Méthode rapide et simplifié Haut Isolation Grâce-put de miARN de hautement purifiées High Density Lipoprotein

Résumé

Les microARN jouent un rôle régulateur important et sont en train de devenir de nouvelles cibles thérapeutiques pour diverses maladies humaines. Il a été montré que les miARN sont transportés dans des lipoprotéines à haute densité. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour isoler rapidement les HDL purifiée convenant pour l'analyse des miARN du plasma humain.

Résumé

Les petits ARN non codants (miARN) ont été impliqués dans diverses maladies humaines, y compris les syndromes métaboliques. Ils peuvent être utilisés comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic ou peuvent servir de cibles pour le développement de médicaments, respectivement. Récemment, il a été démontré que les miARN sont transportés dans les lipoprotéines, en particulier les lipoprotéines de haute densité (HDL), et sont délivrés aux cellules réceptrices pour être absorbés. Cela soulève la possibilité que les miARN jouent un rôle essentiel et central dans le fonctionnement cellulaire et organique via la régulation de l’expression des gènes ainsi que le messager des communications cellule-cellule et la diaphonie entre les organes. Les méthodes actuelles d’isolement des miARN à partir de HDL purifié ne sont pas pratiques lorsqu’elles utilisent de petits échantillons à grande échelle. Cela est dû en grande partie aux méthodes longues et laborieuses utilisées pour l’isolement des lipoprotéines. Nous avons développé une approche simplifiée pour isoler rapidement les HDL purifiés adaptés à l’analyse des miARN à partir d’échantillons de plasma. Cette méthode devrait faciliter l’étude du rôle des miARN dans la santé et la maladie et en particulier fournir de nouvelles informations sur la variété des fonctions biologiques, en dehors du transport inverse du cholestérol, qui ont été attribuées aux HDL. De plus, les espèces de miARN présentes dans le HDL peuvent fournir des informations précieuses sur les biomarqueurs cliniques pour le diagnostic de diverses maladies.

Introduction

Les microARN sont des espèces endogènes de minuscules ARN non codants qui sont hautement conservées et sont considérées comme des acteurs clés dans la régulation de divers processus biologiques en dégradant ou en réprimant des ARN messagers cibles spécifiques¹. Parce que les miARN agissent intracellulairement, ils ont été explorés en tant que biomarqueurs dérivés de tissus, ce qui a conduit à la découverte de fonctions spécifiques aux tissus de ces miARN. Cependant, les miARN se trouvent également de manière extracellulaire, soit associés à des protéines, soit dans des exosomes/microvésicules qui peuvent efficacement les protéger de la dégradation par les RNases extracellulaires². Des études plus récentes ont montré que l’effet protecteur du HDL n’est peut-être pas étroitement lié à sa capacité à favoriser l’efflux de cholestérol, mais plutôt à sa cargaison de non-cholestérol, en particulier en tant que porteur de miARN circulants ^{3, 4}. Ces miARN peuvent non seulement moduler le métabolisme des lipides, mais sont également associés à des effets anti-inflammatoires, antioxydants et antithrombotiques du complexe HDL-miARN ^{5, 6}.

Pour explorer davantage le rôle des miARN transportés dans les particules de HDL, un protocole simple et facile doit être établi pour l’extraction de miARN à partir de HDL hautement purifiés isolés pour une utilisation en routine clinique. De nombreuses méthodes ont été décrites pour isoler le HDL. Ces méthodes prennent soit beaucoup de temps, soit nécessitent un grand volume de plasma qui peut nécessiter un regroupement d’échantillons, une dialyse extensive pour dessaler les lipoprotéines isolées et elles n’éliminent pas complètement les exosomes en tant que source de miARN³, respectivement. Nous décrivons ici une méthode simple et rapide qui permet d’isoler les miARN à partir de HDL hautement purifiés en utilisant un petit volume d’échantillons de sang à plus grande échelle. Nous pensons que cette méthode peut servir de bonne référence pour promouvoir la recherche sur le rôle des miARN circulants et en particulier le rôle des HDL dans la facilitation de la communication entre les différentes cellules et organes.

Protocole

1. Collecte des échantillons de sang

1. Recueillir le jeûne des échantillons de sang veineux périphériques en 10 tubes ml en plastique contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique anticoagulant (EDTA) (qui a plusieurs avantages par rapport à d'autres anticoagulants) par ponction veineuse standard d'une veine de premier plan dans le pli du coude.
2. Centrifuger les échantillons de sang à 1600 g pendant 20 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse pour obtenir un plasma exempt de globules rouges et de petites quantités d'ARN.
3. Séquentiellement centrifuger le surnageant à 3000 g (4 ° C) dans un seau rotor oscillant pendant 10 minutes pour enlever WBC et plaquettes, puis 15 minutes supplémentaires pour éliminer les débris de cellules restant respectivement.
4. Mesurer la densité du plasma en utilisant un densitomètre à température ambiante selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Le réglage de la densité (d = 1,023 g / ml) avec une solution saline à 0,9% peut être nécessaire après élimination des exosomes, mais avant l'ultracentrifugation en gradient de densité.

2. Exosome Radiation de plasma

1. Retirez les exosomes circulants qui ont une densité similaire à HDL et représentent une source quantitativement importante de miRNA ^3.
   1. Pour ce faire, en ajoutant une solution exosomes de précipitation 252 pi à 1 ml de plasma suivie d'une incubation pendant 30 min à 4 ° C. Pour sédimenter les exosomes, centrifuger le mélange pendant 30 minutes à 1500 g à 4 ° C.
   2. Pour isoler HDL, transférer 1 ml du surnageant résultant à un tube d'ultracentrifugation en polycarbonate à paroi épaisse pour un traitement ultérieur avec gradient de densité ultracentrifugation (voir ci-dessous).

3. gradient de densité ultracentrifugation (Figure 1).

1. Pour séparer HDL utiliser un processus en 3 étapes utilisant une ultracentrifugation de plancher avec un rotor à angle fixe fonctionnant à 448811 x G et 8 ° C, respectivement.
2. Préparer trois solutions différentes de densité séquentiellement et frais pour chaque isolement.
   1. Préparer la solution A (isolement de VLDL, d = 1,006 g / ml) en dissolvant 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mole), de 0,1 g EDTA2Na et 1 ml de NaOH 1 N dans 1000 ml d'eau distillée autoclavée. Ensuite, ajoutez un 3 ml supplémentaires d'eau autoclavée-distillée.
   2. Préparer la solution B (isolement des LDL, d = 1,182 g / ml) par addition de 25,2 g de NaBr pour 100 ml de solution A (NaCl 0,195 mol, NaBr, 2,44 mol).
   3. Préparer la solution C (séparation des HDL, d = 1,470 g / ml) en mélangeant 78,8 g de NaBr avec 100 ml de solution A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmer la densité appropriée à la température ambiante en utilisant un densitomètre. Gardez toutes les solutions à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

4. Isolement de VLDL

1. Mélanger 1 ml de plasma (moyenne densité = 1,023 g / ml) et 200 ul de nuclease libre de graisse rouge 7B dans un tube d'ultracentrifugation à paroi épaisse de 6,5 ml de polycarbonate.
2. Puis la couche avec précaution 5 ml de la solution A sur le dessus du mélange. Si nécessaire, ajoutez la graisse supplémentaire Red 7B sur le dessus de la solution A to équilibrer le poids de chaque tube. Centrifugeuse pendant 2 h (accélération - 5), (décélération - 7).
   NOTE: Lors de la centrifugation, les lipoprotéines sont accumulées en tant que groupe à leurs régions de densité d'équilibre.
3. A la fin de la course d'observer 2 couches. Retirer 1,5 ml de la fraction VLDL représentant la couche supérieure et conserver à 4 ° C.
4. Enfin, en utilisant un transfert de pipette 4 ml à partir du fond du tube contenant les LDL, HDL, de l'albumine et de la fraction d'acide gras dans un nouveau tube de polycarbonate pour l'isolement de la LDL.

5. Isolement des LDL

1. Mélanger 2 ml de solution B et 100 nucléase ul Fat libre Red 7B dans le tube contenant la fraction LDL et HDL (section 4), respectivement.
2. Puis centrifuger pour 3 heures (accélération 9, décélération 7). Par la suite, retirer 1,5 ml de la fraction LDL représente la couche supérieure et de garder à 4 ° C ou conserver à -80 ° C. Enfin, le transfert de 4 ml à partir du fond du tube contenant les HDLla fraction à un nouveau tube de polycarbonate.

6. Isolement du HDL

1. Mélanger 2 ml de solution C, 100 ul de nuclease sans matières grasses rouge 7B et 15 ul de 98% β-mercaptoéthanol dans le tube contenant la fraction de HDL, respectivement.
2. Centrifugeuse pendant 3 h (accélération 9, décélération 7). retirer ensuite 2 ml de la fraction HDL représentant la couche supérieure et soit conserver à 4 ° C ou conserver à -80 ° C.

7. Le dessalage et concentration des fractions lipoprotéiques

1. Pour éviter toute interférence avec la suite électrophorèse sur gel d'agarose et PCR, enlever le sel ajouté pendant gradient de densité ultracentrifugation en utilisant des dispositifs de filtre centrifuge avec la coupure de poids moléculaire approprié (3K tube pour le VLDL et 10K tube pour le LDL / HDL) comme décrit par les instructions du fabricant excessive.
   1. En bref, après avoir ajouté 2,5 ml de PBS froid (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM Na2HPO4 8, 2 mM KH2PO4; pH 7,4) centrifuge toute la fraction VLDL-recueillie pendant ultracentrifugation à gradient de densité à 4 ° C pendant 60 min en utilisant un rotor à godet oscillant.
   2. Dessaler la fraction LDL deux fois avec 10 ml de PBS refroidi à la glace pendant 30 minutes chacune. Ensuite, utiliser 13 ml PBS glacé deux fois pour dessaler la fraction HDL. Le volume PBS plus élevé est nécessaire pour améliorer la mobilité par électrophorèse sur gel d'agarose. Après centrifugation, retirer les contenant solutés de lipoprotéines et de garder à 4 ° C ou stocké à -80 ° C.

8. Agarose Gel Electrophoresis

1. Perfrom lipoprotéines électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le kit avec des modifications mineures des instructions du fabricant comme suit.
   REMARQUE: Cette étape est juste pour évaluer la qualité et la pureté des échantillons de lipoprotéines concentrés.
   1. En bref, obtenir 6 pi de la fraction de lipoprotéine dessalé avec une ultracentrifugation à gradient de densité et le charger sur un gel de lipoprotéine de pré-coulée. Utilisez lipop humainenormes rotein pour VLDL, LDL et HDL comme référence de taille. Effectuer une électrophorèse à RT à 100 V pendant 60 minutes en utilisant un tampon Rep Prep.
   2. Sécher le gel pendant 10 min, puis la coloration pendant 10 min à température ambiante avec Fat Red 7B. Destain le gel dans un mélange de méthanol-eau 75/25 (v / v) et on sèche à nouveau pendant 5 min.

9. RNA Extraction et purification

1. Perfrom isolement de miARN par HDL humain purifié en utilisant le kit sérum / plasma isolement miARN et purification.
   1. En bref, ajouter 1 ml d'ARN réactif de lyse à 200 pi de HDL purifiée, mélanger avec un vortex puis incubé pendant 5 min à température ambiante pour assurer la dissociation complète des complexes de nucléoprotéine et l'inactivation de RNases.
   2. Puis pic de 3,5 pi de Caenorhabditis elegans synthétique microARN (cel-miR-39, 1,6 x 10 ⁸ copies / ul) dans le mélange. Puis procéder à l'extraction d'ARN selon les instructions du fabricant.
2. Effectuer Purificatisur des extraits-miARN avec des colonnes de spin éluées selon les instructions du fabricant. Mesurer la concentration de miARN de HDL purifiée avec un spectrophorometer.
   NOTE: Elution de miRNA des colonnes de centrifugation utilisé 16 pi d'eau sans RNase.

10. Transcription inverse (RT-PCR)

1. Isolât 100 ng du miARN des HDL dopés avec des miARN synthétique (cel-miR-39) et une transcription inverse dans un volume réactionnel de 20 ul en utilisant le kit de transcription inverse et selon les instructions du fabricant.
2. Effectuer des contrôles appropriés sans modèle miRNA (NTC) et sans mélange inverse transcriptase enzyme (NRT).

11. PCR en temps réel (qRT-PCR)

1. Perfrom PCR en temps réel dans un volume total de 20 pi avec 2 ul d'une dilution 1: 2 de l'ADNc, 10 pi de mélange de PCR, 2 pi amorce universelle, 2 ul d'amorces miARN et de l'eau libre de RNase-4 pl.
2. Exécutez les reactidans des plaques à 96 puits à 95 ° C pendant 15 min, puis 45 cycles de 94 ° C pendant 15 secondes et 55 ° C pendant 30 secondes et une phase d'élongation à 70 ° C pendant 30 s.ec perfrom toutes les réactions en triple exemplaire .
3. Ensuite, les quantités relatives Calcuate de miARN en utilisant la méthode ^-ΔΔ Ct 2 après la normalisation du gène de ménage synthétique selon les instructions du fabricant.

Résultats

Isolement de lipoprotéines de haute densité après suppression des exosomes
Pour obtenir miRNA de HDL hautement purifié , il est nécessaire d'enlever les exosomes qui représentent une source de contamination miRNA ^7. Ceci a été réalisé avant l'ultracentrifugation en gradient de densité avec un kit disponible dans le commerce. Pour des raisons pratiques un protocole standard d'ultracentrifugation à gradient de densité trois...

Discussion

Identification de nouveaux marqueurs biologiques du sang aider au diagnostic clinique et le pronostic de différentes maladies. Les microARN ont connu pour posséder toutes les qualités de biomarqueurs et ont été montrés dans diverses études ^14-17. Dans cette étude, nous avons démontré méthode facile simple et rapide pour isoler miRNA de HDL plasmatique. Gradient de densité conventionnel procédé d' ultracentrifugation d'isolement de VLDL, LDL et HDL dépend de l' échantillonnage précis du plasma, une...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes en plastique Vacutainer Lavender K2EDTA  ;	Becton, Dickinson and Company	366643
centrifugeuse	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  ;
75004261 Densitomètre Densito 30PX	Mettler Toledo	MT51324450
solution ExoQuick	Invitrogen	4484451
Tube d’ultracentrifugeuse à paroi épaisse en polycarbonate	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifugeuse  ;	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B  ;	Sigma-Aldrich	201618
&beta ;-mercaptoéthanol  ;	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Dispositifs de filtration centrifuge 10K	Millipore	UFC901008
Appareils de filtration ultra-centrifuges Amicon 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit  ;	Laboratoires Helena  ;	3344,3544T
Normes de lipoprotéines humaines pour VLDL, LDL et HDL	LipoTrol ; Helena Laboratories	5069
Tampon de préparation de représentants  ;	Laboratoires Helena  ;	3100
RNeasy MinElute spin colonnes  ;	Qiagen
NanoDrop 1000 analyseur	Thermo Scientific
miScript II RT Kit  ;		Qiagen
CFX96 Touch	BioRad
miRNeasy Kit Sérum/Plasma	QIAGEN	217184
Tests d’amorce miScript	QIAGEN	141078139
kit PCR vert miScript	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0.20 µ ; Filtre à seringue stérile	M SIGMA-ALDRICH	Z227536