooxydation de Fe (II). Attendre 3 jours pour la préparation moyenne.

2. Préparation de la culture

"> Note:.. La culture de Synechococcus sp PCC 7002 qui est utilisé dans l'expérience de la colonne est décrite comme marine unicellulaire cyanobactérie photohétérotrophes genre 18 Il a été fourni par le Dr M. Eisenhut (Institut de biochimie végétale, Université de Düsseldorf, Allemagne) . Pour l'étude actuelle de la culture du stock a été cultivé sur un milieu anoxique MP sans Fe supplémentaire (II).

  1. Préparer 100 ml de milieu MP suivant le protocole de Wu et al. 16 , mais le chlorure ferrique substitut avec 1 ml / L ferrique citrate d'ammonium à 6 mg / ml.
  2. Dans des conditions anoxiques (glovebox, 100% N 2), distribuer le milieu dans un 120 ml de bouteilles de sérum stérile, chapeau avec un bouchon en caoutchouc butyle stérile et à sertir avec une capsule en aluminium. Changer l'espace libre à N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) (comparer Hungate et Macy 17) et inoculer avec 5% de la culture du stock. Ensuite stocker la culture dans un incubateur de lumière à 25 ° C et 600 Lux à partir d'un Tungsten ampoule.
  3. Depuis Synechococcus sp. PCC 7002 est photosensible, après le transfert, couvrir la bouteille de sérum avec une mince serviette en papier pour les 24 premières heures au sein de l'incubateur lumière. Permettre à la culture à croître pendant 6-8 jours. activité photosynthétique se traduira par l'oxydation de Fe (II) et Fe (II) ne sera pas statique pour l'échelle de temps de la croissance cellulaire, par conséquent, le transfert de la culture au bout de 7 jours pour maintenir le Fe (II) dans le milieu et les cellules adaptées à Fe (II).
  4. Surveiller la densité des cellules par prélèvement d' échantillons pour la densité optique (DO) des mesures: La densité cellulaire (cellules / ml) de la culture peut être déterminée par l'absorbance de l'échantillon de suspension cellulaire dans un photo-spectromètre à une longueur d'onde de 750 nm 19. Une relation linéaire entre OD 750 et le nombre de cellules microscopiques directes d'une culture en phase logarithmique déterminera la densité cellulaire absolue 20.
  5. Dès qu'une densité de cellules de 8 à 10 cellules / ml est atteinte,envelopper la bouteille de sérum avec une feuille d'aluminium afin d'arrêter la production d'oxygène par photosynthèse.
  6. Retirer le joint 2 dans la suspension de cellules à l'aide d' un filtre à seringue stérile de 0,22 um fixée à une longueur (100 mm) de l' aiguille jetable introduite dans le milieu liquide. Purger l'espace de tête et de la bulle de la culture avec N 2 / CO 2 pendant 5 min (comparer Hungate et Macy 17). Conserver l'échantillon dans l'obscurité jusqu'à ce que l'inoculation dans la colonne.

3. Préparation des articles et des pièces individuelles pour Experimental Set-up

Remarque: les informations sur l'équipement requis pour le montage expérimental, les quantités et les spécifications sont énumérées dans le tableau 2.   Une partie des éléments qui seront utilisés pour le montage expérimental sont préparés à l' avance et sont étiquetées individuellement avec une seule lettre majuscule (AG), énumérés dans le tableau 2 et présentés comme des gros plans en Figure 1 ainsi. italiques codes alphanumériques entre parenthèses dans le protocole se rapportent à l'équipement détaillé dans le tableau 2 et sont présentés dans la figure 1.

  1. Afin de préparer les ports d'échantillonnage (D) pour la colonne, fermer les ports avec des bouchons en caoutchouc butyle moulants (A.3). Insérer une aiguille en acier inoxydable (D ') dans le bouchon en caoutchouc butyle. Assurez-vous que la pointe de l'aiguille se trouve dans le centre de la colonne.
    1. Connectez l'aiguille à un tube en caoutchouc (D.2) et sceller la connexion avec un tube thermorétractable (D.3). Attachez l'autre extrémité du tube à un petit connecteur luer de tube de verrouillage ( 'D.5), sceller la connexion avec un tube thermorétractable (D.3) et couvrir le connecteur de tube avec un capuchon en plastique approprié (D.6) .
      Remarque: En fonction du nombre souhaité de ports d'échantillonnage, il est nécessaire de fournir un port principal avec divers ports d'échantillonnage - therefore insérer les aiguilles en acier inoxydable (D.1) dans un angle oblique dans le bouchon en caoutchouc butyle.
  2. Afin de relier les bouteilles de moyennes et de décharge à la colonne, modifier des bouchons en caoutchouc butyle suivant les étapes suivantes:
    1. Insérer deux capillaires en acier inoxydable (E.3, E.4) dans le bouchon en caoutchouc butyle (E.2). Raccorder les tubes en caoutchouc appropriés (E.6) à ces capillaires et sceller la connexion avec des tubes de chaleur-rétractable (E.5).
    2. Ajouter un connecteur tubulaire (E.7) à l'autre extrémité du tube capillaire de la plus longue (E.3) et fixe aussi ce connecteur avec un tube thermo-rétractable (E.5).
    3. Connecter une aiguille en acier inoxydable (E.11) à l'extrémité libre de l'autre tube capillaire fixé à la plus courte (E.4), l' étanchéité des raccords avec les tubes thermorétractables (E.5), et insérer l'autre extrémité de la l' aiguille d'acier inoxydable dans un bouchon en caoutchouc butyle inférieure (E.10).
    4. Insérez deux capillaires en acier inoxydable (G.3) dans un bouchon en caoutchouc butyle grand (G.2) et fixer les tubes appropriés en caoutchouc (G.4; G.5). Connectez l'extrémité libre du tube de caoutchouc plus court (G.4) à une bouteille capillaire de décharge moyen (w2). Doter l'extrémité libre du tube plus long (G.5) avec un petit connecteur de tube (G.6). Répétez ces étapes afin de préparer un autre bouchon en caoutchouc butyle pour une deuxième bouteille de décharge.
  3. Préparer le bouchon pour le panneau de distribution moyen (F) en insérant deux aiguilles en acier inoxydable (F.3) dans un bouchon en caoutchouc butyle (F.2) afin de produire deux médias les lignes d'alimentation de la colonne. Fixer un tube en caoutchouc (F.4) pour chacune des aiguilles et raccorder une bouteille capillaire moyenne (c1) à l' un des tuyaux en caoutchouc, respectivement.
  4. Afin de préparer les glandes de la ligne moyenne d'alimentation (B), connecter un supportcapillaire d'alimentation (C2) à un petit raccord tubulaire (B.3) avec un tube en caoutchouc (B.4). Répétez cette étape pour une autre glande d'alimentation en fluide.
    1. Utilisez le capillaire de décharge plus moyenne (w1) au lieu de préparer les glandes de la ligne de décharge moyenne et suivez les étapes précédentes (comparer (B) dans la figure 1).
      Remarque: Il est utile d'étiqueter entrée et de sortie avec différentes couleurs de ruban adhésif pour aider à un assemblage correct.
  5. Assembler les pièces pour le panneau d'échange de gaz d'espace de tête (C) en insérant deux longues luer lock aiguilles en acier inoxydable (C.2) dans un tube en caoutchouc (C.1) et assurez - vous que les pointes des aiguilles atteignent 4 cm à l' extérieur de l'autre extrémité du tube. Remplir le tube avec Polymers colle (C.8) et laisser l'ensemble sécher pendant au moins 6 heures.
    1. Librement remplir deux seringues luer de verre de verrouillage (C.3) avec du coton (C.4).
    2. préparer séparément deux rub de butyleber butées (c.5), l' un avec une aiguille en acier inoxydable inséré (C.6) et l'autre avec une aiguille en acier inoxydable (C.7). Ne pas se connecter à des seringues en verre, encore.
  6. Préparer une seringue en verre (E.8) rempli avec du coton (E.9) pour une utilisation ultérieure en conformité avec la bouteille et le gaz paquet moyen (gp).
  7. Assembler l'équipement pour un pack de gaz de 10 L (gp) en raccordant un tube en caoutchouc (gp.1) sur la valve du bloc de gaz. Insérer un connecteur tubulaire (gp.2) dans l'extrémité libre du tube en caoutchouc. Répétez cette procédure pour un deuxième paquet de gaz de 10 L.

4. La stérilisation de la colonne et l'équipement

Remarque: En fonction des propriétés des matériaux, le matériel est stérilisé par l'une des trois méthodes suivantes:

  1. Stériliser équipement en verre par four à sec (180 ° C pendant 4,25 h):
    1. Stériliser l'équipement pour la fabrication de support (voir Tableau 1 et à la section 1.2) séparément et à l' avance. Par conséquent, préparer 2 x 5 L bouteilles en verre et couvrir l'ouverture et le goulot d'étranglement avec une feuille d'aluminium. Pack de 4 x 5 ml et 5 x 2 pipettes ml de verre dans un récipient résistant à la chaleur et le four-stériliser tous les équipements.
    2. Stériliser l'équipement pour la colonne mis en place dans une seconde étape. Envelopper les seringues en verre (C.3; E.8; F.1 - préparé à la section 3) avec une feuille d'aluminium et assurez - vous que les bouchons en caoutchouc butyle correspondants sont supprimés.
    3. Placez les perles de verre (A.2) dans un bêcher en verre et couvrir le dessus avec une feuille d'aluminium. Également couvrir la plaque transparente de verre (A.4), 4 x gros connecteurs de tube (B.2) et le connecteur 3 voies (G.7) ​​avec une feuille d'aluminium et tout au four stériliser.
  2. Stériliser plastiques et liquides autoclavables par autoclave (120 ° C, 10 bar, 20 min):
    1. Dans la première étape, sterilize le ballon Widdel avec le milieu, la solution de NaHCO 3 -buffer et des bouchons en caoutchouc butyle 2 pour la 5 L bouteille en verre.
      Remarque: bouchons en caoutchouc butyle sont d'abord préparés en faisant bouillir dans de l'eau ultrapure 3 fois et ensuite autoclaves dans un bêcher en verre avec un peu d'eau, recouverts d'une feuille d'aluminium. Les bouchons humides sont plus faciles à insérer dans des bouteilles en verre.
    2. Dans une deuxième étape de stériliser l'équipement pour la colonne expérimentale mise en place. Afin de préparer la colonne pour la stérilisation dans l'autoclave, envelopper l'ouverture supérieure, les évents d'approvisionnement des médias, les évents de décharge des médias, et l'espace de tête de ventilation avec du papier d'aluminium avant autoclavage.
    3. Couvrir les ports d'échantillonnage (D.'5) avec les bouchons en plastique appropriés (D.'6) et assurez - vous d'enlever les pinces (D.4) avant autoclavage.
    4. Envelopper les bouchons en caoutchouc butyle et les capillaires correspondants pour les bouteilles de moyennes et de décharge (E.2; 2 x G.2 - i préparén section 3), les petits bouchons pour les seringues en verre (2 x C.5; E.'10 '; F.'2 - préparé à la section 3) et les capillaires raccordé à l'alimentation et d' évacuation des glandes moyennes (s2; w1 - préparé dans la section 3.4) dans une feuille d'aluminium et stériliser tous les équipements dans l'autoclave.
    5. Après stérilisation, on sèche la colonne et du matériel stérilisé dans un four à 60 ° C pendant encore 4 heures.
  3. Depuis le tuyau de pompe (pt) est non autoclavable, les stériliser dans un éthanol (EtOH) solution (80% EtOH, 20% d' eau). Remplir un récipient approprié avec une solution EtOH et placer le tuyau de pompe en elle, en assurant que le tube est complètement rempli de solution d'EtOH. Prenez après 3 h et envelopper directement dans une feuille d'aluminium pré-stérilisé (four-stérilisé) et laisser sécher à la température ambiante pendant 2 heures.

5. Assemblée de la colonne et de l'équipement

  1. Placer la colonne (A) sur une surface plane et se stabiliser avec un support de laboratoire et des pinces. Assurez - vous de travailler dans des conditions stériles (par exemple, dans 40 cm d'un brûleur Bunsen ou sous une hotte à flux laminaire). Retirez délicatement la feuille d'aluminium à partir de l' ouverture supérieure et remplir les perles de verre stérilisés (A.2).
    1. Préparer le verre de montre (A.4) afin de fermer hermétiquement la colonne en appliquant la Polymers colle (A.5) à la surface intérieure dans la zone où il sera en contact avec la colonne. Appuyez légèrement sur le verre de la montre en place au sommet de la colonne afin de coller les deux parties étroitement ensemble. Prévoyez au moins 6 heures pour l'installation à sécher.
      Note: Il est possible de placer un fil souple fin stérile entre le bord de la colonne et le verre de la montre, afin d'enlever facilement le verre de la montre après l'expérience.
  2. Tout en travaillant dans des conditions stériles joindre les pièces suivantes à la colonne:
    1. Raccorder les tubes en caoutchouc (B.1) et les connecteurs de tube correspondant (B.2) à l'alimentation et d' évacuation des évents moyennes (comparer (B) dans la figure 1).
    2. Branchez les connecteurs de tube des glandes (B.3) pour l' alimentation des médias et de décharge (préparé dans la section 3.4) aux connecteurs correspondants à la colonne (comparer (B) dans la figure 1).
    3. Fixez le panneau d'échange de gaz de l' espace libre (comparer (C) de la figure 1 - préparé dans la section 3.5) à l'espace de tête de ventilation à la colonne et raccorder les seringues en verre (C.3) aux aiguilles correspondantes en acier inoxydable (C.2) et insert les bouchons appropriés en caoutchouc butyle (C.6; C.7 - préparés dans la section 3.5.2) dans les seringues en verre coton-rempli (C.3).
  3. Insérer le bouchon en caoutchouc butyle pour les bouteilles de décharge (2 x G.20; - préparé dans la section 3.2) en deux 3 bouteilles L en verre stériles (G.1), et relier les connecteurs de tube des bouteilles (G.6) au connecteur 3 voies (G.7).
  4. Connecter l'extrémité libre de la glande capillaire (w1) de décharge moyenne à l'extrémité libre d'un élément capillaire de la bouteille de décharge (w2) avec un tube de pompe (pt). Répétez cette procédure pour le second milieu capillaire de la glande de décharge et la seconde bouteille de décharge.
  5. Raccorder l'extrémité libre d'un capillaire de bouteille moyen (S1) à l'extrémité libre de la glande capillaire (s2) d'alimentation en fluide avec le tube de pompe (pt). Répétez cette procédure pour le second capillaire de bouteille moyen et le second milieu capillaire de la glande d'alimentation.
  6. Assemblez le panneau de distribution moyenne en insérant le bouchon avec les capillaires correspondants (F.2 - préparé dans la section 3.3) dans la seringue en verre du milieupanneau de distribution (F.1).
  7. Connectez le panneau de distribution moyenne au connecteur du bouchon en caoutchouc butyle pour la bouteille moyenne (E.7 - comparer F dans la figure 1).
  8. Connectez la ligne 2 du gaz N 2 / CO dans le panneau d'échange de gaz de l' espace libre à l'Luer aiguille en acier inoxydable (voir la position (LLF) dans la figure 1), et rincer l'installation de la colonne et le système capillaire avec N 2 / CO 2 à basse pression (<10 mbar). Maintenir une sortie de gaz au niveau des extrémités ouvertes du capillaire de la bouteille moyenne (E.3), le connecteur 3 voies (G. 7), et les ports d'échantillonnage (D.5). Par conséquent, assurez - vous d'avoir les bouchons des ports d'échantillonnage (D.6) légèrement ouvertes, pour maintenir des conditions stériles par une surpression de gaz sortant.
    1. Rincer l'installation complète pendant au moins 20 min.
      Remarque: En outre, il est possible de fermer le outgassiaiguille ng (C.6) du panneau d'échange de gaz d'espace de tête avec un tube en caoutchouc approprié et une pince afin d'augmenter l'efficacité du rinçage de l'installation complète.
  9. Pendant ce temps, remplir un sac à gaz de 10 L (gp) avec N 2 / CO 2 (v / v, 90/10), après 10 tours de remplissage et de désaération ( en utilisant une pompe à vide) la totalité du volume pour assurer le sac est complètement anoxique . Assurez-vous de fermer la vanne du bloc de gaz après le remplissage final. Répétez cette procédure avec un second bloc de gaz , mais fermer le robinet après désaération (ie, le laisser vide).
    Remarque: le N 2 / CO 2 rempli de gaz paquet sera relié à la bouteille moyen pour compenser l'augmentation du volume d'espace de tête en raison de la perte moyenne par pompage. Le N 2 / CO 2 rincée, mais vide paquet de gaz, sera ultérieurement reliée aux bouteilles de décharge afin de permettre au gaz d'échapper à l'espace libre en raison de l' augmentation du volume de décharge de liquide.
  10. Insérer til bouchon en caoutchouc butyl (E.10 - préparé dans la section 3.2.3) dans la seringue stérile en verre rempli de coton (E.8 - préparé dans la section 3.6).
  11. Placez la bouteille moyenne rempli et fermé (E - préparé à la section 1) sur le banc de laboratoire à côté du bouchon pour la bouteille moyenne (E.2), et se préparer à connecter le bouchon à la bouteille moyenne en utilisant la procédure suivante:
    1. Fermer le flux de gaz N 2 / CO 2 dans le capillaire (E.3) en fermant le tube en caoutchouc correspondant (E.5) avec un collier de serrage.
    2. Soulever légèrement le bouchon en caoutchouc butyle de la bouteille moyenne et rincer l'espace libre avec N 2 / CO 2 (50 mbar) en accrochant un stérilisée, le coton seringue -filled avec un penchant, longue aiguille métallique (1 mm x 140 mm) dans le goulot d' étranglement de la bouteille moyenne (comparer Hungate et Macy 17).
    3. Retirez rapidement le bouchon en caoutchouc butyle de la bouteille moyenne et insérer le bouchon en caoutchouc butyle préparée (E.2) dans la bouteille moyenne (E).
    4. Changer l'aiguille de la seringue (précédemment utilisé pour le rinçage de l'espace de tête) à une aiguille jetable de métal de longueur (0,9 mm x 45 mm, largement disponible) et les injecter dans le bouchon afin de purger l'espace de tête du flacon milieu avec de la N 2 / CO 2.
    5. Assurez - vous d'avoir un léger écoulement de gaz à l'extrémité ouverte de la seringue de gaz (E.8 - assemblé à la section 5.10) reliée au bouchon de la bouteille moyenne. Purger l'espace de tête du flacon milieu (E) et de la seringue en verre (E.8) pendant au moins 4 minutes.
  12. Pendant ce temps, serrer les bouchons en plastique (D.6) des ports d'échantillonnage (D.'5) et fermer le tube en caoutchouc correspondant (D.2) avec une pince (D.4).
    Remarque: Si nécessaire, ouvrez leaiguille de dégazage (C.6) du panneau d'échange de gaz headspace à nouveau afin de maintenir une sortie de gaz à l'extrémité ouverte de l'aiguille.
  13. Placez le bloc de gaz de 10 L, rempli de N 2 / CO 2 (préparé à la section 5.9), sur le banc de laboratoire. Assurez -vous que le raccord de tube se trouve dans une position à côté de l'extrémité ouverte de la seringue en verre (E.8) relié à la bouteille moyenne.
  14. Après le rinçage du headspace de la bouteille moyenne (E) pendant au moins 4 min, fermer la ligne de la seringue de rinçage de gaz N 2 / CO 2 et retirez rapidement l'aiguille d'injection sur le bouchon (E.2). La surpression restante du gaz dans l'espace libre de la bouteille moyenne sera libérée par la seringue de verre (E.8).
    1. Ouvrir rapidement le robinet du bloc de gaz et appuyer légèrement sur ​​le sac pour maintenir une sortie de N 2 / CO 2 afin de vider le tube et le connecteur du bloc de gaz.
    2. Dès que la surpression est libéré de la bouteille moyenne, connecter rapidement le connecteur du bloc de gaz (gp.3) sur le connecteur correspondant de la seringue en verre (E.8).
  15. Connectez un pack vide 10 L de gaz (gp) qui a déjà été purgé 10 fois avec N 2 / CO 2 (préparé à la section 5.9) au port libre du connecteur 3 voies (G.7) ​​connectés aux bouteilles de décharge. Assurez-vous de maintenir la vanne du bloc de gaz fermé.
  16. Réduire la pression de la ligne N 2 / CO 2 gazeux (<0,1 mbar) dans le panneau d'échange de gaz d'espace de tête (C sur la figure 1, la position LLF) pour maintenir une sortie de gaz à partir de l'aiguille de dégazage (C.6).
  17. Insérez le tuyau de pompe (pt) dans la pompe (P) et retirer le collier de serrage du tube de caoutchouc correspondant (E.6) de la bouteille moyenne (E).
    1. Ouvrez la vanne du bloc de gaz (gp)relié aux bouteilles de décharge (G) pour permettre à l' air d'être libéré dans l'emballage de gaz , tandis que les bouteilles de décharge se remplissent avec du milieu d'écoulement.
  18. Démarrer la pompe et surveiller le panneau de distribution moyen (voir (F)) remplir avec le milieu. Assurez-vous de retirer le gaz restant dans le panneau comme il se remplit en le tenant dans une position inversée. Le gaz est libéré à travers les capillaires qui sont reliés à la pompe.
  19. Surveiller la colonne telle qu'elle remplit de moyenne, et d' ajuster la pompe à un débit de pompage adéquat de 0,45 L / j, ce qui peut être converti en un flux vertical mM de Fe 10 (II) / m 2 / j, de manière à simuler le flux chimique d'intérêt.
  20. Installer la source de lumière (L) , 2 cm au- dessus de l'extrémité supérieure de la colonne et couvre les 10 cm supérieurs autour de la colonne avec une bande foncée et / ou une feuille d'aluminium afin d'éviter que la lumière rayonnant de la partie supérieure de la colonne et éclairer la partie inférieure de la colonne. Couvrir l'ensemblel'installation d'un revêtement textile noir, afin d'empêcher l'éclairage de la colonne à partir des sources de lumière externes.

6. L'inoculation de bactéries dans la colonne

Remarque: Pour une expérience de contrôle abiotique cette étape est ignorée.

  1. Étant donné que la culture cellulaire sera directement injecté dans la colonne à travers les bouchons en caoutchouc butyle des principaux ports d'échantillonnage le long du côté de la colonne, assurez-vous d'avoir préparé six seringues avec des aiguilles qui sont assez long pour atteindre le centre du corps de colonne.
  2. Stériliser à l'extérieur des bouchons en caoutchouc butyle de six orifices d'échantillonnage principales à la colonne (A.3) avec une solution d' EtOH (80%).
  3. Avoir la bouteille de sérum avec la culture pour l'inoculation prêt (préparé à l'article 2) et stériliser le bouchon en caoutchouc butyle par flambage quelques gouttes de solution EtOH. Rincer la seringue avec stérile N 2 / CO 2 avant de prendre une aliquote de la culture. Prendre 1 ml of la solution de cellules anoxie et l' injecter dans le centre de la colonne à travers les bouchons en caoutchouc butyle de ports principaux d'échantillonnage (A.3).
    Remarque: En fonction de la croissance bactérienne, il peut être nécessaire d'ajuster le débit de pompage (ou même arrêter le pompage) au cours des premiers jours de la phase de latence pour la croissance cellulaire et le développement pour empêcher les cultures d'être lavé.

7 . Échantillonnage

Remarque: Afin de recueillir des échantillons à travers les gradients chimiques qui se développent à l'intérieur de la colonne, il est nécessaire de commencer l'échantillonnage à partir des ports d'échantillonnage supérieurs avant les ports plus profonds, comme la perte de volume se produit. Assurez - vous de maintenir des conditions stériles (par exemple, en travaillant dans 40 cm d'un brûleur Bunsen ou sous une hotte à flux laminaire).

  1. Recueillir les premiers échantillons de 24 heures après l'inoculation. Rincer la seringue qui sera utilisé pour l' échantillonnage avec le N stérile 2 / CO 2, afin d'éviter l' injection d'oxygène dans la SAmpling ports (D). Assurez - vous de remplir la seringue avec N 2 / CO 2 avant l' échantillonnage.
  2. Retirez rapidement le bouchon en plastique (D.6) et insérez la seringue d'échantillonnage dans le connecteur de tube (D.5). Maintenir un petit espace entre la seringue et le connecteur de tube. Libérer le gaz contenu dans la seringue et rincer le raccord de tube avec N2 / CO 2.
    1. Raccordez fermement la seringue au connecteur de tube. Retirer la pince (D.4) et commencer à prendre un échantillon d'environ 1 ml.
  3. Après avoir dessiné l'échantillon et avant de retirer la seringue, fixer la pince (D.4). Ensuite , retirer la seringue d'échantillonnage et fermer fermement le connecteur de tube (D.5) avec le capuchon en plastique correspondant (D.6).
  4. répéter immédiatement des mesures 7,1-7,3 pour l'échantillonnage de chaque port.
  5. Collecter la prochaine série d'échantillons toutes les 24 heures.
    Remarque: Pour les échantillons supplémentaires à différentes étapes de temps, il est nécessaire d'enlever un petit hontant de l' échantillon (par exemple, 0,2-0,4 ml) d' abord avant que l'échantillon peut être pris, afin d'éliminer les médias résiduels à l' intérieur du tube d'échantillonnage et pour obtenir des échantillons représentatifs à partir de l' intérieur de la colonne.

8. Méthodes d'analyse

  1. Quantification de l' oxygène:
    Remarque: La concentration en oxygène dans le milieu d'écoulement et l'espace de tête de la colonne est quantifiée de façon non invasive et non destructive utilisant les capteurs d'oxygène optiques et sensibles à l'oxygène fluorescent taches de feuilles de 0,5 cm x 0,5 cm (ce qu'on appelle optodes), collé le long d' la paroi de verre intérieure de la colonne à l' aide de la colle de silicium (A.6). On a veillé à ce que les taches sensibles à l'oxygène de feuille ne sont pas sensibles aux espèces Fe afin d'obtenir des mesures fiables.
    1. Assurez-vous de calibrer le logiciel de l'ordinateur avec les paramètres d'étalonnage appropriés pour les optodes qui sont utilisés dans la colonne. Les capteurs optiques d'oxygène viennent avec un calibrat spécifiqueion pour la mesure à l'aide d'une fibre optique de mesure de l'oxygène commandé par PC correspondant.
    2. Lancer la mesure et de prendre soin de tenir la fibre optique polymère de la mesure de l'oxygène à un angle droit de la feuille sensible à l'oxygène qui est collée à l'intérieur de la paroi de verre transparent de la colonne.
    3. Répétez la mesure pour chaque point O 2 unique de mesure dans toute la colonne.
  2. Fe (II) et Fe total analyse d'échantillons aqueux:
    1. Etant donné que Fe (II) est rapidement oxydé par l'oxygène dans l'air à un pH neutre, de stabiliser les échantillons liquides pour le Fe (II) la quantification aqueuse immédiatement dans une solution de HCl 1 M. Pour un volume d'échantillon final de 1 ml mélanger 0,5 ml échantillon liquide avec HCl 0,5 ml 2.
    2. Quantifier Fe total après incubation d'une aliquote de l'échantillon 1 M de HCl stabilisé avec du chlorhydrate d'hydroxylamine (10% en poids / volume dans HCl 1 M) pendant 30 min. Ce réactif réduit tout le Fe (III) en Fe (II), qui peut ensuite être quantifié par le test Ferrozine 21.
    3. Effectuer un Ferrozine dosage en utilisant un lecteur de plaque micro-titre. Mesurer l'absorbance à une longueur d'onde de 562 nm. Assurez-vous d'avoir des normes au sein de la gamme pour détectable Fe (II) et les concentrations totales Fe.
      Remarque: Si les concentrations en Fe dans l'échantillon liquide excède calibrages standard, il est nécessaire de diluer l'échantillon stabilisé avec 1 M de HCl.
    4. Calculer la concentration en Fe (III) par la différence entre le total de Fe et de Fe (II).

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Résultats

expérience de contrôle

Expériences de contrôle abiotique (10 jours) ont démontré des concentrations toujours faible teneur en oxygène (O 2 <0,15 mg / L), sans fluctuations importantes du Fe (II) -profile dans toute la colonne d'eau d'upwelling. La formation de précipités (probablement Fe (III) (oxyhydr-) oxydes) dans le réservoir de fluide et la légère diminu...

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Discussion

Les communautés microbiennes dans l'océan Précambrien ont été réglementés par, ou modifiés en raison de leur activité et les conditions géochimiques existantes. En interprétant les origines de BIF, les chercheurs déduisent généralement la présence ou l' activité des micro - organismes sur la base du sédimentologie ou géochimie des BIF, par exemple, Smith et al. 23 et Johnson et al. 24. L'étude des organismes modernes dans des environnements modernes qui ont de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Mark Nordhoff a aidé dans la conception et la mise en œuvre des branchements. Ellen Struve a aidé à sélectionner et acquérir de l'équipement utilisé.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacon Widdel (5 L)Ochs110015labor-ochs.de
Flacons en verre (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
Pipettes en verre (5 ml)51714labor-ochs.de
0.22 µ ; m Unité de filtration Steritop (0,22 et micro ; m Membrane en polyéthersulfone)MilliporeX337.1carlroth.com
Feuille
Seringue stérile en verre Luer Lock, remplie de cotonC681.1carlroth.com
Aiguilles Luer Lock en acier inoxydable (150 mm, 1,0  ; mm ID)201015labor-ochs.de
NaClSigma433209sigmaaldrich.com
MgSO4Sigma208094sigmaaldrich.com
CaCl2SigmaC4901sigmaaldrich.com
NH4ClSigmaA9434sigmaaldrich.com
KH< sub>2PO4SigmaP5655sigmaaldrich.com
KBrSigmaP3691sigmaaldrich.com
KClSigmaP9541sigmaaldrich.com
CylindreY310.1carlroth.com
Laine de7377.2carlroth.com
Perles de verre (ø ; 0.55 - 0.7& nbsp ; mm)11079105biospec.com
Bouchon en caoutchouc butyle (ø ; 1,2 cm)271024labor-ochs.de
boîte de Pétri, verre (ø ; 8,0   ; cm)T939.1carlroth.com
ColleOTTOSEAL S68adchem.de
Feuille de capteur d’oxygène optique (pour l’analyse de l’oxygène, voir ci-dessous)&ndash ; sur demande &ndash ;presens.de
Tube en caoutchouc (35 mm, 7  ; mm ID)770350labor-ochs.de
Connecteur de tube Luer Lock (3,0 mm, Luer lock mâle = LLM)P343.1carlroth.com
Connecteur de tube Luer Lock (3,0 mm, Luer lock femelle = LLF)P335.1carlroth.com
Tube en caoutchouc (25 mm, 0,72 mm ID)2600185
newageindustries.com Tube en caoutchouc (50 mm, 7  ; mm ID)770350labor-ochs.de
Aiguille Luer Lock en acier inoxydable (150 mm, 1,0 mm ID)201015labor-ochs.de
Seringue en verre Luer Lock (10 ml)C680.1carlroth.com
Coton en vrac  ;&ndash ;
Bouchon en caoutchouc butyle (ø ; 1,75 cm)271050labor-ochs.de
Aiguille en acier inoxydable (40 mm, 1,0  ; mm ID)Sterican4665120bbraun.de
Aiguille en acier inoxydable Luer Lock (150 mm, 1,5 mm ID)201520labor-ochs.de
position : Pièce de connecteur femelle Luer Lock chez C.7
ColleOTTOSEAL S68adchem.de
Aiguille en acier inoxydable (120 mm, 0,7 mm ID)Sterican4665643bbraun.de
Tubes en caoutchouc (40 mm, 0,74 mm ID)2600185newageindustries.com
Gaines thermorétractables (35  ; mm, 3 mm ID rétréci541458 - 62conrad.de
Collier de serrageSTHC-C-500-4tekproducts.com
Connecteur de tube Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Bouchon en plastique Luer Lock (LLM)CT69.1carlroth.com
Bouteille en verre (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
Bouchon en caoutchouc butyle (pour GL45)444704labor-ochs.de
Capillaire en acier inoxydable (300 mm, 0,74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
Capillaire en acier inoxydable (50 mm, 0,74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
Gaine thermorétractable (35 mm, 3  ; mm ID rétréci541458 - 62conrad.de
Tube en caoutchouc (100 mm, 0,74 mm2600185 newageindustries.com
tube Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Seringue en verre Luer Lock (10 ml)C680.1carlroth.com
Coton en vrac  ;&ndash ;
Bouchon en caoutchouc butyle (ø ; 1.75 cm)271050labor-ochs.de
Aiguille en acier inoxydable (40 mm, 0.8  ; mm ID)SeringueSterican 4657519bbraun.de
Luer lock (5 ml)C679.1Bouchon en
caoutchouc butyle carlroth.com (ø ; 1,75 mm)271050labor-ochs.de
Tube en caoutchouc (40 mm, 0,74 mm ID)2600185newageindustries.com
Flacon en verre (2 L)RotilaboX716.1carlroth.com
Bouchon en caoutchouc butyle (pour GL45)444704labor-ochs.de
Capillaire en acier inoxydable (50 mm, 0,74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
Tube en caoutchouc (30 mm x 0,74 mm ID)2600185Tube en
caoutchouc newageindustries.com (100 mm x 0,74 mm ID)2600185Connecteur de
tube Luer Lock newageindustries.com (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Luer Lock Connecteur 3 voies (LLF, 2x LLM)6134cadenceinc.com
Source lumineuseSamsungSI-P8V151DB1USsamsung.com
Pompe péristaliqueIsmatecEW-78017-35coleparmer.com
Tube de pompage (0.89  ; mm ID)EW-97628-26coleparmer.com
Capillaire en acier inoxydable (200 mm, 0,74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
Capillaire en acier inoxydable (400 mm, 0,74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
Bloc de gaz Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) (10 L)30240-U
sigmaaldrich.com Tube en caoutchouc (30 mm, 6  ; mm ID)770300labor-ochs.de
Connecteur de tube Luer Lock (3,0 mm, LLM)P343.1carlroth.com
Connecteur de tube Luer Lock (3,0 mm, LLF)P335.1carlroth.com
Seringue étanche au gaz (20  ; ml)C681.1carlroth.com
bec&ndash ;
Oxygénomètre à fibre optique pour la quantification de l’oxygènePresensTR-FB-10-01presens.de
Pompe&ndash ;
Colle silicone pour optodes d’oxygènePresensPS1presens.de
d’aluminium de verre verre polymères polymères ))Connecteur de en verre Bunsen à vide

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