Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

Summary

Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.

Abstract

L’architecture des organes ramifiés tels que les poumons, les reins et les glandes mammaires résulte du processus de développement de la morphogenèse ramifiée, qui est régulée par une variété de signaux solubles et physiques dans le microenvironnement. La présente méthode est décrite pour étudier le processus de morphogenèse ramifiée en formant des tissus épithéliales tridimensionnels (3D) modifiés de forme et de taille définies qui sont complètement intégrés dans une matrice extracellulaire (MEC). Cette méthode permet la formation de réseaux de tissus identiques et permet le contrôle d’une variété de facteurs environnementaux, y compris la géométrie des tissus, l’espacement et la composition ECM. Cette méthode peut également être combinée à des techniques largement utilisées telles que la microscopie à force de traction (TFM) pour obtenir plus d’informations sur les interactions entre les cellules et leur ECM environnante. Le protocole peut être utilisé pour étudier une variété de processus cellulaires et tissulaires au-delà de la morphogenèse ramifiée, y compris l’invasion du cancer.

Introduction

Le développement des tissus épithéliaux ramifiés, appelés morphogenèse de ramification, est régi par, et des facteurs environnementaux physiques dérivés de cellules. Dans la glande mammaire, la morphogenèse de ramification est un processus itératif par lequel guidé la migration cellulaire collective crée une architecture arborescente. La première étape est la formation des bourgeons primaires des conduits de lait, suivi par branche d' initiation et de l' allongement de ^1,2. Invasion des branches dans le stroma environnant est induite par la libération systémique des hormones stéroïdes à la puberté. Les nouveaux bourgeons primaires déclenchent alors des extrémités des branches existantes, et ce processus continue de créer un arbre épithéliales ^3. Bien que de nombreux signaux biochimiques importants ont été identifiés, une compréhension globale des mécanismes cellulaires biologiques qui guident ce processus complexe du développement fait actuellement défaut. En outre, des études mécanistiques sur les influences des indices spécifiques sont difficiles à déconstruire de expéments in vivo, des perturbations et des mesures spatio - temporelles aussi précises ne sont souvent pas possible.

En trois dimensions (3D) des techniques de culture, telles que la culture ensemble d'organes, organites primaires, et des modèles de culture cellulaire, sont des outils utiles pour enquêter systématiquement sur ​​les mécanismes sous - jacents de la morphogenèse des tissus ^4-6. Ceux - ci peuvent être particulièrement utiles pour déterminer l'influence des facteurs spécifiques individuellement, telles que des forces mécaniques et des signaux biochimiques, sur une variété de comportements cellulaires, y compris la migration, la prolifération et la différenciation. ⁶ modèles de culture cellulaire d' ingénierie, en particulier, facilement activer la perturbation des cellules individuelles et leur microenvironnement.

Un tel modèle de culture utilise une approche basée sur la microfabrication à concevoir le modèle des tissus épithéliales mammaires avec structure 3D contrôlée qui forment de manière cohérente et reproductible branches qui migrent collectivement lorsque induite par l'unles facteurs de croissance ppropriate. Le principal avantage de ce modèle est la possibilité de manipuler avec précision et de mesurer les effets des facteurs physiques et biochimiques, tels que les modèles de contrainte mécanique, avec confiance statistique élevé. Cette technique, ainsi que la modélisation informatique, a déjà été utilisé pour déterminer les contributions relatives des signaux physiques et biochimiques dans la direction du développement normal des tissus épithéliales mammaires et d' autres épithéliums ramifiés ^7-11. Présenté ici est un protocole détaillé pour la construction de ces tissus de modèles, qui peuvent être facilement étendues à d'autres types de cellules et la matrice extracellulaire (ECM) de gels, et qui sert comme un outil potentiel pour les essais de produits thérapeutiques.

Protocol

1. Préparation des solutions

1. Pour préparer une solution à 5 mg / ml d'insuline, diluer l'insuline disponible en poudre avec 5 mM d' acide chlorhydrique (HCl) dans dH ₂ O (500 mg d' insuline dans le solvant 100 ml). Préparer 100 ml de solvant en ajoutant 50 ul de HCl concentré à 100 ml d' eau distillée (dH ₂ O).
2. Pour obtenir une solution de PBS 1x, diluer le 10x tampon phosphate salin (PBS) solution mère à 1x avec dH ₂ O dans des conditions stériles.
3. Préparer le polydiméthylsiloxane (PDMS) élastomère solution de la façon suivante: mélanger le prépolymère PDMS conjointement avec l'agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 (p w).
4. Préparer le milieu de culture cellulaire comme suit: 500 ml de milieu de Eagle modifié stocks Dulbecco: mélange nutritif F-12 (DMEM / F-12), ajouter 10 ml de sérum stérile fœtal bovin (FBS), 500 pi de réactif gentamicine, et 500 ul de 5 mg / ml d'insuline.
5. Afin de préparer la sérum-albumine bovine 1% (BSA) dans une solution 1 x PBS, ajouter 1% (en poids: V) de poudre de BSA à 1x PBS et bien mélanger.
6. Pour préparer une solution à 4 mg / ml de type bovin neutralisé collagène I, ajouter 50 pl de 10x solution saline équilibrée de Hank (HBSS) tampon, 30 ul de 0,1 N d'hydroxyde de sodium (NaOH), 30 ul de milieu de culture cellulaire, et 400 ul de bouillon de collagène à un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse réfrigérée. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas; éviter d'introduire des bulles. Pour éliminer les bulles, centrifuger brièvement le mélange à 4 ° C.
7. Préparer une solution fixative en diluant 16% de paraformaldehyde 1: 4 (v: v) dans du PBS 1x.
8. Préparer une solution d'étiquetage des noyaux en diluant la solution de marquage sous licence noyaux 1: 1000 (v: v) dans du PBS 1x.
9. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate et 0,3% de détergent (PBST) en mélangeant une solution 1 x PBS avec 0,3% (v: v) de détergent.
10. Préparer le tampon de blocage par dilution de sérum de chèvre à 01:10 (v: v) dans du PBST à 0,3%.
11. Préparer une solution d'anticorps primaire pour une protéine d'intérêt particulier en diluant priMarie anticorps (par exemple, de lapin anti-kinase d'adhésion focale (FAK)) 1: 200 (v: v) dans un tampon de blocage.
12. Préparer une solution d'anticorps secondaire par dilution d'un anticorps sonde conjugué fluorescent (par exemple, de chèvre anti-lapin) 1: 1000 (v: v) dans un tampon de blocage.

2. Préparation des élastomères Timbres pour micromodelage 3D

Remarque: les timbres en élastomère sont fabriqués avec PDMS.

1. Faire une solution PDMS dans le même rapport que décrit dans l'étape 1.3 et bien mélanger. Placez le mélange dans une chambre à vide pendant 15 à 30 minutes pour éliminer les bulles d'air qui ont été introduites au cours du processus de mélange.
2. Versez la solution dégazée dans un plastique peser bateau ou boîte de Pétri contenant un maître de silicium qui est lithographier avec des caractéristiques de la géométrie désirée. Pour de meilleurs résultats, guérir la solution PDMS à 60 ° C pendant environ 12 heures.
   Remarque: Les maîtres de silicium sont hautement personnalisables; ce protocole utilise des structures rectangulaires avec des dimensions de 50um x 200 um x 50 um espacées de 200 um d'intervalle. Les maîtres de silicium peuvent être faites en utilisant des techniques de photolithographie standard. En bref, une résine photosensible à base d'époxy est déposée par centrifugation sur une plaquette de silicium. Un masque détaillant les caractéristiques de timbre souhaitées est placé sur le dessus de la plaque de résine photosensible revêtue, qui est ensuite exposée à la lumière UV. Les caractéristiques souhaitées pas bloquée par le masque sont exposés à la lumière et la résine photosensible à ces endroits devient réticulé, tandis que le reste du revêtement de résine photosensible est soluble et peut être éliminé par lavage.
3. Après le PDMS a durci autour des caractéristiques souhaitées sur le maître de silicium, retirez les PDMS et maître du récipient en plastique. Séparez soigneusement les PDMS de la plaquette de silicium et retirer PDMS en excès autour des caractéristiques imprimées à l'aide d'une lame de rasoir propre.
4. Maintenant, coupez les PDMS à motifs avec des caractéristiques imprimés en timbres rectangulaires individuels (~ 8 mm x 5 mm) avec une lame de rasoir. Conservez ces caractéristiques-côte dans un articleune boîte de Pétri de 100 mm de diamètre.
5. En outre, utiliser la solution PDMS décrite à l'étape 1.3 pour faire des supports pour les timbres rectangulaires.
6. En utilisant une tournette, répartis ~ 2-3 g de la solution PDMS uniformément sur une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre et de guérir les PDMS pour ~ 12 h à 60 ° C comme à l'étape 2.1. Puis, en utilisant une lame de rasoir, couper la mince couche de PDMS en rectangles (~ 5 mm x 2 mm).
   Remarque: Deux supports sont nécessaires pour chaque timbre de PDMS faite à l'étape 2.3. Les supports peuvent être stockés dans les 100 mm de diamètre boîte de Pétri contenant les timbres PDMS.
7. Avant les PDMS timbres et supports peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, la stérilisation par immersion dans 70% d'éthanol et sèche à l'aide d'un aspirateur dans une enceinte de sécurité biologique (culture cellulaire hotte).

3. Préparation de la 3D épithéliale Tissues

1. Dans une enceinte de biosécurité, ajouter une goutte d'environ 50 pi de 1% de BSA dans du PBS au début de chaque timbre. Placer la goutte timbres couvert à 4 ° C pour une minimum de 4 heures pour assurer que la BSA adsorbée sur la surface du timbre.
2. solution Aspirer BSA des timbres PDMS.
3. Laver les surfaces des timbres à deux reprises avec un milieu de culture cellulaire (50 pi par lavage par tampon devrait être suffisant), aspiration après chaque lavage.
4. Manipuler les PDMS timbres et supports stérilisés à l'aide de courbes pincettes en acier inoxydable. Dans une enceinte de sécurité biologique, disposer d'un 35 mm de diamètre boîte de culture de tissu pour chaque PDMS timbre. Dans chaque plat, déposer deux PDMS supports séparés par une distance légèrement inférieure à la longueur des timbres PDMS.
5. À l'aide des pinces à épiler, stériliser autant de lamelles en verre circulaire (15 mm de diamètre, # 1) qu'il ya de timbres PDMS en utilisant 70% d'éthanol. Aspirer l'excès de liquide à partir des lamelles tout en les tenant avec la pince à épiler. Rangez les lamelles lavées dans un 100 mm de diamètre boîte de Petri séparée.
6. Répartir ~ 50 pi du mélange de collagène pour bien enrober la surface de chaque PDMS timbre.
7. Ramasserchaque PDMS revêtus de collagène timbre avec la pince à épiler et inverser délicatement. Abaisser les timbres inversés au-dessus du PDMS supporte disposé dans une culture tissulaire de 35 mm de diamètre, de forme concave de telle sorte que le collagène se trouve entre le poinçon et le fond de la boîte de culture tissulaire. Incuber les boîtes à 37 ° C pendant 30 min.
8. Distribuer ~ 50 pi du mélange de collagène restant sur chacune des lamelles circulaires (plus tard, ceux-ci seront placés au-dessus des tissus conçus pour encapsuler complètement eux dans le collagène) et les incuber à 37 ° C pendant 30 min.
9. Obtenir une boîte de culture de tissu de 100 mm de diamètre contenant des cellules épithéliales (ex. EpH4 souris des cellules épithéliales mammaires) à ~ 40% de confluence. Aspirer le milieu de culture cellulaire et laver une fois avec 10 ml de PBS 1X. Ajouter 2 ml de trypsine aux cellules et on incube à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
10. Ajouter 8 ml de milieu de culture frais à la boîte de culture de tissu contenant des cellules trypsinisées, en détachant les cellules adhérentes restantes de l'antenne. Mélanger doucement par pipetage et déplacer le mélange de cellules dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge à 100 x g pendant 5 min.
11. Aspirer le surnageant du tube conique et remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de culture cellulaire. En utilisant un hémocytomètre, compter les cellules pour déterminer la concentration de la suspension. Ajuster le volume de la suspension pour obtenir une concentration finale de 10 ~ ⁶ à 10 ⁷ cellules / ml.
12. Retirer les échantillons de collagène gélifiées de l'incubateur. Utilisation de la pince à épiler, soulevez doucement les timbres PDMS droite vers le haut pour les détacher du collagène moulé et jetez-les.
13. Distribuer ~ 30 ul de la suspension cellulaire concentrée sur la surface de chaque gel de collagène contenant des cavités moulées de géométrie désirée. Observer les cellules sous un microscope à fond clair avec un objectif 10X / 0,25 NA en agitant doucement du côté des plats à l' autre pour promouvoir le règlement intérieur des cavités cellule. Les cavités doivent être remplis dans les ~ 5 min.
14. Pour rEDéplacez cellules en excès autour des cavités, inclinez chaque boîte de culture de tissu sur le côté et passer doucement ~ 400 pi de milieu de culture cellulaire sur la surface du gel de collagène. Aspirer le liquide et répéter le lavage 1-2 plusieurs fois, la vérification des gels de collagène sous le microscope entre chaque lavage.
15. Une fois que les cellules excédentaires ont été dégagés autour des cavités remplies de cellules dans le moule de collagène, de placer des boîtes de culture tissulaire dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C pendant 15 min. Puis, en utilisant la pince à épiler, retourner doucement les lamelles de classe collagène enduit et placez-les sur le dessus des moules remplis de collagène cellulaires tels que le collagène des lamelles forme un bouchon sur les cavités remplies de cellules. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min.
16. Une fois que les bouchons de collagène ont adhéré au collagène moule rempli de cellules, distribuer ~ 2-2,5 ml milieu de culture cellulaire lentement sur la lamelle de verre au-dessus des gels. La culture des échantillons à 37 ° C pendant 1-3 jours.
    Remarque:24 h après l'ensemencement initial, les tissus épithéliaux peuvent être traités avec des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) pour induire une ramification.

4. immunofluorescence et analyse d'images

1. Aspirer le milieu de culture cellulaire à partir des boîtes de culture de tissus et d'ajouter suffisamment de solution de fixation pour couvrir les gels contenant des cellules. Incuber les boîtes à la température ambiante pendant 15 minutes sur un agitateur à 200 tours par minute.
2. Aspirer le fixateur, remplir les boîtes de culture tissulaire avec 1x PBS, et incuber à température ambiante pendant 15 min sur un agitateur à 200 tours par minute. Répéter deux fois pour trois lavages au total.
3. Pour marquer les noyaux: Aspirer le PBS à partir de la boîte de culture de tissu et de le remplacer par une solution Hoechst. Incuber à température ambiante pendant 15 à 20 min. Pour colorer pour FAK ou un autre marqueur qui est détectable avec des anticorps, passez à l'étape 4.5.
4. Aspirer la solution de marquage nucléaire et laver la g contenant des cellulesels trois fois avec 1 x PBS comme à l'étape 4.2. échantillons colorés peuvent être stockés dans 1 x PBS à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
5. Pour colorer pour une protéine d'intérêt: Aspirer le PBS à partir des boîtes de culture de tissus, ajouter 300 pi de 0,3% PBST et incuber l'échantillon à température ambiante pendant 15 min.
6. Aspirer le PBS, couvrir les gels avec un tampon de blocage et incuber sur un agitateur (200 rpm) à température ambiante pendant environ 4 heures.
7. Aspirer le tampon de blocage, couvrir les gels avec une solution d'anticorps primaire, et incuber sur un agitateur à 200 tours par minute pendant une nuit à 4 ° C.
8. Aspirer la solution d'anticorps primaire, ajouter une solution de PBST à 0,3%, et on incube sur un agitateur à 200 tours par minute à la température ambiante pendant 30 min. Aspirer le PBST et répéter toutes les 30 min pendant 3-4 heures.
9. Répéter les étapes 4.7 et 4.8, mais cette fois l'incubation avec la solution d'anticorps secondaire. Envelopper les boîtes de culture de tissu avec une feuille d'aluminium pour éviter photoblanchiment de l'anticorps secondaire. Après la final lavage, échantillons colorés peuvent être stockés dans 1x PBS à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
10. Pour visualiser des échantillons, utiliser un NA objectif 10X / 0,30 concentré sur le plan médian des tissus épithéliaux.
11. Pour visualiser les noyaux cellulaires, d' échantillons d'image fixe marqués avec un marqueur nucléaire en utilisant un objectif 10X / 0,30 NA sous illumination UV.
12. Pour visualiser les échantillons colorés pour une protéine d'intérêt, l' image en utilisant un objectif 10X / 0,30 NA sur un microscope inversé à fluorescence.
13. Pour créer des cartes fréquence de coloration des protéines des tissus multiples (typiquement 50 ou plus) de la géométrie initiale identique, première importation chacune des images en utilisant un logiciel d'analyse d'image standard (voir Matériaux) et les convertir en 8 bits en niveaux de gris.
14. Pour seuil de ces images, de les convertir en binaire (ie, tramée / noir et blanc) en définissant un point de coupure en niveaux de gris; les valeurs en niveaux de gris en dessous du seuil deviennent noires, et ceux au-dessus du seuil deviennent blancs. Ensuite, mélangerchacune des images binaires individuelles dans une pile d'une seule image.
15. Ensuite, enregistrer les images empilées (ie, aligner ou correspondre) dans le logiciel d'analyse. De nombreux logiciels d'analyse d'images viennent avec un plugin d'enregistrement disponible gratuitement.
    1. L'utilisation de chaque image dans une pile en tant que modèle pour l'alignement de l'image suivante, de telle sorte que les images de l'ensemble de la pile sont alignées par propagation. Enfin, superposition (projet) les images de la pile d'images alignés sur la base de l'intensité moyenne pour former une seule image avec une carte de fréquence de pixel. Cette image peut alors être codés par couleur en utilisant un logiciel de retouche d'image de choix ^10,11.

Results

Schéma général de microfabrication mammaire de tissu épithélial

Un schéma général de la procédure de microfabrication décrivant le déroulement du travail expérimental est représenté sur la figure 1. Le résultat final est une matrice de tissus épithéliaux de la géométrie et l' espacement identique qui sont complètement noyés dans un gel d'ECM. Une expérience représentative utilise des cellules épithéliales mammaires EpH4 de so...

Discussion

Le protocole décrit ci-dessus décrit une méthode permettant de produire des tissus épithéliaux identiques de forme prédéfinie, permettant un contrôle spatial du stress mécanique subi par les cellules du tissu. Un moule élastomère est utilisé pour créer des cavités dans le collagène de type I qui sont ensuite remplies de cellules épithéliales et recouvertes d’une couche de collagène supplémentaire de sorte que les cellules sont complètement encapsulées dans un environnement de matrice de collagène 3D. Une culture plus pou...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydiméthylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS Agent de durcissement	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Silicone à motifs lithographiques master	self-made	N/A
Bateau de pesée en plastique	Fisher Scientific	08-732-115
Boîtes de Pétri de 100 mm de diamètre	BioExpress	D-2550-2
Alcool éthylique 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Préparez une solution d’EtOH à 70 % (v :v) en mélangeant avec dH2O
Lame de rasoir	de sécurité américain	620179
1:1 Dulbecco' s Aigle modifié' s Médium : Jambon' s F12 Mélange de nutriments (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
sérum de veau fœtal (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' solution saline équilibrée (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insuline	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10x Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bovin collagène de type I (non pepsinisé)	Koken	IAC-50
Albumine de sérum bovin (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Pince à épiler incurvée en acier inoxydable	Dumont	7
Boîtes de culture tissulaire de 35 mm de diamètre	BioExpress	T-2881-6
15 ml Tubes coniques	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Couvercles en verre circulaires #1, 15 mm de diamètre	Bellco Glass Inc.	Commande
0,05 % 1x Trypsine-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldéhyde	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Détergent
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Remis en suspension dans dH2O à 50 mg/ml
Anticorps FAK anti-souris	de lapin Life Technologies	AMO0672
Chèvre anti-lapin Alexa 488 Anticorps	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Utilisé pour coder les cartes de fréquence des pixels.
FIDJI (ImageJ)	NIH	N/A	Logiciel d’analyse d’image gratuit utilisé pour le seuillage, l’enregistrement et la superposition d’images afin de créer une carte de fréquence de pixels. Le plugin StackReg a été utilisé pour l’enregistrement d’images binaires.