Wet Chemistry and Peptide Immobilisation sur polytétrafluoroéthylène pour l'amélioration de l'adhérence cellulaire

Résumé

L’adhérence cellulaire est essentielle à de nombreuses approches dans la recherche sur les biomatériaux et l’ingénierie tissulaire. Une technique étape par étape est présentée à l’aide de la chimie humide pour la modification de surface de l’important polymère PTFE avec des peptides.

Résumé

Doter matériaux de surface avec des propriétés de cellules-adhésif est une stratégie commune dans la recherche biomatériau et l'ingénierie tissulaire. Ceci est particulièrement intéressant pour les polymères déjà approuvés qui ont une utilisation de longue date en médecine parce que ces matériaux sont bien caractérisées et les questions juridiques liées à l'introduction de polymères nouvellement synthétisés peuvent être évités. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) est l'un des matériaux les plus fréquemment employés pour la fabrication de greffes vasculaires, mais le polymère manque d'adhérence cellulaire favorisant fonctions. Endothélialisation, soit une couverture complète de la greffe de surface interne avec une couche confluente de cellules endothéliales est considérée clé pour une performance optimale, notamment en réduisant la thrombogénicité de l'interface artificielle.

Cette étude porte sur la croissance des cellules endothéliales de PTFE peptidique modifié et compare ces résultats à ceux obtenus sur un substrat non modifié. Couplage avec leendothélial peptide adhésif de cellule Arg-Glu-Asp-Val (REDV) est réalisée via l'activation du polymère contenant fluorin utilisant le réactif naphtalénure de sodium, suivie par des étapes ultérieures de conjugaison. La culture cellulaire est réalisée en utilisant des cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) et une excellente croissance cellulaire sur la matière peptidique immobilisé est démontrée sur une période de deux semaines.

Introduction

Divers polymères utilisés en médecine qui ont été approuvés pour un certain temps ne présentent pas la biocompatibilité améliorée, à savoir, le manque de cellules-adhésivité, l' induction de l' encapsulation fibrotique et thrombogénicité, pour ne citer que quelques - uns. Les interactions entre le biomatériau et le système biologique a lieu principalement à la surface de l'implant. En conséquence, les recherches ont porté sur la modification de surface afin de créer des propriétés appropriées pour une application désirée, tout en laissant les propriétés de la matière en vrac non affecté. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) en tant que polymère physiologiquement inerte est utilisé dans de nombreux domaines médicaux tels que hernie treillis chirurgical ^1, ports médicaux ² et, surtout, des greffes vasculaires ^3.

Notamment en cas de contact avec le sang de la nature hydrophobe de PTFE provoque une adsorption non spécifique des composants du plasma, et en conséquence l'adhérence des plaquettes, ce qui entraîne souvent thrombotic événements et de l' occlusion du greffon ^4. En outre, le PTFE, comme la plupart des polymères, ne supporte pas l' adhésion cellulaire et la couverture qui serait une caractéristique souhaitable d'induire la formation d'une couche bénéfique des cellules endothéliales (EC) sur le (luminale) surface interne du greffon vasculaire ^5. Un endothélium biomimétique devrait remplir plusieurs des fonctions de son équivalent naturel, notamment ses propriétés antithrombotiques ^6. Une stratégie générale de modification biomimétique est basée sur le concept de doter le matériau exclusivement avec des cellules adhésivité tout en laissant les propriétés des matériaux en vrac non affecté. En outre, l' adhésion des plaquettes peut être réduite en incorporant l' anti-adhésif (anti-fouling) attribue ^7. - Divers peptides principalement dérivés de protéines de la matrice extracellulaire - ont été décrits qui améliorent fortement l' adhésion cellulaire en se liant à des récepteurs cellulaires, appartenant à la classe des intégrines ^8. L'êtrest exemple connu à cet égard est le peptide Arg-Gly-Asp (RGD) qui interagit avec la plupart des types de cellules. D'autres séquences d'acides aminés sont reconnus par les intégrines exclusivement exprimés sur des cellules spécifiques. Par exemple, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) et Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) ont été trouvés à se lier à CEs d'une manière spécifique ^9. L' immobilisation covalente de ces peptides a été effectuée sur une grande variété de matériaux intrinsèquement non adhésives , y compris les métaux et les polymères ^10,11.

PTFE poreux, plus précisément en PTFE expansé (ePTFE) - ainsi que le polyéthylène téréphtalate (PET) - est le matériau le plus important pour la production de greffes vasculaires ^12. Techniques physiques établies pour les traitements appropriés, tels que la modification de plasma ¹³ ou par des méthodes photochimiques ^14, sont entravés par le fait que les structures poreuses et / ou tubulaires ne sont pas faciles à traiter à l' intérieur des pores ou la lumière respectivement. La chimie humidele PTFE est une tâche difficile en raison de la nature hautement inerte du polymère contenant fluorin qui résiste à la plupart des attaques chimiques ^15.

Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement facile pour une stratégie de modification covalente. Adapté d'une procédure pour rendre le PTFE liable, les groupes fonctionnels ont été créés à la surface des matériaux qui servent de points d'ancrage pour la conjugaison en outre des molécules biologiquement actives.

Protocole

1. Préparation de sodium naphtalénure Activation Solution et activation de surface

Remarque: Effectuer des réactions dans une hotte bien ventilée. Suivez les règles générales pour la manipulation des solvants très inflammables et les métaux corrosifs comme le sodium métallique. Le naphtalène a une odeur très désagréable (de naphtaline), même en très petites quantités! Sauf indication contraire les réactions sont effectuées à température ambiante. L'azoture de sodium est très toxique! THF (99,9%, voir la liste des matériaux) a été stocké sur environ 20% (en volume) tamis moléculaire. Distiller THF avec une teneur notable en eau sur sodium. La formation de naphtalénure de sodium ne se produit pas si des traces d'eau sont présentes.

1. A une solution de 1,4 g (10,9 mmol) de naphtalène dans 20 ml de tétrahydrofuranne (THF, séché sur tamis moléculaire 3 Å), ajouter 0,25 g (10,9 mmol) de sodium métallique dans un flacon de 100 ml en verre à bouchon à vis équipé d'un PTFE- revêtu barreau d'agitation magnétique.
   Note: Dissolution peut être grandement améliorée en coupant le sodium en petits morceaux et le chauffage modeste (35 - 40 ° C). La solution finale a une couleur légèrement verdâtre foncé et peut être stocké dans des conditions strictement sèches.
2. Poinçonner des disques en PTFE d'un diamètre de 12 mm à partir de matériau en feuille d'épaisseur 0,5 mm. Mark un côté (par exemple, en utilisant une lettre tampon poinçon) et nettoyer avec de l' isopropanol.
3. Incuber PTFE échantillons individuellement dans la solution d'activation (étape 1.1) pendant 1 - 2 min à l'aide de forceps. Remarque: Le changement de couleur du blanc au brun foncé indique la réussite du traitement.
4. Ensuite rincer deux fois avec du THF, puis avec de l'isopropanol.
   Remarque: La solution de naphtalénure est épuisé lorsque sa couleur change pour un brun clair aqueux. solution naphtalénure Inutilisé (éventuellement contenant du sodium métallique) doit être décomposé en ajoutant lentement l'isopropanol avant élimination.
5. Oxyder les échantillons traités au peroxyde d'hydrogène (30%) contenant 20% (p / v) d'acide trichloroacétique pendant 3 h. lavageavec de l'eau et sèche. La surface a maintenant une légère apparence brunâtre. Remarque: L'activation et le résultat de l'oxydation dans une mouillabilité accrue de façon drastique la surface. Cette constatation a été examinée en détail précédemment ^14.
6. Traiter les disques oxydées avec 50% (v / v) hexaméthylènediisocyanate (HMDI) dans du THF sec pendant 2 heures, rincer avec du THF et laisser sécher.
7. Hydrolyser échantillons porteurs isocyanate dans l'eau pendant 2 - 3 h et sec. Remarque: La surface finale amino fonctionnalisée PTFE est beaucoup plus stable que les échantillons d'isocyanates porteurs et est compatible avec de nombreux agents de réticulation standard pour couplage supplémentaire.

2. Peptide Immobilisation

1. Préparer une solution de 20% (v / v) d'éther diglycidylique de diéthylène (diépoxyde) dans 50 mM de tampon carbonate, pH 9.
2. Placez les disques aminées avec le côté marqué individuellement dans une plaque 24 puits et ajouter 1,5 ml de la solution d'époxyde. Assurer une couverture complète des échantillons. Incuber pendant 2 heures et laver deuxfois avec de l'eau et une fois avec du tampon de carbonate.
3. Ajouter 50 ul d'une solution à 0,5 mg / ml de peptide (par exemple, REDV) dans 50 mM de tampon carbonate, pH 9 , contenant 0,01% de _NaN3, au fond des puits individuels d'une plaque à puits fraîche 24 et placer délicatement le disque à l' envers époxyfonctionnalisé -down ( par exemple, marquée vers le bas) sur la goutte de la solution de peptide. Assurez-vous que l'espace entre le fond du puits et le disque en PTFE est complètement mouillée en raison de l'action capillaire.
4. Incuber dans une chambre humide (par exemple, toute boîte en plastique refermable avec un couvercle de fermeture étanche) avec atmosphère humidifiée (en plaçant du papier de soie humide sur le fond) pendant au moins 3 heures ou toute la nuit.
   Note: Quoique le motif REDV peut être considéré comme bien caractérisé, d'une séquence d'acides aminés brouillés ou inverse peut être inclus comme témoin négatif supplémentaire.
5. Laver trois fois avec de l'eau et stériliser dans 50% d'isopropanol / eau pendant au moins 30 min. Avant cellule ensemencement, rinse les échantillons dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).

3. Cellule Semis

1. Cultivez HUVEC en utilisant des procédures de culture de cellules standards ^17,18.
2. Placer les échantillons peptidiques conjugués avec la partie modifiée dans un 24 puits. Utilisez des disques de PTFE non traités comme témoin.
3. Semences 5 x 10 ⁴ cellules HUVEC dans 2 ml de milieu par puits et incuber pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de _CO2 dans un incubateur.
4. Retirez les disques, rincer soigneusement pour éliminer les cellules seules et transférer dans une assiette bien fraîche 24. Ajouter 2 ml de milieu frais et on incube pendant la durée souhaitée (par exemple 24 h, w 1, etc.). Changer le milieu tous les deux jours.
5. Préparer une solution mère de 1 mg / ml de calcéine-AM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
6. Après la croissance des cellules supprimer le milieu, laver avec du PBS et ajouter PBS contenant 1 pl / ml de calcéine-AM tache (par exemple, 1 pi d'une solution mère par ml PBS). agiter et Incubat doucemente à 37 ° C pendant 45 min dans l'obscurité.
7. Laver avec du PBS et prendre immédiatement micrographies sur un microscope à fluorescence équipé de filtres FITC standards (Ex 488 nm, Em 515 nm). Utilisez grossissement de 100 fois. Effectuer triplicats de non modifiée ainsi que des échantillons traités.
8. En utilisant le logiciel ImageJ déterminer la zone colonisée par les cellules. Vous pouvez également compter les cellules manuellement ou utiliser ImageJ. Les deux méthodes donnent des informations similaires au sujet de la fixation et la croissance des cellules sur les surfaces respectives.

Résultats

Les résultats des étapes cruciales de réaction chimique ont été contrôlées par spectroscopie infrarouge (Figure 1). L'activation initiale avec naphtalénure de sodium génère des doubles liaisons - et, dans une moindre mesure - OH fonctionnalités. Le signal indiquant liaisons C = C disparaissent lors de l'oxydation, ce qui donne une surface portant presque exclusivement groupes hydroxyle. Analyse des autres étapes de conjugaison standards ne sont pas représentés ic...

Discussion

La description détaillée du protocole de modification de la surface du PTFE se compose d'étapes successives en commençant par l'élimination du fluor à partir du squelette polymère tel que représenté sur la figure 6. Par conséquent, une couche est formée qui contient une quantité abondante de carbone-carbone conjuguées doubles liaisons conformément à la couleur brun foncé qui se sont développées lors du traitement naphtalénure. oxydation standard avec acide peroxyde d'hydrogène donne une surf...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feuille PTFE 0,5 mm	Cadillac Plastic  ;	n/a
Peptide REDV	Genecust	n/a	synthèse personnalisée >pureté de 95
iso-propanol	Sigma Aldrich	34965
tétrahydrofurane (THF)	Sigma Aldrich	401757
diméthylsulfoxyde	Sigma Aldrich	D8418
tamis moléculaire 3 & Aring ;	Sigma Aldrich	208574
sodium métallique	Sigma Aldrich	483745
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
naphtalène	Sigma Aldrich	147141
peroxyde d’hydrogène 30 %	Sigma Aldrich	95321
acide trichloracétique	Sigma Aldrich	T6399  ;
diéthylène glycol diglycidyléther	Sigma Aldrich	17741
diisocyanate d’hexaméthylène (HMDI)	Sigma Aldrich	52650
Calcein-AM	Sigma Aldrich	56496
bicarbonate de sodium	Sigma Aldrich	S6014  ;
azoture de sodium	Sigma Aldrich	71290
24 plaques	de puits Greiner-Bio-One	662 160
ATR-FTIR spectrophotomètre Nicolet Magna-IR 850	; Nicolet	n/a
microscope à fluorescence Olympus X-70	Olympus	n/a
cellules endothéliales de la veine humbilicale (HUVECs)	Lonza	n/a
ePTFE greffe vasculaire	Gore	n/a

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