Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour la conversion directe de fibroblastes embryonnaires murins en cellules souches trophoblastiques pleinement fonctionnelles et stables par surexpression de dix jours de Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2.

Abstract

cellules souches Trophoblast (TSCs) surviennent à la suite de la première décision du destin cellulaire dans le développement des mammifères. Ils peuvent être cultivées in vitro, en conservant la capacité d'auto-renouvellement et de se différencier en tous les sous - types de la lignée de trophoblaste, ce qui équivaut à l'in vivo de cellules souches population donnant lieu à la partie fœtale du placenta. Par conséquent, TSCs offrent un modèle unique pour étudier le développement placentaire et embryonnaire par rapport extra-embryonnaire décision du destin cellulaire in vitro. Dès le stade de blastocyste partir, une barrière épigénétique distincte composée de méthylation de l'ADN et les histones modifications sépare hermétiquement les deux lignées. Ici, nous décrivons un protocole pour surmonter complètement cette lignée barrière par transitoire sur-expression de trophoblaste régulateurs clés Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 dans les fibroblastes embryonnaires murins. Les cellules souches trophoblastiques induites sont capables d'auto-renouvellement et sont presque identiques à blastocyste cellules souches trophoblaste dérivées in termes de morphologie, l'expression du gène marqueur et modèle de méthylation. Fonctionnelle in vitro et in vivo confirment que ces cellules sont capables de se différencier le long de la lignée trophoblastique générer des cellules géantes trophoblastiques et polyploïdes chimerizing le placenta lorsqu'elles sont injectées dans des blastocystes. L'induction de cellules souches du trophoblaste à partir du tissu somatique ouvre de nouvelles voies pour étudier les caractéristiques génétiques et épigénétiques de cette lignée extra-embryonnaire et offre la possibilité de générer des lignées de cellules souches du trophoblaste sans détruire l'embryon respectif.

Introduction

Récemment, une étude comparant plusieurs approches de la souris les cellules souches embryonnaires à trophoblaste conversion des cellules souches a révélé que, dans tous les systèmes analysés, la conversion de la lignée est restée incomplète. Au lieu de cellules souches induites ( le trophoblaste) de SSII dite tige de trophoblaste cellules analogues à des cellules ont été générées en conservant une mémoire du destin cellulaire d'origine ^1. Ici, nous avons suivi une approche différente de la génération CSTI. Similaire à l'induction directe de cellules souches pluripotentes à partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ^2, SSII ont....

Protocol

Toutes les expériences de souris ont été menées conformément à la loi allemande de protection des animaux et en accord avec l'approbation des comités locaux de protection des animaux institutionnels (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie [approbation Numéro d'identification: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Préparation des médias

1. Préparer le milieu 293T: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamine (2 mM), du pyruvate de sodium (1 mM), de pénicilline / streptomycine (1 x).
2. Préparer le milieu MEF: DMEM, 10% (v / v) de FBS, L-glutamine (2 mM),....

Results

Sur le plat où l' expression du transgène de la 4F est activée, les cellules changent rapidement morphologie (comparer Figure 2A et B). Autour de 14 jours - 21 régions transdifferentiated distinctes émergent (deux exemples sont donnés dans la figure 2B et C). Ces colonies primaires manquent morphologie typique TSC; mais une fois qu'ils sont sous-culture, morphologie caractéristique épithéliale avec des bords serrés et des limites claires qui rappellent f.......

Discussion

Le 4 facteur (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) Protocole de transdifférenciation basé présenté ici offre une méthode fiable pour générer fidèlement converti à partir de fibroblastes embryonnaires SSII de souris. En outre, la méthode est également applicable pour les post-natal des fibroblastes de la queue, mais avec une baisse de l'efficacité par rapport à des fibroblastes embryonnaires ^3. En général, la qualité des fibroblastes primaires est un facteur critique de transdifférenciation résultat et il faut pren.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyclate de doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissoudre dans du PBS stérile, préparer une solution mère à 2 mg/ml. Stocker les aliquotes à -20 ° ; C
Sel de diphosphate de chloroquine  ;	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Préparer une solution mère de 25 mM dans de l’eau stérile de qualité culture cellulaire. Stocker les aliquotes à -20 ° ; C
Polybrène (bromure d’hexadiméthrine)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Préparer une solution mère à 8 mg/ml dans de l’eau stérile de qualité culture cellulaire. Stocker les aliquotes à -20 ° ; C
facteur de croissance des fibroblastes recombinants humains 4	ReliaTech	300-131L	Dissoudre dans 0,1 % BSA stérile dans PBS, préparer 25 & micro ; g/ml de solution mère. Stocker les aliquotes à -80 ° ; C
Héparine sel sodique	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Préparer une solution mère de 1 mg/ml en la dissolvant dans du PBS stérile. Stocker les aliquotes à -80° ; C
ProFection Système de transfection de mammifères	Promega	E1200
PBS, sans calcium, sans magnésium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, sans glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH30071.03IR
Filtre à membrane en acétate de cellulose sans tensioactif	Corning	431220
Acides	aminés non essentielsThermoFisher Scientific	11140-035
Pénicilline Streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140-122
Pyruvate de sodium  ;	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine  ;	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoéthanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Diméthylsulfoxyde (DMSO), qualité culture cellulaire	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA  ;	Addgene	19780
Souris B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Souris	6965
129S2SV	Charles River	129