Criblage à haut débit d'Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

Les techniques d’extraction des génomes et des métagénomes se sont développées rapidement ces dernières années, tout comme les stratégies à moyen et haut débit pour le clonage et l’expression d’enzymes recombinantes. De plus, les ressources bioinformatiques et les dépôts associés, tels que (CAZy)^1,2, se sont considérablement développés. Cependant, l’exploitation de la diversité des enzymes microbiennes à des fins industrielles pose des défis considérables et la détermination empirique des activités enzymatiques est maintenant devenue un sérieux goulot d’étranglement. Par exemple, on estime qu’en utilisant les méthodes actuelles, nous ne pouvons prédire en toute sécurité les activités d’un maximum de 4 % des protéines de la base de données CAZy. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes pour surveiller les activités enzymatiques, elles ont toutes certaines limites. Des techniques bien établies basées sur la chromatographie combinée à la spectrométrie de masse sont disponibles pour évaluer les fragments oligomères des activités de la glycosyl hydrolase (GH)^3,4. Cependant, ces approches nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et sont généralement à faible débit. Les méthodes basées sur la mesure des sucres réducteurs telles que les dosages de l’acide dinitrosalicylique⁵ et de Nelson-Somogyi⁶ sont largement utilisées pour évaluer les activités de la GH. Cependant, ces tests ont un débit limité et peuvent être sujets à des réactions secondaires. Les substrats polysaccharidiques chromogènes individuels, tels que l’azurine réticulée (AZCL), sont largement utilisés pour la détermination des activités enzymatiques, mais l’achat de tous les substrats séparément et la distribution manuelle des poudres de substrat dans la plaque de test peuvent être lourds et coûteux⁷.

Nous avons développé une nouvelle génération de substrats d’hydrogel polymère chromogène (CPH) à base de colorants chlorotriazines qui, lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec une plaque filtrante à 96 puits, forment un système de dosage à haut débit. D’autres substrats de biomasse chromogène insoluble (ICB) ont été mis au point pour fournir des informations sur la disponibilité des substrats dans les mélanges de polymères complexes, tels que ceux qui existent dans la biomasse lignocellulosique. Chaque substrat peut être produit dans l’une des quatre couleurs, et des substrats de différentes couleurs peuvent être combinés dans un seul puits. Dans ce protocole, il est démontré que cette méthodologie peut être appliquée à une grande variété de polysaccharides et de protéines et au potentiel de criblage des GH, des polysaccharides lytiques monooxygénases (LPMO) et des protéases. Des protocoles spécifiques sont fournis pour l’utilisation de plaques à 96 puits et des résultats représentatifs illustrent la grande efficacité des kits de substrat CPH et ICB en tant qu’outils de criblage enzymatique.

Un avantage significatif des kits de dosage décrits, quel que soit le substrat, est qu’ils sont prêts à l’emploi dans les 15 minutes, après l’étape d’activation. Cela élimine le besoin d’assembler le test à partir de matériaux de substrat bruts, comme c’est le cas avec d’autres méthodes⁷. Les substrats CPH et ICB ont un excellent stockage (au moins un an à température ambiante), un pH et une stabilité de température ⁸ et ne nécessitent aucun équipement spécialisé ou formation. Les dosages CPH ou ICB sont basés sur une plaque filtrante à 96 puits à l’intérieur de laquelle la réaction avec l’enzyme est conduite. Si l’enzyme est active avec un substrat donné, des oligomères colorés solubles sont générés, produisant un surnageant coloré qui peut ensuite être filtré dans une plaque régulière à puits clair à 96 puits à l’aide d’un collecteur à vide ou d’une centrifugeuse ⁸.

Les substrats sont teints avec des colorants à base de chlorotriazine qui absorbent dans la gamme du spectre visible (VIS) et les couleurs individuelles (rouge, bleu, jaune et vert) peuvent être résolues à l’aide de la régression linéaire si différents substrats CPH de différentes couleurs sont mélangés dans un seul puits, et que l’enzyme agit sur plus d’un substrat. La plaque résultante avec les surnageants peut être mesurée à l’aide d’un lecteur de plaques micrométriques standard capable de mesurer l’absorbance dans la gamme VIS. Le mélange de différents substrats de couleurs différentes dans un seul puits augmente le débit du système d’essai, à un total de 384 expériences dans une plaque de 96 puits (4 substrats différents de couleurs différentes par puits).

CPH constituent un outil précieux pour évaluer l’activité spécifique d’une enzyme, tandis que les substrats ICB sont utilisés pour évaluer la capacité d’une enzyme à digérer un composant dans le contexte de mélanges de substrats complexes que les enzymes rencontrent habituellement dans la biomasse. Bien que les substrats ICB ne fournissent pas d’informations sur les spécificités enzymatiques individuelles, ils n’en constituent pas moins des outils utiles pour évaluer les performances commerciales des enzymes, des cocktails ou des bouillons.

1. chromogénique Assay avec CPH Substrats dans une plaque à 96 puits Format

1. L' activation de la plaque de kit de dosage
   1. Activez le filtre à 96 puits (contenant du bleu CPH-xylane) kit de dosage plaque (Liste des matériaux) en ajoutant une solution de 200 pi d'activation (obtenue avec le kit) dans chaque puits, suivi de 10 minutes d'incubation à la température ambiante sans agitation.
   2. Appliquer vide à l'aide d'un collecteur à vide (avec le bloc d'espacement à l'intérieur et toute norme, plaque de 96 puits transparente comme une plaque de collection) pour éliminer la solution d'activation existante. Il est également possible d'utiliser une centrifugeuse à 2700 g pendant 10 minutes pour cette étape à la place du collecteur à vide.
   3. Laver les substrats CPH en ajoutant 100 pi d'eau stérile et on applique le vide (ou d'une force centrifuge) pour éliminer le stabilisant. Répétez cette étape deux fois plus et les plaques sont maintenant prêts à utiliser.
2. la réaction enzymatique
   NOTE: Toujours inclure tamponseul en tant que témoin négatif et si les enzymes précédemment caractérisées possibles en tant que témoins positifs. Utilisez un nombre statistiquement approprié de répliques. Les substrats CPH sont stables entre pH 3,0 à 10,0, et le volume total de la solution d'enzyme de fin de tampon dans chaque puits ne doit pas dépasser 180 pl. Extrait de plante ou de bouillon de culture peuvent aussi être utilisés à la place d'une solution d'enzyme purifiée.
   1. Ajouter 150 ul de 100 mM de tampon d'acétate de sodium, pH 4,5 et 5 ul de solution -cellulase endo (jusqu'à une concentration finale de 1 U / ml) à chaque puits de la plaque de kit de dosage.
   2. Mettez la plaque de produit (une plaque claire et compatible avec le lecteur microplaque-plaque) sous la plaque de kit de dosage pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de réaction pendant l'agitation.
   3. Incuber la plaque de kit d'essai à 25 ° C pendant 30 min dans un agitateur horizontal à 150 tours par minute.
      Remarque: Le mélange de la réaction dans la plaque de kit d'essai durant l'incubation est essentiel pour parvenir à une cohérence et reprorésultat ductible. substrats CPH sont stables jusqu'à 90 ° C. Le temps d'incubation devrait être augmentée jusqu'à 24 h pour tester des bouillons de culture contenant une concentration inconnue de l'enzyme avec des substrats de MNC. A noter que les durées d'incubation appropriées dépendent de l'activité de l'enzyme (s), mais en général, s'il n'y a pas d'activité détectable dans les 24 heures, il est probable que l'enzyme ne dégrade pas le substrat testé. Une enzyme active est dégradant les polysaccharides insolubles chromogènes du substrat MNC en oligosaccharides chromogènes solubles, qui sont visibles en tant que surnageant de couleur.
   4. Placer la plaque de produit propre à l'intérieur du collecteur de vide avec le bloc d'espacement à l'intérieur.
   5. Placez le test kit plaque sur le dessus et appliquer le vide (pression négative maximale de -60 kPa). Il est également possible d'utiliser une centrifugeuse à 2700 g pendant 10 min.
      NOTE: Le filtrat contenant les oligosaccharides de couleur comme produit de réaction est maintenant dans la plaque de produit pour une analyse plus poussée ⁸
3. Détection et quantification
   1. Vérifier que le volume de liquide dans chaque puits de la plaque de produit est approximativement la même par inspection visuelle.
   2. Lire l'absorbance de la plaque de collecte à 595 nm pour le bleu CPH-xylane en utilisant un lecteur de plaque.
   3. En faisant une analyse des données, soustraire la mémoire tampon, seules les valeurs de contrôle négatif à partir des valeurs provenant des puits où l'on a ajouté une enzyme. Calculer la valeur moyenne et l'erreur type de la moyenne (SEM) dans les puits réplicats ^8.

2. chromogénique Assay avec AOI Substrats dans un 96 puits Format

1. la réaction enzymatique
   1. Ajouter 150 ul de 100 mM de tampon d'acétate de sodium, pH 4,5 et 5 ul de 31 U / ml endo -xylanase solution à chaque puits de la plaque de kit de dosage contenant de la paille AOI de blé rouge (concentration enzymatique finale dans le puits: 1 U / ml) .
      NOTE: Les plaques de kit d'essai (filtre à 96 puits plAtes contenant des substrats AOI) sont fabriqués comme décrit dans la littérature (voir la liste des matériaux). Les substrats d'AOI sont stables dans des tampons ayant un pH compris entre un pH de 3,0 à 10,0. Toujours inclure tampon seul comme témoin négatif, les enzymes commerciales comme un contrôle positif et utiliser un nombre statistiquement approprié de répliques.
      1. Ne pas activer les substrats ICB comme la plaque de substrat de CPH, mais retirer le stabilisateur en lavant trois fois avec 100 pi d'eau suivie d'une filtration sous vide ou centrifugation.
   2. Mettez la plaque de produit sous la plaque de substrat pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de substrat pendant l'agitation.
   3. Incuber la réaction à 25 ° C sous agitation à 150 tours par minute pendant 2 heures.
      NOTE: Une enzyme active est dégradant les polysaccharides chromogènes insolubles dans le substrat ICB en oligosaccharides solubles, qui sont visibles comme surnageant de couleur. substrats ICB sont stables jusqu'à 90 ° C. L'incubation time devrait être augmentée jusqu'à 24 h si enzymes non purifiées tels que des bouillons de culture sont utilisés.
   4. Placer la plaque de produit à l'intérieur du collecteur à vide avec le bloc d'espacement à l'intérieur.
   5. Placez le test kit plaque sur le dessus et appliquer le vide (pression négative maximale de -60 kPa) ou utiliser une centrifugeuse pour filtrer le produit de la plaque de kit d'essai dans le puits de la plaque de produit.
      NOTE: Le filtrat contenant les oligosaccharides de couleur en tant que produit de réaction est présent dans la plaque de recouvrement pour une analyse plus poussée ^8.
2. Détection et quantification
   1. Vérifier que le volume de liquide dans chaque puits de la plaque de recouvrement est approximativement la même par inspection visuelle.
   2. Lire l'absorbance de la plaque de collecte à 517 nm pour la paille de blé ICB rouge à l'aide d'un lecteur de plaque.
   3. En faisant une analyse des données - soustraire la mémoire tampon - seules les valeurs de contrôle négatif à partir des valeurs provenant des puits où une enzymeétait ajouté. Calculer la valeur moyenne et l'erreur type de la moyenne (SEM) dans les puits réplicats ^8.
      NOTE: En cas de dépistage enzymes inconnues, nous vous suggérons de faire une série de dilution afin d'obtenir des données plus détaillées sur la dynamique de l'activité de l'enzyme.

Le haut-débit et la capacité de multiplexage de ce test est basé sur un polymère insoluble dans chromogénique (ou protéine) hydrogel (CPH) des substrats disposés dans des plaques filtrantes à 96 puits. Les enzymes ainsi que des contrôles négatifs sont ajoutés à la plaque de kit d'essai (figure 1A) et les enzymes dégradent le substrat correspondant à produire un surnageant coloré (figure 1B). Une fois la réaction terminée, le surnageant est transféré dans une plaque de produit limpide puits et l'absorbance peut être mesurée directement à l' aide d' un spectrophotomètre approprié pour des plaques à 96 puits (figure 1C).

Un exemple d'une réponse à la dose de CPH-arabinoxylane xylanase à différentes concentrations de l'enzyme (0,00 à 0,75 U / ml) est représenté sur la figure 1D , lorsque la concentration d'enzyme décroissante peut être observée visuellement. A quant spectrophotométrique plus détailléification peut être utilisé pour tracer l'absorbance en fonction de la concentration enzymatique (figure 1E). L'intensité du signal correspondant à l'activité enzymatique. La reproductibilité du test est indiquée par les barres d'erreur (erreur standard de la moyenne, SEM, de trois répliques). Des expériences plus détaillées sur la reproductibilité de cet essai sont publiés ailleurs 8.

Figure 1. Traitement xylanase de CPH-arabinoxylane. A) Un schéma de la plaque de kit d'essai avec le substrat CPH (par exemple, CPH-arabinoxylane) chargé dans 96 puits puits de plaques de filtre juste avant l'addition d'enzymes 1 et 2 et le tampon contrôle -seulement (enzyme 1 avait une activité -xylanase endo); B) dégradation de CPH-arabinoxylane par l' enzyme 1 produit un surnageant de couleur; C) Sur Filtrat sous vide assistéion des surnageants de la plaque de produit, l'absorbance est mesurée par spectrophotométrie; D) , la plaque de produit contenant les produits de réaction après le traitement de CPH-arabinoxylane en 4 couleurs différentes avec différentes concentrations de l' endo -β-1,4-xylanase dans 100 mM tampon d'acétate de sodium, pH 4,5 pendant 60 min à température ambiante;. E) Quantification des produits de réaction de D à l' aide de spectrophotométrie S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Il existe différentes options pour l'utilisation de ce test dans le dépistage enzyme. Une option consiste à utiliser une plaque de 96 puits contenant différents polysaccharides pour le dépistage, par exemple, un petit nombre de (purifié) endo -enzymes avec une activité inconnue. Dans ce cas, le résultat montrera que les polysaccharides sont Dégradmesure par l'enzyme cible. Pour afficher ce principe, un -cellulase endo a été testée contre différents substrats CPH à 25 ° C. Trois concentrations différentes d'enzyme (0,5 U / ml, 1,0 U / ml et 5 U / ml) ont été incubées pendant 30 min. Le résultat est clairement visible dans la plaque de produit (figure 2A). La fiche produit pour cette endo -cellulase fourni par le fournisseur spécifie côté-activité pour le xyloglucane (tamarin), orge β-glucanes, glucomannane, xylane Birchwood et côté bas-activité pour galactomannane. Conformément à cela, l' activité supplémentaire pour cellulase a été trouvée contre CPH-β-glucane (orge), CPH-xyloglucane (tamarin), CPH-xylane (hêtre) et une faible activité contre CPH-galactomannane (figure 2B). Glucomannan n'a pas été testé. Les mêmes substrats de MNC ont été digérés avec les enzymes disponibles dans le commerce (trois différentes concentrations d'enzyme: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml et 1,0 U / ml) utilisés en tant que témoins positifs dans les mêmes conditions que le précédentexpérience. Tous les substrats ont été dégradés par l'enzyme témoin positif et l'intensité de l' augmentation du signal correspondant à une concentration plus élevée de l' enzyme (figure 2C).

Figure 2. Huit substrats CPH différentes ont été mises en incubation sous agitation à 25 ° C pendant 30 min. A) La plaque de produit de substrats différents CPH digérées avec une endo -cellulase, à différentes concentrations. B) Quantification de l'activité et de diverses activités latérale endo -cellulase. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne de trois répliques C) de l' activité de différentes enzymes commerciales au substrat correspondant CPH (endo-cellulase et 2-HE-cellulose;. E-LAMSE et CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucane (orge); E-XYAN4 et CPH-xylane, E-XEGP et CPH-xyloglucane, E-BLAAM et CPH-amylose, E-BMACJ et CPH-galactomannane; toutes les enzymes de Megazyme). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des deux répliques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La biomasse chromogénique (ICB) substrats insolubles sont un complément utile au répertoire de substrat chromogène parce qu'ils conservent en partie la disposition naturelle des polysaccharides dans les parois des cellules végétales qui sont le constituant majeur de la biomasse. CPH et ICB substrats sont utilisés dans notre exemple pour analyser les enzymes sécrétées de Phanerochaete chrysosporium lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu liquide. La configuration de la plaque de la plaque de kit d'essai est représenté sur la figure 3A, avec 19 CPH substrats et 5 substrats ICB (4 puits pour chaque substrat, figure 3B). P. chrysosporium était cultivated pendant trois jours, puis le surnageant de culture analysée. Par conséquent, 125 ul de tampon 200 mM a été transféré à chaque surnageant de culture bien et 25 ul ajouté. Trois conditions de pH différentes ont été testées en utilisant un tampon d'acétate de sodium à pH 4,0, un tampon de phosphate de sodium pH 6,0 ou pH 8,0 (figure 3C). La plaque a été incubée sous agitation (150 rpm) à 25 ° C pendant 2 heures.

Les produits de réaction ont été transférés dans la plaque de produit (figure 3D) et analysées. P. chrysosporium produit des enzymes pour la dégradation de divers glucanes, l' amidon et les xylanes (Figure 3E). des signaux plus faibles pourraient être détectés pour la hémicelluloses arabinan (betterave à sucre) et galactane pectique ainsi que pour RGI (soja). Les enzymes produites étaient plus actives dans des conditions acides (pH 4,0) que dans des conditions neutres ou légèrement basiques (pH 8,0). Activité inférieure vers des substrats ICB (Figure 3F)démontre que lorsque les polysaccharides sont dans un contexte plus naturel, l'efficacité de l'enzyme est pas de même qu'avec un polysaccharide pur et qui est la raison pour laquelle les substrats d'AOI montrent une vue plus réaliste de l'efficacité enzymatique, si elle était appliquée à la matière première ou pré matériel végétal traité.

Figure 3. Projection d'un surnageant de culture à partir d' une ancienne culture de Phanerochaete chrysosporium liquide 3 jours en utilisant une plaque de substrat multicouche contenant 19 CPH et 5 ICB substrats. A) un schéma de la configuration de la plaque avec 4 puits pour chaque substrat individuel (fond gris = substrats CPH, fond orange = substrats AOI). B) Photo de la plaque d'essai contenant le substrat. C) Schéma montrant les conditions de tampon utilisées dans cette expérience (200 mM d' acétate de sodium pH 4,0, le phosphate de sodium pH 6,0 et de phosphate de sodium pH 8,0). D) image de la plaque de produit après 2 heures à 25 ° C. E) absorbances ont été détectés à 517 nm et tracées pour chaque substrat CPH individuel et F ) les résultats de substrat ICB pour les enzymes respectives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les substrats chromogènes peuvent également être utilisés pour étudier les effets synergiques en utilisant un mélange de différents substrats colorés MNC dans un puits et l'analyse du surnageant de réaction après le traitement en utilisant des enzymes uniques ou des cocktails d'enzymes.

Dans l'exemple suivant représenté sur la figure 4, la cellulose CPH-rouge et des substrats CPH-xylane jaune ont été mélangés à un peu près équAl dans 96 puits , les puits des plaques de filtre. La figure 4A montre les produits de réaction de couleur après un traitement de 1 heure à température ambiante, sans enzyme (témoin), de la cellulose cel (2 U / ml), la xylanase xyl (1 U / ml) et mélange des deux enzymes (3 répétitions pour chaque méthode) dans 100 mM de tampon acétate de sodium pH 4,5. Pour l' analyse, le produit réactionnel a été quantifié par spectrophotométrie en balayant le spectre d'absorbance de 350 nm à 700 nm (figure 4B). Souvent , une inspection visuelle seule ne peut donner une indication si l'enzyme agit sur ​​un ou plusieurs substrats, cependant enregistré les spectres d'absorption provenant de différents colorants peuvent également être résolu en utilisant une régression linéaire simple 8 pour donner une indication plus précise de l'ampleur de la dégradation de chaque substrat à partir du mélange.

En utilisant des substrats sous forme de mélanges CPH sensiblement ajoute au débit de l'essai, ce qui permet screening contre un maximum de 4 substrats différents dans une expérience (un puits). Dans l'exemple illustré quatre substrats différents utilisés: CPH-de β-glucane bleu (orge), jaune CPH-xylane (hêtre), vert CPH-amylose et rouge CPH-pectique galactane (lupin). La disposition de la plaque de substrat est représentée sur la figure 4C et une image de la plaque d'essai sur la figure 4D. La réaction a été réalisée dans 100 mM de tampon acétate de sodium pH 4,5 pendant 30 min à 25 ° C et à 150 tours par minute. Premières enzymes individuelles avec augmentation de la concentration de l' enzyme ont été testées avec le substrat correspondant CPH (Figure 4E) et le surnageant de couleur a été reçu comme prévu dans la plaque de produit (Figure 4F, ligne 1A - 12D). La ligne E contenait les deux substrats différents CPH jaune CPH-xylane et le bleu CPH-β-glucanes qui ont été dégradées avec différents rapports des enzymes correspondantes endo -xylanase et d' endo - glucanase. Après la réaction, le résultat est Visible dans la plaque de produit: la couleur du produit de réaction était plus sombre vert-bleu, lorsque plus endo glucanase était présent (Figure 4F, 4E-6E) et transformé en un jaune-vert clair, lorsque la -xylanase concentration endo augmenté ( Figure 4F, 10-12E). La même chose est visible dans la ligne F, où les deux substrats rouge de galactane CPH-pectique et jaune CPH-xylane ont été dégradés avec endo -galactanase et endo -xylanase. Tous les quatre substrat MNC de couleur différente sont présents (figure 4F, 1G-12F) et des enzymes uniques dégradé le substrat CPH approprié et en ajoutant des enzymes supplémentaires d' une combinaison des produits de réaction de couleur a été reçue.

La figure 4. Une combinaison de deux substrats différents CPH, CPH-cellulose , rouge et jaune CPH-xylane, traitée avec des enzymes différentes. UNE) Surnageants de réaction après un traitement de deux substrats avec endo -cellulase (cel) ou endo -xylanase (xyl) ou les deux enzymes. B) des spectres d' absorbance des surnageants de réaction. Une combinaison de quatre substrats CPH différents traités avec différentes enzymes C) Schéma de la plaque de substrat contenant les substrats CPH:. Bleu CPH-β-glucane (orge), jaune CPH-xylane (hêtre), vert CPH-amylose et CPH- rouge galactane pectique (lupin) D) Image de la plaque d'essai contenant les différents substrats CPH E) Schéma de la plaque du produit faisant apparaître le rapport des enzymes ajoutées (concentrations nominales (NC):.. glu = 1 U / ml endo glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo amylase et gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Photo de la plaque de produit après incubation de 30 min à 25 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Liste des disponibles chromogénique Polymer Hydrogel (CPH) et Insoluble chromogénique Biomasse (ICB) substrats.

Il y a deux demandes de brevet déposées impliquant la plaque CPH essai de substrat de 96 puits et 96 puits substrat ICB essai (WO2015036000 et le Danemark PA 2015 70311).