Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

Résumé

du tissu cardiaque humain héberge des populations de cellules précurseurs pluripotentes périvasculaires qui peuvent être appropriés pour la régénération du myocarde. La technique décrite ici permet l'isolement et la purification simultanée de deux populations de cellules stromales pluripotentes associées aux vaisseaux sanguins d' origine, c. -à- CD146 ⁺ CD34 ^- péricytes et les cellules CD34 ⁺ CD146 ^- cellules de l' adventice, du myocarde humain.

Résumé

Les cellules souches/stromales mésenchymateuses multipotentes (CSM) ont été isolées de manière conventionnelle, grâce à leur adhérence plastique, des digestions des tissus primaires, tandis que leur localisation anatomique restait incertaine. La découverte récente de l’expression définie de marqueurs cellulaires périvasculaires et CSM par des cellules périvasculaires dans plusieurs tissus par notre groupe et d’autres chercheurs a fourni l’occasion d’isoler et de purifier de manière prospective des sous-populations homogènes spécifiques de cellules précurseurs périvasculaires multipotentes. Nous avons précédemment démontré l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour purifier les péricytes microvasculaires CD146⁺CD34^- et les cellules adventives vasculaires CD34⁺CD146^- des muscles squelettiques humains. Nous décrivons ici une méthode permettant d’isoler simultanément ces deux sous-ensembles de cellules périvasculaires du myocarde humain par FACS, basée sur l’expression d’un ensemble défini de marqueurs de surface cellulaire pour les sélections positives et négatives. Cette méthode met ainsi à disposition deux sous-populations spécifiques de cellules précurseurs cardiaques multipotentes de type CSM pour une utilisation dans la recherche fondamentale et/ou les investigations thérapeutiques.

Introduction

Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotique. Cependant, des études récentes ont démontré la présence du chiffre d'affaires de cardiomyocytes limitée dans les cœurs humains adultes ^1. Cellules autochtones souches / progénitrices avec cardiomyocytes potentiel de différenciation ont également été identifiés dans le myocarde chez les rongeurs adultes et les cœurs humains, y compris Sca-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere formation et , plus récemment, les cellules précurseurs périvasculaires ^2,3. Ces cellules représentent des candidats attrayants pour les thérapies visant à améliorer cardiaque réparation / régén....

Protocole

1. Traitement des Cardiac Human Sample

1. Veiller à ce que tous les fluides, les conteneurs, les instruments et la zone opérationnelle dédiée sont stériles.
2. Placer l'échantillon de tissu cardiaque (acquis par la banque de tissus ou de l'équipe chirurgicale) dans un milieu de stockage composé de Eagle modifié le milieu de réfrigéré Dulbecco (DMEM) contenant 20% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) sur la glace ³ pour le transport.
3. Retirer l'échantillon cardiaque à partir du support de stockage et laver avec un agent de lavage composé d'un tampon phosphate salin (PBS) supplémenté ....

Résultats

Les cellules individuelles ont été distinguées des débris et des doublets sur la base de l'avant et une diffusion latérale de distribution. Les cellules vivantes ont été identifiés par leur incapacité à prendre le colorant DAPI. La stratégie d'ouverture de porte a été choisie sur la base du marquage de contrôle d'isotype de ce temps réel, la dissociation des cellules entières cardiaque (figure 1). A partir des cellules vivantes, cellules CD45 ⁺ ont d' abord ét.......

Discussion

Des preuves croissantes supporte une capacité de régénération limitée du cœur humain adulte après une blessure. Identification et caractérisation des cellules précurseurs natifs responsables de ces réactions de régénération dans les cœurs blessés sont essentiels tant pour la compréhension des mécanismes et voies de signalisation associées et le développement d'approches à utiliser ces cellules thérapeutiquement.

Protocoles précédents ont décrit l'isolement des périvasculaires sous - .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AbC Kit de perles anti-souris	Sondes moléculaires	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstituer la poudre selon les besoins et stériliser par filtre
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagénase IV	Gibco	17104-019
anti-humain CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Maintenir stérile
anti-humain CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Maintenir stérile
anti-humain CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Garder stérile
anti-humain CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Garder stérile
anti-humain CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Garder stérile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	Pour la collecte de cellules et la culture jusqu’à ce qu’ils adhèrent
DMEM, hyperglycémie, GlutaMAX sans pyruvate de sodium	ThermoFischer Scientific	10566-016
Sérum de veau fœtal	ThermoFischer Scientific	10500-064	Congeler dans des aliquotes et conserver stérile
Gélatine	Sigma Aldrich	G1393	Diluer avec de l’eau stérile
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Rester stérile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Garder stérile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Garder stérile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Garder stérile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Garder stérile
Sérum de souris	Sigma Aldrich	M5905	Garder
film de paraffine stérile - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15979-063	Congeler dans des aliquotes et maintenir stérile
Saline tamponnée au phosphate pH 7,4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Garder stérile
Tampon de lyse des globules rouges Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Garder stérile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsine-EDTA 0,5 %(10x)	Invitrogen	15400-054
; FACSARIA FUSION	BD Pharmingen	Trieur de cellules activées par