Article de méthode

Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

DOI :

10.3791/54252

⸱

8 octobre 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

Dans cet article

Résumé

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du tissu cardiaque humain héberge des populations de cellules précurseurs pluripotentes périvasculaires qui peuvent être appropriés pour la régénération du myocarde. La technique décrite ici permet l'isolement et la purification simultanée de deux populations de cellules stromales pluripotentes associées aux vaisseaux sanguins d' origine, c. -à- CD146 + CD34 - péricytes et les cellules CD34 + CD146 - cellules de l' adventice, du myocarde humain.

Résumé

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Les cellules souches/stromales mésenchymateuses multipotentes (CSM) ont été isolées de manière conventionnelle, grâce à leur adhérence plastique, des digestions des tissus primaires, tandis que leur localisation anatomique restait incertaine. La découverte récente de l’expression définie de marqueurs cellulaires périvasculaires et CSM par des cellules périvasculaires dans plusieurs tissus par notre groupe et d’autres chercheurs a fourni l’occasion d’isoler et de purifier de manière prospective des sous-populations homogènes spécifiques de cellules précurseurs périvasculaires multipotentes. Nous avons précédemment démontré l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour purifier les péricytes microvasculaires CD146+CD34- et les cellules adventives vasculaires CD34+CD146- des muscles squelettiques humains. Nous décrivons ici une méthode permettant d’isoler simultanément ces deux sous-ensembles de cellules périvasculaires du myocarde humain par FACS, basée sur l’expression d’un ensemble défini de marqueurs de surface cellulaire pour les sélections positives et négatives. Cette méthode met ainsi à disposition deux sous-populations spécifiques de cellules précurseurs cardiaques multipotentes de type CSM pour une utilisation dans la recherche fondamentale et/ou les investigations thérapeutiques.

Introduction

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Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotique. Cependant, des études récentes ont démontré la présence du chiffre d'affaires de cardiomyocytes limitée dans les cœurs humains adultes 1. Cellules autochtones souches / progénitrices avec cardiomyocytes potentiel de différenciation ont également été identifiés dans le myocarde chez les rongeurs adultes et les cœurs humains, y compris Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere formation et , plus récemment, les cellules précurseurs périvasculaires 2,3. Ces cellules représentent des candidats attrayants pour les thérapies visant à améliorer cardiaque réparation / régénération par la transplantation de cellules ou de stimulation de la prolifération in situ.

Mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) ont été isolés à partir de presque tous les tissus humains 4,5 essais cliniques des applications thérapeutiques de MSC ont été réalisées pour de multiples états pathologiques tels que la réparation cardiovasculaire 6, la réaction du greffon contre l'hôte maladie 7 , Et la cirrhose du foie 8. Les effets bénéfiques ont été attribués à la capacité des cellules souches mésenchymateuses à: la maison aux sites d'inflammation 9; différencier en types 10 de cellules différentes; sécréter des molécules pro-réparatrices 11; et moduler des réponses immunitaires 12 hôtes. L'isolement des cellules souches mésenchymateuses a toujours compté sur leur adhésion préférentielle à des substrats en plastique. Cependant, la population de cellules résultante est typiquement sensiblement hétérogène 13. En utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec une combinaison de marqueurs clés de cellules périvasculaires, nous avons été en mesure d'isoler et de purifier un multipotentes population précurseur MSC-like (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) à partir de de multiples tissus humains , y compris des adultes du muscle squelettique et la graisse blanche 14.

populations de cellules périvasculaires dans divers tissus non cardiaques se sont avérés avoir des propriétés souches / cellules progénitrices ae sont à l'étude pour une utilisation clinique dans le cadre cardiovasculaire. Péricytes, l' un des sous - ensembles les cellules périvasculaires les plus connus, sont une population hétérogène qui jouent plusieurs rôles physiopathologiques , y compris dans le développement de nouveaux vaisseaux 15, la régulation de la pression artérielle 16, et le maintien de l' intégrité vasculaire 17,18. Comme indiqué dans plusieurs tissus, des sous - ensembles spécifiques de péricytes expriment nativement des antigènes de MSC et de soutenir leurs phénotypes MSC comme dans la culture primaire après FACS purification 14. De plus, ces cellules maintiennent de manière stable leurs phénotypes à long terme au sein de la culture et présentent un potentiel de différenciation multi-lignée, semblable à MSCs 19,20. Ces résultats suggèrent que les péricytes sont une des origines du MSC insaisissable 14. Le potentiel thérapeutique des péricytes a été démontrée par une réduction de la cicatrisation du myocarde et l'amélioration de la fonction cardiaque après une transplantation dans lésé par une ischémiecoeurs 21. Récemment, nous avons purifié avec succès pericytes du myocarde humain et démontré leurs phénotypes MSC-like et multipotence (adipogenèse, chondrogenèse et ostéogenèse) avec l'absence de myogenèse squelettique 3. En outre, les péricytes myocardiques exposées différentielles capacités potentielles et angiogéniques cardiomyogéniques en comparaison avec leurs homologues purifiés à partir d'autres organes.

Une deuxième population de cellules souches / progénitrices multipotentes périvasculaires, la cellule adventice, a été isolé à partir de veines saphènes humaines sur la base de l' expression de CD34 positif 22. Les cellules de l' adventice veineuses ont été montrés comme ayant un potentiel clonogénique, la capacité de différenciation mésodermique et le potentiel pro - angiogénique in vitro. La transplantation de ces cellules dans les cœurs lésés par une ischémie des souris a entraîné une réduction de la fibrose interstitielle, une augmentation de l'angiogénèse et du flux sanguin myocardique, une réduction ventriculaire diltion, et l' éjection cardiaque augmenté la fraction 23. Fait intéressant, les cellules de l' adventice adipeux a été démontré que l' expression de perdre le CD34 et le CD146 upregulate expression dans la culture en réponse au traitement angiopoïétine II, ce qui suggère l'adoption d'un phénotype de péricytes avec une stimulation 24. À l'intérieur du coeur, cependant, la population de cellules de l'adventice n'a pas encore été purifiées par FACS de manière prospective et / ou bien caractérisée. En utilisant les procédures d'isolement cellulaire décrits dans les sections suivantes, nous sommes actuellement caractérisons cellules adventice du myocarde et d'enquêter sur leur potentiel pour les applications régénératives.

Nous décrivons ici un procédé pour isoler et purifier les deux sous-populations de cellules souches / progénitrices du myocarde périvasculaire adultes ou fœtaux humains. Cette méthode d'isolement cellulaire prospective permettra aux chercheurs d'obtenir des sous-ensembles de cellules souches / progénitrices périvasculaires isogéniques à partir de biopsies cardiaques humaines pour des études comparatives et further explorer leur potentiel thérapeutique dans divers états pathologiques cardiaques.

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Protocole

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1. Traitement des Cardiac Human Sample

  1. Veiller à ce que tous les fluides, les conteneurs, les instruments et la zone opérationnelle dédiée sont stériles.
  2. Placer l'échantillon de tissu cardiaque (acquis par la banque de tissus ou de l'équipe chirurgicale) dans un milieu de stockage composé de Eagle modifié le milieu de réfrigéré Dulbecco (DMEM) contenant 20% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) sur la glace 3 pour le transport.
  3. Retirer l'échantillon cardiaque à partir du support de stockage et laver avec un agent de lavage composé d'un tampon phosphate salin (PBS) supplémenté avec 2% de FBS et 1% P / S. Lors de la manipulation de l'échantillon, utilisez une pince fine à pointe pour saisir les grands navires ou péricarde et minimiser l'écrasement du myocarde.
  4. Immerger l'échantillon dans un milieu de lavage dans une boîte de Pétri et enlever le péricarde, l' endocarde et gros vaisseaux sanguins avec stérilisées iris ciseaux et des pinces à pointe fine comme décrit 3.
  5. Couper le reste myocardium en petits morceaux d'environ 1 mm 3 en utilisant une seule lame de rasoir de côté ou une paire de ciseaux pointus iris. Note: Les plus hauts rendements cellulaires seront obtenus si les échantillons sont traités immédiatement. Si le retard est inévitable, le stockage du tissu cardiaque traité dans le support de stockage fraîche (> 5 ml par 1 cm 3 de tissu) à 4 ° C pendant jusqu'à 72 heures est possible, cependant vraisemblablement avec une diminution associée au rendement cellulaire.

2. La digestion du tissu et des cellules d'isolement

  1. Fraîchement préparer la solution de digestion comprenant 1,5 ml chacune de collagénase I, collagénase II, et de la collagénase IV (tous à 0,5 mg / ml dans DMEM) et chaude à 37 ° C dans un bain-marie.
    Note: Le volume et la concentration de collagénase sont appropriés pour des échantillons d'environ 1 cm3.
  2. Filtrer les morceaux de tissu en suspension à travers un tamis de 100 um et laver deux fois avec du PBS. Transférer les morceaux de tissu dans un récipient de 30 ml stérilesun couvercle étanche.
    Remarque: pots larges courtes plutôt que de tubes hautes et étroites donnent de meilleurs résultats. Vous pouvez aussi mettre des morceaux de tissus dans un tube de 50 ml stérile et placer horizontalement si un conteneur de 30 ml ne sont pas disponibles.
  3. Ajouter toutes les solutions de digestion (4,5 ml au total) et placez le récipient dans un sac en plastique scellé dans un secouant bain à 37 ° C de l'eau fixé à 120 rpm. Sinon, sceller le récipient avec un film de paraffine et placer dans un agitateur orbital chauffé réglé à 120 rpm.
  4. Après 15 minutes, retirer et retourner le pot à trois reprises avant de remplacer pendant encore 15 min. Retirer et étancher les collagénases avec 5 ml de DMEM supplémenté avec 20% de FBS et 1% P / S.
  5. Triturer le digest par pipetage dix à vingt fois avec une pipette de 10 ml sérologique pour briser les mottes de tissus. Filtrer la suspension séquentielle à 100 um, 70 um et enfin 40 crépines de cellules um pour éliminer les matières non digérées et d'obtenir une suspension cellulaire unique.
    Remarque:Ne pas rincer entre crépines de cellules pour éviter la cellule debrisgenerated par le processus de digestion enzymatique.
  6. Centrifuger la suspension de cellules à 200 g pendant 4 minutes, décante avec soin le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges pendant 2 minutes à la température ambiante avant de le diluer avec 4 ml de milieu de lavage.
  7. Répéter l'étape de centrifugation et remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de lavage. Bien mélanger et prendre 10 pi de la suspension cellulaire pour le comptage des cellules.
  8. Mélanger 10 ul de la suspension cellulaire avec 10 pi de bleu trypan et de placer la tache 10 ul du mélange sur un hémocytomètre standard pour le comptage des cellules. Comptez le nombre de cellules lumineuses, rondes présents dans les quatre cases de coin (chacun subdivisé en seize petits carrés) et diviser par 4 pour obtenir la moyenne par carré de coin. Multipliez la moyenne de 2 pour tenir compte du facteur de dilution tache, puis par 10 4 pour obtenir le nombre total de cellules par 1 ml d'échantillon.

3. Étiquetage cellulaire et tri

  1. Ajouter 50 ul de sérum de souris à la suspension cellulaire et on incube à 4 ° C pendant 20 minutes pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique.
  2. Centrifuger la suspension de cellules avec du sérum de souris à 200 g pendant 4 mn, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de lavage à une concentration de 1 x 10 6 cellules par 100 pi.
  3. Aliquote de 50 ul de chaque suspension cellulaire pour le contrôle isotypique et non colorées en deux polystyrène à fond rond de cytométrie de flux des tubes puis placer le volume restant dans un troisième tube destiné à la coloration multi-couleurs.
  4. Ajouter CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, et des anticorps CD146-AF647 (tous 1: 100) à la suspension cellulaire unique pour multi-couleur coloration. Pour le contrôle isotypique, ajouter des volumes équivalents de PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- et des anticorps isotypiques AF647 conjugués. Doucement une pipette pour mélanger les anticorps avec les cellules et incuber tous les tubes à 4 ° C pendant 20min dans l'obscurité.
  5. Préparer des perles de commande de compensation en ajoutant une goutte de billes positives à 100 ul de milieu de lavage dans cinq polystyrène tubes ronds cytométrie de flux de fond. Ajouter CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, PerCP-CD144-Cy5.5 et des anticorps CD146 (AF647-tout 1: 100) individuellement à chacun des 5 tubes. Incuber tous les tubes à 4 ° C pendant 20 min dans l'obscurité.
  6. Pendant l'incubation, préparer des tubes de prélèvement de cellules chacune avec 500 pi de croissance endothélial Moyen-2 (EGM-2) milieu de culture et lieu à 4 ° C.
  7. Après anticorps incubation, ajouter 5 ml de milieu de lavage pour laver les cellules et les perles afin d'éliminer l'anticorps non lié. Centrifuger tous les tubes à 200 g pendant 4 min. Répéter l'étape de lavage et la centrifugation. Décanter avec soin le surnageant et la pipette doucement lorsque les cellules remise en suspension.
  8. Remettre en suspension dans un milieu de lavage à une concentration d'environ 1 x 10 6 cellules par 250 pi. Remettre en suspension les billes dans 100 pl de lavage moyen.
  9. Transport toutes les cellules et perles suspensions à la trieuse de cellules sur la glace dans l'obscurité. Ajouter 1 goutte de perles négatives pour les tubes de commande de compensation de perles positives et les utiliser pour régler la compensation de fluorescence.
  10. Exécutez les cellules témoins non colorées selon les instructions du fabricant pour établir la fluorescence de fond et de régler les tensions sur les points suivants: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. Exécuter les contrôles isotypes selon les instructions du fabricant pour établir les seuils de fond de fluorescence liés à la liaison non spécifique. Exécutez le multi-couleur échantillon coloré et recueillir les péricytes et les populations de cellules adventice dans les tubes de prélèvement (Figure 1).
    REMARQUE: Les rendements de cellules viables optimales sont d'environ 3% de la dissociation totale des cellules vivantes pour les péricytes et 4% pour les cellules de l'adventice.

4. Culture cellulaire

  1. Sélectionnez appropriés des plaques de culture de taille en fonction du résultat du tri FACS. Ajouter 100 ul d' une solution stérile de gélatine à 0,2% par cm 2 de surface de croissance et agiter manuellement pour recouvrir la totalité du puits. Incuber les plaques à 4 ° C pendant 10 min et éliminer la solution de gélatine complètement. Gardez les cellules recueillies sur la glace lors de la préparation des plaques de culture.
    Note: péricytes fraîchement triées et des cellules adventices poussent bien si elles sont ensemencées à une densité de 30.000 à 40.000 cellules / cm 2 sur la surface de culture revêtues de gélatine.
  2. Centrifugeuse cellules fraîchement recueillies à 200 xg pendant 4 min et doucement remettre en suspension le culot cellulaire dans une quantité appropriée d'EGM-2.Seed les cellules sur des plaques revêtues de gélatine.
    Note: Le nombre réel de cellules pour ensemencer chaque puits et la quantité d'EGM-2 à ajouter dépendent de la sélection de la plaque. Par exemple, 0,5 ml et 1 ml d'EGM-2 sont nécessaires par puits pour les plaques 48 et 24 puits, respectivement.
  3. Échange EGM-2 pour le milieu de croissance des cellules périvasculaires (DMEM supplémenté avec 20% de FBS et 1% de P / S) pour les péricytes et les cellules de l'adventice fois que les cellules sont installées et collé à la plaque (après au moins 72 heures). Changer les médias tous les 72 heures à partir de là. Effectuer les incubations subséquentes initiales et tous à 5% de CO 2 et à 37 ° C.
  4. Dissocier les cellules en utilisant 0,05% de trypsine EDTA lorsque péricytes et les cellules de l'adventice peut atteindre 80 à 90% de confluence. Étancher avec 20% de FBS dans du PBS, centrifuger à 200 g pendant 4 minutes, remise en suspension dans un milieu de croissance des cellules périvasculaires, puis passage des cellules à un rapport 1: 3 non revêtues sur des plaques de culture en polystyrène. A partir de passage 2 et suivantes, les cellules de passage à un rapport 1: 5 (ou à environ 7000 cellules / cm2) sur des plaques ou flacons de culture en polystyrène non revêtues.

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Résultats

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Les cellules individuelles ont été distinguées des débris et des doublets sur la base de l'avant et une diffusion latérale de distribution. Les cellules vivantes ont été identifiés par leur incapacité à prendre le colorant DAPI. La stratégie d'ouverture de porte a été choisie sur la base du marquage de contrôle d'isotype de ce temps réel, la dissociation des cellules entières cardiaque (figure 1). A partir des cellules vivantes, cellules CD45 + ont d' abord ét...

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Discussion

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Des preuves croissantes supporte une capacité de régénération limitée du cœur humain adulte après une blessure. Identification et caractérisation des cellules précurseurs natifs responsables de ces réactions de régénération dans les cœurs blessés sont essentiels tant pour la compréhension des mécanismes et voies de signalisation associées et le développement d'approches à utiliser ces cellules thérapeutiquement.

Protocoles précédents ont décrit l'isolement des périvasculaires sous - ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi et Will Ramsay de l’Université d’Édimbourg ainsi qu’Alison Logar et Megan Blanchard de l’Université de Pittsburgh pour leur aide experte en cytométrie en flux. Nous tenons également à remercier Anne Saunderson et Lindsay Mock pour leur aide dans l’obtention de tissus humains. Des échantillons de tissus cardiaques humains adultes et fœtaux ont été prélevés avec l’autorisation éthique du Comité d’éthique de la recherche médicale du NHS Scotland Tayside et du Comité d’éthique de la recherche du NHS Lothian (REC08/S1101/1), respectivement. Ce travail a été soutenu par des subventions du Medical Research Council (BP), de la British Heart Foundation (BP), du Commonwealth de Pennsylvanie (BP), de l’Hôpital pour enfants de Pittsburgh (BP), du National Institute of Health R01AR49684 (JH) et du R21HL083057 (BP) et de la chaire Henry J. Mankin de l’Université de Pittsburgh (JH). JEB a été soutenu par une bourse de formation doctorale du Centre d’excellence en recherche de la British Heart Foundation (RE/08/001/23904). WC a été soutenu en partie par une bourse prédoctorale de l’American Heart Association (11PRE7490001).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AbC Kit de perles anti-sourisSondes moléculairesA-10344
Collagenase IGibco17100-017Reconstituer la poudre selon les besoins et stériliser par filtre
Collagenase IIGibco17101-015
Collagénase IVGibco17104-019
anti-humain CD34-PEBD Pharmingen555822Maintenir stérile
anti-humain CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833Maintenir stérile
anti-humain CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747Garder stérile
anti-humain CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Garder stérile
anti-humain CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Garder stérile
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162Pour la collecte de cellules et la culture jusqu’à ce qu’ils adhèrent
DMEM, hyperglycémie, GlutaMAX sans pyruvate de sodiumThermoFischer Scientific10566-016
Sérum de veau fœtalThermoFischer Scientific10500-064Congeler dans des aliquotes et conserver stérile
GélatineSigma AldrichG1393Diluer avec de l’eau stérile
IgG1k-PEBD Pharmingen559320Rester stérile
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873Garder stérile
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872Garder stérile
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Garder stérile
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Garder stérile
Sérum de sourisSigma AldrichM5905Garder
film de paraffine stérile - Parafilm MSigma AldrichP7793
Pénicilline-StreptomycineGibco15979-063Congeler dans des aliquotes et maintenir stérile
Saline tamponnée au phosphate pH 7,4ThermoFischer Scientific10010-023Garder stérile
Tampon de lyse des globules rouges Hybri-MaxSigma AldrichR7757Garder stérile
Trypan Blue SolutionSigma AldrichT8154
Trypsine-EDTA 0,5 %(10x)Invitrogen15400-054
  ; FACSARIA FUSIONBD PharmingenTrieur de cellules activées par
fluorescence

Références

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Mots-clés

Cellules pr curseurs p rivasculairesIsolation du tissu cardiaqueTri cellulaire activ par fluorescenceMarqueurs CD146 CD34Protocole de digestion tissulaireFiltration par tamis cellulaireAnalyse par cytom trie en fluxvaluation de la viabilit cellulaireCellules prog nitrices myocardiquesMarqueurs de surface cellulaire

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