Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole permettant d’examiner fonctionnellement la transcription et l’activité inhibitrice des agents antibactériens ciblant la transcription bactérienne.
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Article de méthode
Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les essais in vitro de transcription ont été mis au point et largement utilisé depuis de nombreuses années pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la transcription. Ce processus nécessite plusieurs sous-unités d'ARN-polymérase ADN-dépendante (RNAP) et une série de facteurs de transcription qui agissent pour moduler l'activité de RNAP pendant l'expression génique. gel de séquençage électrophorèse des transcrits radiomarqués est utilisé pour fournir des informations mécaniste détaillées sur la façon de transcription produit et quels paramètres peuvent l'affecter. Dans cet article, nous décrivons le protocole pour étudier la manière dont le facteur d'élongation essentiel NusA régule la transcription de pause, ainsi qu'une méthode pour identifier un agent antibactérien ciblage initiation de la transcription par l'inhibition de la formation holoenzyme RNAP. Ces méthodes peuvent être utilisées comme une plate-forme pour le développement d'approches supplémentaires pour explorer le mécanisme d'action des facteurs de transcription qui restent encore peu clair, ainsi que de nouvelles agen antibactériennets ciblant la transcription qui est une cible de médicament sous-utilisé dans la recherche et le développement d'antibiotiques.
Introduction
La transcription est le processus dans lequel l'ARN est synthétisé à partir d'une matrice d'ADN spécifique. Dans les cellules eucaryotes, il existe trois RNAPs distincts: I ARNP transcrit précurseurs ARNr ARNP II est responsable de la synthèse de l'ARNm et de certains petits ARN nucléaires, ainsi que la synthèse de l'ARNr 5S et ARNt est réalisée par ARNP III. Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul ARNP responsable de la transcription de toutes les classes d'ARN. Il y a trois étapes de transcription: initiation, l'élongation et la terminaison. La transcription est l'un des procédés les plus réglementés dans la cellule.
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Protocole
Attention: Les expériences impliquent l'utilisation de l'isotope radioactif 32 P et aucun travail devraient être entrepris avant que toutes les conditions de sécurité appropriées ont été respectées. En général, le personnel sont tenus d'assister à un cours de sécurité et se soumettre à la pratique supervisée avant des expériences en utilisant des réactifs radioactifs. S'il vous plaît porter un équipement de protection individuelle (dosimètre thermoluminescent, des lunettes de sécurité, gants, salle de rayonnement sarraus de laboratoire, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures) lors de l'exécution de la réaction.
1. Préparat....
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Résultats
l'efficacité de la transcription peut être déterminée en mesurant le niveau de rayonnement dans les bandes à des instants différents. Le dosage pause pour tester la fonction du facteur NusA visualisation de la pause, la terminaison est activée, et le ruissellement des produits (figure 1A). En présence du domaine N-terminal de NusA (NTD NusA, les résidus d'acides aminés 1-137), l'apparence des produits d'ARN a été sensiblement retardée par rapport à l'.......
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Discussion
Dans tous les organismes, la transcription est un processus étroitement régulé. Les essais in vitro de transcription ont été développés pour fournir une plate - forme pour tester les effets des facteurs de transcription, des petites molécules et les inhibiteurs de la transcription. Dans cette méthode, le papier, un test pour la transcription bactérienne générale a été décrite. essais de transcription combinés avec un gel de séquençage électrophorèse des transcrits sont très importants pour les études mécanistiq.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail reconnaît une bourse de début de carrière de la faculté de l’Université de Newcastle (CM).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Obtenir les protéines nécessaires au dosage | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Préparation de pyrocarbonate de | |||
| au DEPC (DEPC) ; | Sigma-Aldrich ; | D5758 | |
| Sans eau ; | |||
| Ambion Eau Sans Nucléase | ThermoFisher | AM9937 | |
| Préparation de matrice | |||
| Wizard ; De plus ;SV Minipreps Système de purification d’ADN | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| Amorces | |||
| Wizard SV Gel et système de nettoyage PCR ; | Fluorospectromètre Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Préparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich ; | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich ; | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich ; | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich ; | C9274 | |
| rNTPs haute pureté | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| &alpha ;-32P UTP ; | PerkinElmer ; ; | BLU007C001MC | |
| l’échelle d’ARN des composés radioactifs ; | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0,1&ndash ; 1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich ; | H7006 | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich ; | S7653 | |
| Chlorure de magnésium | Sigma-Aldrich ; | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Préparation | |||
| de gel Sequi-Gen GT séquençage d’acide nucléique cellulaire ; | Bio-Rad ; ; | 165-3804 | |
| Sigmacote ; ; | Sigma-Aldrich ; | SL2 | |
| urée ; ; | Sigma-Aldrich ; | U6504 | |
| tris(hydroxyméthyl)aminométhane ; ; | Sigma-Aldrich ; | ||
| l’acide borique ; | Sigma-Aldrich ; | B7901 | |
| acide éthylènediaminetétraacétique ; | Sigma-Aldrich ; | ED | |
| 40 % Acrylamide/bis-acrylamide ; | Sigma-Aldrich ; | A9926 | |
| persulfate d’ammonium ; | Sigma-Aldrich ; | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Dosage | |||
| Chlorure | de potassium Sigma-Aldrich ; | P9541 | |
| glycérol ; ; | Sigma-Aldrich ; | G5516 | |
| rifampicine ; ; | Sigma-Aldrich ; | R3501 | |
| formamide ; ; | Sigma-Aldrich ; | F9037 | |
| bleu de bromophénol | Sigma-Aldrich ; | B0126 | |
| xylène cyanol ; | Sigma-Aldrich ; | X4126 | |
| héparine ; | Sigma-Aldrich ; | 84020 | |
| Inhibiteur de la ribonucléase RNasin | Promega | N2511 | |
| Tampon de transcription ; | |||
| Base Tris | Sigma-Aldrich ; | T1503 | |
| Chlorure de potassium | Sigma-Aldrich ; | P9541 | |
| Chlorure de magnésium | Sigma-Aldrich ; | M2393 | |
| DTT ; ; | Sigma-Aldrich ; | DTT-RO | |
| glycérol ; ; | Sigma-Aldrich ; | G5516 | |
| Papier | |||
| Whatman ; Papier de chromatographie 3MM Chr | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Décontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Traitement au gel | |||
| Typhoon Trio+ imageur | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
Références
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
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Réimpressions et autorisations
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