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Article de méthode

Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments

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DOI :

10.3791/54256

⸱

20 septembre 2016

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

Dans cet article

Résumé

Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole permettant d’examiner fonctionnellement la transcription et l’activité inhibitrice des agents antibactériens ciblant la transcription bactérienne.

Résumé

Les essais in vitro de transcription ont été mis au point et largement utilisé depuis de nombreuses années pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la transcription. Ce processus nécessite plusieurs sous-unités d'ARN-polymérase ADN-dépendante (RNAP) et une série de facteurs de transcription qui agissent pour moduler l'activité de RNAP pendant l'expression génique. gel de séquençage électrophorèse des transcrits radiomarqués est utilisé pour fournir des informations mécaniste détaillées sur la façon de transcription produit et quels paramètres peuvent l'affecter. Dans cet article, nous décrivons le protocole pour étudier la manière dont le facteur d'élongation essentiel NusA régule la transcription de pause, ainsi qu'une méthode pour identifier un agent antibactérien ciblage initiation de la transcription par l'inhibition de la formation holoenzyme RNAP. Ces méthodes peuvent être utilisées comme une plate-forme pour le développement d'approches supplémentaires pour explorer le mécanisme d'action des facteurs de transcription qui restent encore peu clair, ainsi que de nouvelles agen antibactériennets ciblant la transcription qui est une cible de médicament sous-utilisé dans la recherche et le développement d'antibiotiques.

Introduction

La transcription est le processus dans lequel l'ARN est synthétisé à partir d'une matrice d'ADN spécifique. Dans les cellules eucaryotes, il existe trois RNAPs distincts: I ARNP transcrit précurseurs ARNr ARNP II est responsable de la synthèse de l'ARNm et de certains petits ARN nucléaires, ainsi que la synthèse de l'ARNr 5S et ARNt est réalisée par ARNP III. Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul ARNP responsable de la transcription de toutes les classes d'ARN. Il y a trois étapes de transcription: initiation, l'élongation et la terminaison. La transcription est l'un des procédés les plus réglementés dans la cellule. Chaque étape du cycle de transcription représente un point de contrôle pour la régulation de l' expression des gènes 1. Pour l' initiation, ARNP doit associer à un facteur sigma pour former une holoenzyme, qui est nécessaire pour diriger l'enzyme à des sites spécifiques appelés promoteurs 2 pour former un complexe promoteur ouvert. Par la suite, une grande suite de facteurs de transcription sont responsables de la réglementation oactivités f RNAP pendant l'allongement et de terminaison phases. Le facteur de transcription examiné ici est la protéine hautement conservée et essentielle, NusA. Il est impliqué dans la régulation de la transcription en pause et la résiliation, ainsi que des anti-terminaison au cours de la synthèse de l' ARNr 3-5.

Les essais in vitro de transcription ont été développés comme des outils puissants pour étudier les étapes réglementaires complexes lors de la transcription 6. D'une manière générale, un fragment linéaire d'ADN comprenant une région promotrice est requise en tant que matrice pour la transcription. La matrice d'ADN est habituellement généré par PCR ou par linéariser un plasmide. les protéines et les PNT (y compris une NTP radiomarqué à des fins de détection) purifiés sont ensuite ajoutés et le produit analysé après la période d'incubation requise. Utilisation de modèles appropriés et des conditions de réaction, toutes les étapes de la transcription ont été examinés en utilisant cette approche qui a permis la caractérisation moléculaire détaillée de transcription au cours du dernier demi - siècle 7. En combinaison avec des informations sur la structure en 3 dimensions de RNAP il a également été possible de sonder le mécanisme moléculaire de l' inhibition de la transcription par les antibiotiques et conduit aux antibiotiques, et utiliser cette information dans le développement de nouveaux médicaments améliorés 8-10.

Dans ce travail, nous fournissons des exemples de tests de transcription peuvent être utilisés pour déterminer le mécanisme de régulation par allongement de la transcription / facteur de terminaison NusA, et comment le mécanisme d'action d'une nouvelle initiation de la transcription inhibiteur de plomb peut être déterminée.

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Protocole

Attention: Les expériences impliquent l'utilisation de l'isotope radioactif 32 P et aucun travail devraient être entrepris avant que toutes les conditions de sécurité appropriées ont été respectées. En général, le personnel sont tenus d'assister à un cours de sécurité et se soumettre à la pratique supervisée avant des expériences en utilisant des réactifs radioactifs. S'il vous plaît porter un équipement de protection individuelle (dosimètre thermoluminescent, des lunettes de sécurité, gants, salle de rayonnement sarraus de laboratoire, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures) lors de l'exécution de la réaction.

1. Préparation des matériaux de dosage

  1. Obtenir les protéines requises pour le dosage de transcription.
    1. Pour l'expérience décrite ici, surproduire et purifier E. coli RNAP dans le laboratoire tel que décrit 11, ou d' obtenir à partir d' une source commerciale (liste des matières).
      Remarque: Les deux fournissent des résultats similaires. D' autres procédés de purification de RNAP native ou une affinité marquée peut également être utilisé 12,13. Sigma / facteurs Nusa peuvent être obtenus sous forme described dans les travaux antérieurs 14,15.
  2. Préparation de l'eau de diéthylpyrocarbonate (DEPC de) Traitées
    Remarque: Vous pouvez également, l'eau sans RNase peuvent être obtenus auprès de sources commerciales (Liste des matériaux).
    1. Ajouter 1 ml de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) et 1 L d'eau purifiée (0,1% v / v) et on mélange pendant une nuit.
    2. eau DEPC Autoclave et conseils deux fois.
  3. Modèle Préparation ADN
    1. Purifier plasmide pSG1154 16 et / ou pIA226 17 en utilisant un kit de purification de plasmide (liste des matières) selon les instructions du fabricant.
    2. Pour amplifier le gabarit pour les essais de transcription de run-off (un fragment de 360 pb englobant la région du promoteur xyl P) assembler une réaction de PCR sur de la glace , y compris 25 ul mélange 2x PCR (Voir Matériaux), 2 pl de chacune des amorces (5 uM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(avant) et 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (inverse), 1 pl pSG1154 plasmide pra séparation (250 uM) et 20 pi d'eau purifiée).
      1. Ou encore, pour simples essais de transcription rondes, amplifier un fragment de 447 pb englobant la région R de promoteur λ P de pIA226 17. Mettre en place une réaction PCR sur la glace en utilisant 25 pi de mélange 2x PCR, 2 pl chacune des amorces (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(avant) et 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (inverse), 1 pl pIA226 17 préparation de plasmide (250 pm) et 20 pi d'eau purifiée).
        Remarque: Ce modèle manque cytosine jusqu'à la position 26 nt, qui est le 26 ème nucléotide du site d'initiation de la transcription. Par conséquent, la transcription en utilisant ce modèle permettra l'initiation, la clairance de promoteur et de décrochage au +26 nt pour former un complexe d'élongation de transcription stable (CE) lorsque seul ATP, UTP et GTP sont présents dans la réaction.
    3. Mettre en place une réaction PCR avec les conditions suivantes: 95 °; C pendant 30 secondes, 50 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 30 secondes, en répétant 30 cycles.
    4. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de nettoyage (liste de matériaux) selon les instructions du fabricant et éluer dans 100 ul de tampon de transcription pour le dosage de la transcription.
    5. Déterminer la concentration d'ADN de matrice en utilisant une fluorospectromètre (Voir Matériaux).
  4. NTP Préparation
    Remarque: les PNT peuvent être obtenus à partir de différentes sources commerciales (Liste des matériaux).
    1. Dissoudre PNT (≥99% pures) dans l'eau traitée par DEPC pour faire 1 M Stock, aliquote de 1 ml de la solution dans 1,5 ml tubes (50 ul dans chaque tube) et conserver à -20 ° C.
    2. Commande α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) avant l'expérience. 32 P a une demi-vie courte de 14,29 jours.
      Remarque: L'utilisation de l'UTP marqué alpha évite comparant l'intensité des bandes avec des longueurs différentes.
  5. Préparation de l'ARN Ladder
    1. Assembler le suiviréaction tion à la température ambiante: 0,5 pg d' ARN Modèle Mix (liste des matières), 80 mM HEPES pH 7,5 tampon, 12 mM de MgCl2, 10 mM de NaCl, 10 mM de DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, mM UTP 0,5, 2 ul 32P UTP, 0,5 ul T7 RNAP (liste des matières), l' eau traitée par DEPC à 20 pi.
    2. Permettre à la réaction de se dérouler à 37 ° C pendant 1 heure. Utilisez immédiatement ou conserver à -80 ° C.

2. Préparation de l'ARN Séquençage Gel

  1. Préparation du gel
    1. Nettoyer les plaques à partir d'un appareil de gel de séquençage (liste des matières) deux fois avec 70% d'éthanol et de l'eau purifiée, et d'assembler la cellule avec un peigne et deux entretoises.
      Remarque: Une plaque peut être revêtue avec un réactif de siliconage (Voir Matériaux) pour faciliter le retrait du gel à l'étape 4.2.
    2. Dissoudre 33,6 g d'urée dans 22 ml d'eau et 16,4 ml de 5 x Tris / Borate / EDTA (TBE) (54 g de tris (hydroxyméthyl) aminométhane, 27,5 g d'acide borique, 10 ml de 1 M d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 7,4 dans 1 litre d'eau) à l'aide d'un agitateur magnétique.
    3. Ajouter 16 ml de bis-acrylamide, l'acrylamide solution à 40% / (19: 1) pour la solution d'urée et filtrer à travers un filtre de 0,45 um.
    4. Ajouter 514 ul de 10% (p / v) de persulfate d'ammonium fraîchement préparée dans de l' eau suivi par 51,4 ​​ul de N, N, N ', N' -tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à la solution filtrée.
    5. Retourner doucement la solution de gel pour éviter une aération excessive et injecter immédiatement et sans à-coup dans la cellule de mise en séquence pré-emballé placé horizontalement à partir du trou d'injection inférieur. Prenez soin d'éviter de faire des bulles lors de l'injection.
    6. Permettre 1-1,5 h jusqu'à ce que le gel est complètement fixé avant l'utilisation dans un dosage de transcription. Le gel peut être conservé à température ambiante pendant deux ou trois jours lorsqu'elle est enroulée avec le tissu mouillé à l'eau sur la partie supérieure de la cellule de séquençage.

3. Réaction de transcription

  1. Allongement Transcription Assay Pause
    1. Formation d'un complexe d'élongation de la transcription
      1. Ajouter 1 pl de RNAP core enzyme (1 uM disponible dans un tampon de transcription) à un tube de 1,5 ml.
      2. Ajouter 1 pi de 70 purifié sigma-facteur (σ 70; 3uM stocks dans un tampon de transcription) à la RNAP et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes pour former une holoenzyme ARNP.
      3. Ajouter 3 pi de 500 nM ADN matrice purifié (λ P R promoteur du produit pIA226 PCR) dans un tampon de transcription à l'holoenzyme ARNP et incuber à 37 ° C pendant 5 min pour former le complexe ouvert.
      4. Préparer un mélange des composants de la réaction dans un autre tube de 1,5 ml en utilisant 5 ul de 10 x tampon de transcription (Liste des matériaux: 400 mM de Tris-HCl, 1,6 M de KCl, 100 mM MgCl2, 10 mM de DTT, 50% de glycerol, pH 7,9 dans traitée au DEPC eau), 2 ul de 250 uM chaque de GTP et UTP, 1 pi d'ATP 1 mM, et 1 ul d'α- 32P UTP (3000 Ci / mmol). Ajouter de l'eau traitée DEPC à 41 pi.
        Nonte: inhibiteur de RNase (liste des matières) peut être utilisé pour réduire au minimum la contamination de RNase.
      5. Transférer la solution de mélange dans le tube contenant le complexe ouvert et incuber à 37 ° C pendant 15 min pour former le complexe de transcription d'allongement arrêté à +26 nt.
      6. Déplacer la réaction à la température ambiante (~ 21 ° C) et ajouter 1 pi de 2,5 mg / ml de rifampicine à une concentration finale de 50 pg / ml.
      7. Ajouter 1 pi de 0,1 mM purifié NusA au mélange réactionnel et on incube pendant 5 minutes à température ambiante.
      8. Ajouter 2 ul de 250 uM PTP dans le mélange réactionnel pour obtenir un volume final de 50 ul et de mesurer le temps de réaction à l'aide d'une minuterie.
      9. Transférer 5 pl de la solution réactionnelle dans 2 ul de tampon d'ARN de charge de gel (95% de formamide, 0,05% de bleu de bromophénol et 0,05% de xylene cyanol) à 30, 60, 120, 240, 480 et 1200 secondes pour arrêter la réaction.
      10. Evacuer les conseils 32 P UTP et tubes dans une suite de déchets radioactifsAINER.
  2. Transcription Initiation Assay
    1. La formation du complexe ouvert
      1. Diluer purifiée σ 70 à 0,5 uM.
      2. Répéter les étapes 3.1.1.1 3.1.1.3 à l' aide de 0,5 pm ( au lieu de 3 uM) purifié σ 70 et la matrice d'ADN (la région du promoteur xyl P du produit pSG1154 PCR).
    2. L'inhibition de l'essai d'initiation de la transcription
      1. Ajouter l'inhibiteur destiné à empêcher la formation de RNAP holoenzyme à RNAP core enzyme avant l'addition de σ 70 (après l' étape 3.1.1.1), suivi par étapes 3.1.1.2 et 3.1.1.3 d'examiner si l'inhibiteur est capable de perturber holoenzyme formation.
      2. En variante, après l' étape 3.1.1.2, ajouter l'inhibiteur d'examiner si elle est capable d'inhiber la concurrence σ 70 lier à RNAP.
      3. Utiliser la même quantité de DMSO, le solvant de l'inhibiteur, à la place de l'inhibiteur detac dans des réactions de contrôle.
    3. Achèvement de la réaction
      1. Dissoudre l'héparine dans l'eau à une concentration stock de 1 mg / ml et le stock à -20 ° C.
        Note: L'héparine est un concurrent d'ADN qui peut séquestrer RNAP qui n'a pas formé un complexe ouvert. Une fois que le complexe ouverte est formée, l'héparine ne peut pas entrer dans le site de liaison d'ADN de RNAP et inhiber la transcription du complexe ouvert pré-formé. Par conséquent, l'héparine est nécessaire uniquement pour les essais à un tour; on n'a pas besoin pour des essais à plusieurs ronds.
      2. Préparer le mélange de réaction en utilisant 5 pi de 10 x tampon de transcription (Voir Matériaux), 1 pi de 1 mg / ml de solution d' héparine, 1 pi de 10 mM de chaque ATP, GTP et CTP mM UTP 2,5 et 1 pi d'α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Ajouter de l'eau traitée DEPC à 45 pi.
      3. Mélanger le mélange réactionnel avec le complexe ouvert de la transcription, l'impulsion de spin et incuber à 37 ° C pendant 20 min.
      4. Transférer 10 ul de la réaction de telle sortelution dans 5 pi de tampon de charge de gel d'ARN (95% de formamide, 0,05% de bleu de bromophénol et 0,05% de xylene cyanol) pour tremper la réaction.

4. ARN Gel Exécution et développement

  1. Exécution du gel de polyacrylamide dénaturant
    1. Exécuter le gel à 50 ° C et 50 W dans un tampon TBE 1x pendant environ 1,5 heure jusqu'à ce que la température du gel et le tampon est stable à 50 ° C.
    2. échantillons de chaleur à 90 ° C pendant 30 secondes et déplacez-les sur de la glace avant le chargement sur le gel.
    3. Charger les échantillons dans les puits sur la partie supérieure du gel le long d'une voie contenant 2 ul d'ARN échelle (1: 100 de dilution).
    4. Exécutez le gel à 50 W et 50 ° C dans un tampon TBE 1x jusqu'à ce que le colorant bleu de bromophénol atteint ~ 2/3 sur le gel.
  2. Traitement Gel
    1. Ouvrir lentement et soigneusement séparer la plaque supérieure de la cellule de séquençage. Prenez grand soin pour éviter de casser le gel.
    2. Cut chromatograppapier hy (liste des matières) pour correspondre à la taille du gel du haut vers le colorant bleu de bromophénol. Utiliser un compteur Geiger pour confirmer la position approximative des transcrits d'ARN radiomarquées.
    3. couvrir délicatement le gel avec le papier filtre, et appuyez fermement jusqu'à ce que le gel adhère au papier filtre. Couper et jeter le fond du gel aux déchets radioactifs que les PNT non constituées en société courent au fond du gel, qui peut être très chaud.
    4. Placez un morceau de taille similaire de papier filtre sur le lit de séchage d'une machine de séchage sous vide, et posez délicatement le papier revêtu de gel sur elle avec le gel vers le haut.
    5. Couvrir le gel avec une pellicule plastique et sèche à 60 ° C pendant 1,5 heure.
    6. Enveloppez l'autre côté du papier filtre de gel recouvert d'une pellicule plastique et placer sur une plaque de phosphore photostimulable dans le cas de l'imagerie, avec le temps d'exposition appropriée, qui peut varier de 1 h à fonction nuit à l'efficacité de la réaction.
    7. L'image de la plaque luminescente à l'aideun scanner d'imagerie selon les instructions du fabricant. Déterminer l'intensité de la bande par rapport à l'aide du logiciel ImageJ selon le manuel du logiciel.
    8. Utilisez un compteur Geiger pour vérifier la contamination radioactive dans la zone de travail, essuyez les éléments suspects et de la zone avec le tissu et un agent de nettoyage et éliminer le tissu dans le récipient d'élimination.

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Résultats

l'efficacité de la transcription peut être déterminée en mesurant le niveau de rayonnement dans les bandes à des instants différents. Le dosage pause pour tester la fonction du facteur NusA visualisation de la pause, la terminaison est activée, et le ruissellement des produits (figure 1A). En présence du domaine N-terminal de NusA (NTD NusA, les résidus d'acides aminés 1-137), l'apparence des produits d'ARN a été sensiblement retardée par rapport à l'...

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Discussion

Dans tous les organismes, la transcription est un processus étroitement régulé. Les essais in vitro de transcription ont été développés pour fournir une plate - forme pour tester les effets des facteurs de transcription, des petites molécules et les inhibiteurs de la transcription. Dans cette méthode, le papier, un test pour la transcription bactérienne générale a été décrite. essais de transcription combinés avec un gel de séquençage électrophorèse des transcrits sont très importants pour les études mécanistiq...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail reconnaît une bourse de début de carrière de la faculté de l’Université de Newcastle (CM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Obtenir les protéines nécessaires au dosage
E. coli RNAPEpicentreS90250
Préparation de pyrocarbonate de
au DEPC (DEPC)  ;Sigma-Aldrich  ;D5758
Sans eau  ;
Ambion Eau Sans NucléaseThermoFisherAM9937
Préparation de matrice
Wizard  ; De plus  ;SV Minipreps Système de purification d’ADNPromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
Amorces
Wizard SV Gel et système de nettoyage PCR  ;Fluorospectromètre PromegaA9281
NanoDrop 3300Thermo ScientificND-3300
NTP Préparation
ATPSigma-Aldrich  ;A6559
UTPSigma-Aldrich  ;U1006
GTPSigma-Aldrich  ;G3776
CTPSigma-Aldrich  ;C9274
rNTPs haute puretéGE Healthcare27-2025-01
&alpha ;-32P UTP  ;PerkinElmer  ;   ;BLU007C001MC
l’échelle d’ARN des composés radioactifs  ;
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0,1&ndash ; 1 kbMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich  ;H7006
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich  ;S7653
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich  ;M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
Préparation
de gel Sequi-Gen GT séquençage d’acide nucléique cellulaire  ;Bio-Rad  ;   ;165-3804
Sigmacote  ;   ;Sigma-Aldrich  ;SL2
urée  ;   ;Sigma-Aldrich  ;U6504
tris(hydroxyméthyl)aminométhane  ;   ;Sigma-Aldrich  ;
l’acide borique  ;Sigma-Aldrich  ;B7901
acide éthylènediaminetétraacétique  ;Sigma-Aldrich  ;ED
40 % Acrylamide/bis-acrylamide  ;Sigma-Aldrich  ;A9926
persulfate d’ammonium  ;Sigma-Aldrich  ;A3678
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)Sigma-Aldrich T9281
Dosage
Chlorurede potassium Sigma-Aldrich  ;P9541
glycérol  ;   ;Sigma-Aldrich  ;G5516
rifampicine  ;   ;Sigma-Aldrich  ;R3501
formamide  ;   ;Sigma-Aldrich  ;F9037
bleu de bromophénolSigma-Aldrich  ;B0126
xylène cyanol  ;Sigma-Aldrich  ;X4126
héparine  ;Sigma-Aldrich  ;84020
Inhibiteur de la ribonucléase RNasinPromegaN2511
Tampon de transcription  ;
Base TrisSigma-Aldrich  ;T1503
Chlorure de potassiumSigma-Aldrich  ;P9541
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich  ;M2393
DTT  ;   ;Sigma-Aldrich  ;DTT-RO
glycérol  ;   ;Sigma-Aldrich  ;G5516
Papier
Whatman  ; Papier de chromatographie 3MM ChrFisher Scientific05-714-5
Décontaminant
Decon 90decondecon90
Traitement au gel
Typhoon Trio+ imageurGE Healthcare Life Sciences63-0055-89
de transcription diéthyle d’eau traitéed’ADNPCR Préparation de 154563de la transcriptionfiltreradioactif

Références

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Réimpressions et autorisations

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