Un haut contenu In vitro Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Résumé

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Résumé

La perte de cellules β productrices d’insuline est une caractéristique centrale du diabète. Bien qu’une variété de thérapies de remplacement potentielles soient à l’étude, l’expansion des β cellules endogènes des îlots pancréatiques productrices d’insuline reste une stratégie attrayante. β-cellules ont une activité régénératrice spontanée limitée ; Par conséquent, un effort de recherche crucial consiste à développer une compréhension précise des voies moléculaires qui limitent la croissance des cellules β et à identifier des médicaments capables de surmonter ces contraintes. Ici, une méthode automatisée de criblage de cellules primaires basée sur l’image à haut contenu pour identifier les petites molécules favorisant la réplication β cellulaire est présentée. Plusieurs limites des méthodologies précédentes sont surmontées. Premièrement, l’utilisation de cellules primaires d’îlots pancréatiques plutôt que d’une lignée cellulaire immortalisée maximise la rétention des contraintes de croissance in vivo. Deuxièmement, l’utilisation de cultures d’îlots de Langerhans à composition mixte plutôt que d’une lignée β permet d’identifier à la fois les stimulateurs de croissance restreints à la lignée et les stimulateurs de croissance généraux. Troisièmement, la technique rend pratique l’utilisation des îlots primaires, une ressource limitative, grâce à l’utilisation d’un format de 384 puits. Quatrièmement, la variabilité expérimentale préjudiciable associée à la qualité erratique de l’élevage des îlots est surmontée par l’optimisation des paramètres d’isolement, de dispersion, d’ensemencement et de culture. Cinquièmement, les difficultés de mesurer avec précision et cohérence le faible taux de réplication basale des cellules endocrines des îlots pancréatiques sont surmontées par des paramètres d’immunocoloration optimisés, l’acquisition et l’analyse automatisées des données ; L’automatisation améliore simultanément le débit et limite le biais de l’expérimentateur. Les limites notables de cet essai sont l’utilisation de cultures d’îlots dispersés qui perturbent l’architecture des îlots, l’utilisation de rongeurs plutôt que d’îlots humains et les limites inhérentes au débit et au coût associés à l’utilisation de cellules primaires. Il est important de noter que la stratégie est facilement adaptée aux études de réplication des îlots de Langerhans humains. Ce test est bien adapté pour étudier l’effet mitogène des substances sur les cellules β et les mécanismes moléculaires qui régulent la croissance des cellules β.

Introduction

Le diabète englobe un ensemble de troubles qui partagent le point final de la perturbation de l'homéostasie du glucose commun. Bien que les mécanismes pathogènes de sous - types de diabète sont distincts, ils partagent la conséquence de la masse β-cellulaire a diminué, soit la perte de la capacité de production d'insuline ^1,2. À l' heure actuelle, les stratégies de traitement du diabète reposent sur ​​l' administration chronique de l' insuline exogène, une stimulation pharmacologique de la production d'insuline ou à l' amélioration de la sensibilité à l'insuline, et plus rarement, la transplantation d'îlots pancréatiques ou ^3,4 du pancréas entier. Malheureusement, le succès de ces stratégies est de courte durée et / ou ne parvient pas à récapituler suffisamment la fonction de production d'insuline endogène. Malgré l'utilité de développer une méthode pour stimuler la régénération β-cellulaire, une telle approche existe. Par conséquent, un objectif majeur de la recherche sur le diabète est de développer des méthodes pour générer des cellules ß nouvelles ou pour développer la masse β-cellulaire endogène ⁵ . Bien que la régénération β-cellule à partir de sources renouvelables telles que les cellules souches embryonnaires progresse, la sécurité et l' efficacité des préoccupations rendent la poursuite de stratégies alternatives, y compris l' expansion des cellules bêta matures, une priorité ^6,7. Surtout, la principale source des cellules ß nouvelles in vivo les cellules ß pré-existantes plutôt que des cellules souches spécialisées ^8,9. Bien que les cellules ß semblent avoir une capacité de replication limitée, une faible augmentation de la masse des cellules β (~ 30%) peut être suffisante pour rétablir l'homéostasie du glucose, dans de nombreux diabétiques. En outre, dans la stimulation pharmacologique in situ de la masse β-cellulaire est une stratégie de traitement potentiellement peu coûteux et évolutive. Ici un procédé de criblage à haut contenu pour identifier et caractériser les petites molécules qui stimulent la croissance des cellules β est présenté.

Une variété de méthodes expérimentales in vitro peuvent être utilisées pour identifier des produits et / ou des molécules tha gènest promouvoir la réplication β-cellule primaire. Les premiers efforts pour mesurer la β-cellulaire réplication induction utilisés culture rongeur pancreata foetal ou de cultures d'îlots isolés intacts pour mesurer ^[3 H] thymidine, l' incorporation de BrdU ou organismes mitotique au sein de l'aldéhyde-thionine ou de l' insuline population tachée en réponse à des conditions de traitement spécifiques ^{10, 11.} Ces approches in vitro et variantes proches de celui - ci ont plusieurs limites. Déficiences notables figurent (1) l'utilisation de cellules fœtales qui, contrairement à cellules bêta matures, affichent un taux de réplication β-cellule basale élevée et sont la croissance régulée d'une manière distincte ^12; (2) la nature subjective de expérimentateur dépendant arbitrage des événements de réplication β-cellulaire; (3) le travail et la nature intensive de temps de expérimentateur dépendant comptage des événements de réplication β-cellulaire retarde le débit expérimental; (4) l'utilisation de l'énergie nucléaire incorporation / tache / apparence pour identifier la réplication mêmets et une tache cytoplasmique non-chevauchement pour identifier les cellules ß conduit à mésattribution des événements de réplication non-β-cellulaire à proximité de ß-cellules.

Plus récemment , les cellules ß-primaires matures ont été utilisées pour évaluer l'impact du transgène sur-expression ainsi que le traitement du produit du gène ou d'un composé sur la réplication β-cellulaire ^13-16. Cependant, ces études ont également compté sur le comptage subjective des événements de réplication, les méthodes de staining- cytoplasmique ou non spécifiques pour l' identification β-cellulaire et / ou étapes de main-d'œuvre qui limitent le débit, par exemple, individuelle plaquage slide-puits de cellules ou îlots intacts inclusion dans la paraffine et le traitement ^17. En particulier, une méthode de criblage de réplication β-cellule humaine basée sur l' image, similaire à celui présenté ici, a été publiée ^18; cependant, l'utilisation réussie de cet essai n'a pas été démontrée et l'utilisation d'îlots humains pour le dépistage primaire ne peut pas être largement feasible.

Une stratégie alternative pour l'identification des substances de réplication de promotion est d'évaluer l'induction de lignes β-cellulaires croissance. Les efforts initiaux utilisés ß-lignées cellulaires transformées telles que MIN6 cellules ou INS 832/13-cellules ^14,19-21. Cependant, ces lignées cellulaires montrent une croissance effrénée et portent peu de ressemblance avec les cellules ß bien différenciées ^22. Par conséquent, la capacité de croissance induction est minime, de la pertinence claire et parfois difficiles à récapituler. Une stratégie améliorée pour le criblage à base de cellules en ligne utilise des "réversiblement transformé" cellules qui sont la croissance arrêtée en l'absence de tétracycline (doxycycline) SV40 dépendante T expression de l' antigène ^23,24. Cependant, il est difficile de savoir si ces cellules reviennent à un état β-cell-like "normal" lors du retrait de la doxycycline. Malheureusement, l'utilisation de ces cellules a donné des composés favorisant la croissance généralisée qui ne semblent pas avoir une utilité immédiate24. Dans l' ensemble, l'utilisation de lignées cellulaires pour étudier la régulation de la croissance d'un type de cellule présentant une activité de réplication spontanée minimale peut avoir une applicabilité limitée.

La plate - forme de criblage réplication β-cellule présentée ici utilise les cellules ß primaires de rat matures pour maintenir la régulation de la croissance in vivo dans la mesure du possible, les cultures d' îlots de cellules de composition de type mixte de cellules pour permettre l' identification des activités favorisant la croissance de la lignée restreinte, multi -Bien mise en forme afin de maximiser le débit et l'analyse automatisée afin d'éliminer les préjugés et faciliter le débit. L' utilisation réussie de cette plate - forme a permis l' identification de plusieurs composés qui favorisent la réplication β-cell ^25,26. En outre, l'essai a été utilisé pour des études de structure-activité des relations et des expériences épistasie chimiques pour fournir des indications mécanistiques dans la régulation moléculaire de la réplication des cellules β. La plate-forme a été présentée adapté avec succès foenquête sur la réplication β-cellulaire à base d'ARNi r lentiviral pathways ^25. Limites de l'essai comprennent l'évolutivité limitée (utilisation de cellules primaires), l'utilisation de rongeurs plutôt que des cellules d'îlots humains (bien que le dosage peut être adapté pour des études d'îlots humains), les frais associés à l'imagerie à base d'anticorps et l'utilisation des îlots primaire, l'utilisation des îlots dispersés (architecture des îlots perturbés) afin de faciliter l'acquisition d'image automatique et fonction de la disponibilité d'un microscope automatisé avec l'acquisition de l'image et la capacité d'analyse. Bien que facile in vivo méthode de criblage pour identifier des produits géniques ou des composés qui stimulent la régénération β-cellulaire in situ serait idéal, une telle plate - forme est pas encore disponible ^27. Par conséquent, la plate-forme décrite est appropriée pour chercheur intéressé à enquêter sur la plupart des aspects de la réplication β-cellulaire.

Protocole

Ce protocole a été réalisé conformément à la Commission institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC) de l'École de médecine de l'Université Stanford. Le protocole décrit est redimensionnée pour l'isolement des îlots de six 250-300 g (8 - 9 semaines) mâles de rats Sprague-Dawley, ce qui est suffisant pour générer de 228 puits d'une plaque de 384 puits pour l'évaluation de la réplication des îlots de cellules.

1. Préparation du matériel

1. Préparer des compositions de revêtement avant d'initier l' isolement des îlots en collectant le milieu conditionné de 804G cellules de carcinome de la vessie de rat maintenues à confluence pendant 3 jours (20 ml de RPMI1640) dans une 15 cm de boîte de culture ²⁸ tissulaire. Filtre stérile et de stockage (-20 ° C) du milieu conditionné pour une utilisation ultérieure.
2. Stériliser les instruments chirurgicaux (une 12 cm forceps de tissu à dents, un de 11,5 cm de ciseaux fins, l'un de 14,5 cm ciseaux chirurgicaux, les deux pinces courbe 16 cm, une 12 cm hémostatique courbe, une poignée de scalpel 12 cm) et un tamis de tissu à 30 mailles avant pour initialiseriating isolement des îlots.
3. Préparer une solution de digestion du pancréas par dissolution de 60%: mélange de 40% de la classe I purifiée: classe collagénase II (activité totale de la collagénase de 300.000 - 400.000 unités) dans 60 ml de solution saline équilibrée de 1 x Hanks (HBSS) complétée avec du calcium et du magnésium. Charge 10 ml de tampon de digestion du pancréas dans 10 ml de seringues (six) avec une aiguille G 1 "22 et la place sur la glace.
   Nota: 10 ml de solution de digestion est injecté par rat. L'échelle en conséquence.
4. Préparer 4,5 ml de cocktail anesthésiant dans une hotte ventilée par mélange de 1,3 ml de kétamine (100 mg / ml), 0,2 ml de xylazine (100 mg / ml) et 3 ml de PBS. Préparer le cocktail anesthésique à 1 h d'initier l'isolement des îlots.
5. Préparer un tampon de lavage en ajoutant 25 ml de sérum de veau nouveau-né à 500 ml d'HBSS. Placez le tampon de lavage sur la glace pour une utilisation ultérieure.
6. Préparer 1 bouteille de milieu d'îlots qui est de 500 ml de milieu Eagle modifié faible taux de glucose de Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 5000 unités / ml de pénicilline et 5000 pg / ml de streptomycine.
7. Préparer îlot moyen de la fonction de la solution la fonctionnalité / viabilité (500 ml) avec 2% de FBS, 2 mM de glutamine, 5 mM de glucose, 5000 unités / ml de pénicilline et 5000 pg / ml de streptomycine. Rangez les médias de la fonction des îlots (4 ° C) pour une utilisation ultérieure.
8. Préparer 40 ml de tampon de blocage par addition de 2,5 ml de sérum d'âne et 0,12 ml de Triton X-100 à 37,38 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Magasin tampon de blocage (4 ° C) pour une utilisation ultérieure.
9. Obtenir les anticorps nécessaires avant d'engager le protocole.
   Note: PDX-1 (TRITC) et Ki-67 (FITC) co-coloration est utilisé pour le dépistage de la réplication β-cellule primaire. Pour l'analyse de réplication lignée spécifique, effectuer des immunofluorescence pour des marqueurs supplémentaires d'identité de cellules (insuline, glucagon, vimentine ou somatostatine; TRITC) ainsi que nucléaire (DAPI), PDX (Cy5) et Ki-67 (FITC) coloration. Alternative repdes marqueurs de publica-, par exemple, PCNA, peuvent également être utilisés.
10. Préparer un plan de traitement 228 puits avec chaque condition de traitement effectué en quadruple. Inclure POSITIF (5-Iodotubercidin [1] iM ou dipyridamole [15 uM]) et le véhicule de contrôle (DMSO 1: 666 dilution) puits.

2. Perfusion du pancréas

1. Anesthésier le rat par injection intrapéritonéale d'une solution de cocktail anesthésiant dilué (0,30 ml / 100 g de poids corporel). Une fois que le rat est entièrement anesthésié et ne répond pas à des stimuli nocifs, effectuer la dislocation cervicale.
2. Placez le rat euthanasiés en position couchée (orientation cranio-caudale) sur une pile de serviettes en papier et pulvériser la zone abdominale avec 70% d'éthanol.
3. Ouvrir la cavité abdominale avec une demi-entaille (base au niveau de la région pubienne) et se rétracter dans la direction de la peau rostrale au-dessus de la poitrine afin d'exposer la cavité abdominale.
4. saisir délicatement le duodénum en utilisant deux paires de pinces incurvées, recherchez l'entrée duodénale du b communconduit ile (sphincter d'Oddi) et serrer l'ouverture du duodénum à la papille avec un hémostatique courbe.
5. Soulevez le hémostatique incurvé utilisé pour bloquer la voie biliaire principale papille et de saisir le canal biliaire près de foie en utilisant une pince incurvées. Utilisez dissection avec la pince incurvées pour isoler et exposer le canal biliaire.
6. Repositionner le rat avec le proximal de la tête et les pieds distale.
7. Cathétériser le canal cholédoque (CDB) au niveau ou juste en aval de la jonction des canaux hépatiques kystiques et communs avec une solution de digestion pancréatique chargé en seringue de 10 ml et injecter lentement 10 ml de la solution de digestion du pancréas. Alors que l'injection, soutenir la CDB avec une poignée de scalpel. Repositionner l'aiguille si le conduit et le pancréas ne parviennent pas à gonfler.
8. Retirer le pancréas gonflé à l'aide de la pince incurvées et des ciseaux fins pour le séparer du côlon descendant, des intestins, de l'estomac et de la rate. Placez le pancréas gonflés sur la glace dans un tube de 50 ml contenant 5 ml de solution de digestion du pancréas.
   Remarque: Pour obtenir un rendement maximal des îlots, recueillir toutes les pancreata dans les 30 minutes et lieu seulement 1 ou 2 pancreata dans chaque tube 50 ml de digestion.

3. Dissociation du Pancréas

1. Une fois que tous les pancreata sont collectées, placer les tubes de digestion dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Remuer doucement les tubes toutes les 3 min.
2. Après 15 min, agiter vigoureusement (verticalement) les tubes 10 fois et ajouter 10 ml de tampon de lavage à froid. secouer vigoureusement les tubes supplémentaires 5 fois et placer sur la glace.
3. Remplir les tubes de digestion à 50 ml avec le tampon de lavage à froid et mélange en inversant les tubes 5 fois.
4. Centrifuger les tubes à 97 xg à 4 ° C pendant 1 min et versez le surnageant. Veillez à ne pas déloger le tissu granulé.
5. Ajouter 25 ml de tampon de lavage et remettre en suspension le tissu par vortex doucement. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 fois plus.
6. Placez un tamis de tissu de 30 mesh sur une sterile bécher de 250 ml et verser la suspension de tissu sur le tamis. Rincer le tube de digestion avec 20 ml supplémentaires de tampon de lavage et versez sur le maillage. Les tissus du pancréas et de la graisse non digérés sont éliminés à l'étape suivante.
7. Verser le matériau filtré en deux frais tubes de 50 ml et sédimenter le tissu par centrifugation à 97 xg pendant 1 min à 4 ° C. tubes de surnageant et invertis Décanter pour drainer l'excès de tampon.

4. Purification de Islets

1. Ajouter 20 ml de solution froide diatrizoate polysaccharose / sodium (1,119 g / ml) Densité du tissu pancréatique granulée. Remettre en suspension de façon homogène le contenu de chaque tube par pipetage vers le haut et vers le bas à cinq reprises.
2. superposer délicatement la solution de diatrizoate polysucrose / sodium avec 10 ml de HBSS. Maintenir une interface liquide forte en ajoutant lentement la HBSS le long de la paroi du tube.
3. Centrifuger le pancréas digéré à 560 g pendant 15 min (4 ° C) avec une faible accélération et aucun frein.
4. Collect la couche d'îlots de l'interface en utilisant une pipette de 10 ml et placer des îlots dans 50 ml de nouveaux tubes. Ne pas mettre en commun des îlots à ce stade.
5. Ajouter 40 ml de tampon de lavage à chaque tube de 50 ml et de spin pendant 1 min à 140 xg à 4 ° C.
6. Verser le surnageant et remettre en suspension les îlots regroupés dans 50 ml de tampon de lavage par inversion des tubes à plusieurs reprises. Centrifuger les tubes pendant 1 min à 97 g, à 4 ° C pour collecter les îlots dans une pastille.
7. Verser le tampon de lavage et répéter le lavage. Apportez des îlots dans la culture de tissus capot et aspirer le surnageant.
8. Remettre en suspension dans chaque tube d'îlots dans 6 ml de milieu d'îlot.
9. Transfert des îlots de chaque tube de 50 ml dans un puits de six puits boîte de culture de tissu. Agiter le plat à 6 puits pour recueillir des îlots au milieu du puits et observer la qualité de l'îlot et la pureté sous un microscope.
10. Manuellement recueillir des îlots en utilisant une pipette ml 1 et transférer les îlots cueillis dans la adjacentepuits contenant 6 ml de milieu d'îlots. Répétition tourbillonnement des îlots et la cueillette jusqu'à ce que> 90% de pureté sont obtenus.
11. Transférer les îlots purifiés dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 20 ml de milieu d'îlots.
12. Placer les îlots dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% _CO2) pendant une nuit (figure 1A).
13. En préparation de placage des cellules des îlots, enduire les puits d'une plaque à 384 puits avec 40 ul de 804G milieu conditionné par puits. Incuber une nuit dans un incubateur de culture tissulaire.

5. Dispersion et Placage des cellules des îlots

1. Le lendemain, doucement détacher les îlots de la boîte de 10 cm avec un grattoir à cellules et transférer les îlots dans un tube de 50 ml.
2. Sédimenter les îlots par centrifugation pendant 1 min à 22 g, à température ambiante. Aspirer le surnageant.
3. Laver les îlots avec 20 ml de PBS chaud et transvaser comme ci-dessus.
4. Re-suspendre îlots dans 0,25% de trypsine (150 pi par pancréas de rat) Et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Pipette îlots haut et en bas 10 fois en utilisant pipette de 1 ml après 5 et 10 min d'incubation.
5. Au bout de 10 min, évaluer un échantillon de 20 ul des îlots trypsinisées sous le microscope pour assurer une digestion complète et pour compter les cellules d'îlot à l'aide d'un hémocytomètre. Si îlots non digérés restent, continuer d'incubation pour un montant supplémentaire de 3 - 5 min et la pipette de haut en bas 10 fois plus. Répéter au besoin.
   Remarque: Le rendement typique est ~ 125.000 - 150.000 îlots-cellules par rat.
6. Retirer 804G conditionné plaque 384 puits revêtue médias de l'incubateur et de supprimer les médias en utilisant un aspirateur à 12 puits collecteur.
7. Suspendre les cellules des îlots à une densité de 45.000 cellules par ml dans un milieu de fonction Islet et de la plaque 70 pi (3.150 cellules) par puits avec une pipette multicanaux (figure 1B).
   Remarque: Comme les cellules ß se trouvant dans les puits extérieurs ont tendance à migrer vers le périmètre de l'utilisation de la plaque des lignes C à N colonnes 4 età 21 à la plaque 228 puits avec les îlots des cellules isolées à partir de 6 rats.
8. Placer la plaque dans le tissu incubateur de culture pendant 48 heures pour permettre l'adhésion cellulaire.

6. Islet-cellule Culture Traitement, fixation et coloration

1. Préparer 200 pi de véhicule et les composés (conditions de traitement sont effectuées en quatre exemplaires ) à une concentration 2x dans du milieu de la fonction des îlots. Disposer les composés dans une plaque de 96 puits stérile pour faciliter multi-puits pipetage.
2. enlever soigneusement support d'îlots avec un aspirateur de 12 puits collecteur et le remplacer par un milieu de fonction des îlots (35 ul / puits) à l'aide d'une pipette de 12 puits. Retirer et remplacer les médias d'une rangée à la fois pour limiter le risque de séchage (figure 1C).
3. Initier le traitement par transfert de 35 pl / puits des solutions de composé 2X. plaque Retour à l'incubateur pendant toute la durée de traitement de 48 heures.
4. Après 48 heures de traitement, transvaser les médias de traitement en inversant la plaque.
5. Lavez délicatement les cellules des îlots pancréatiques avec 50 ul par puits de PBS 1x (1 min). Ajoutez le PBS en utilisant une pipette multi-canal.
6. Décanter le PBS et fixer les cellules en ajoutant 50 ul par puits de froid paraformaldéhyde 4% (PFA) dilués dans PBS 1x. Incuber les cellules pendant 15 min à 4 ° C.
7. Laver les cellules trois fois (5 min chacun) en inversant la plaque pour enlever le PFA et en ajoutant doucement 60 pi de PBS par puits comme ci-dessus.
8. Préparer une solution d'extraction 15 ml d'antigène par mélange de 14,25 ml de formamide et 0,75 ml de citrate de sodium 0,15 M (pH 6). Faire la solution immédiatement avant l'utilisation de la récupération de l'antigène.
9. Retirer du PBS dans des puits en inversant la plaque et ajouter une solution de récupération d'antigène 60 pi à chaque puits. Chauffer la plaque à 70 ° C bain d'eau pendant 45 min. Placer un bloc de chauffage au-dessus de la plaque pendant cette incubation pour empêcher la déformation de la plaque multi-puits.
   Remarque: L'eau doit être à mi-hauteur de la jupe de la plaque; la plaque ne doit pas être immergé.
10. Retirer la plaque de bain d'eau et laissez-le refroidir pendant 20 min à température ambiante. Faire en sorte que la plaque ne soit pas faussé par inspection visuelle.
11. Laver les cellules avec 60 pi par puits de PBS 1x trois fois (5 min chacun). Ajouter du PBS avec une pipette à canaux multiples et décanter le PBS en retournant la plaque.
12. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 40 pl par puits de tampon de blocage et on incube pendant 30 min à température ambiante. Retirez le tampon de blocage en inversant la plaque et décantation.
13. Ajouter 40 ul d'anticorps de souris anti-humain Ki-67 (1: 200) PDX-1 et anti-humaine de chèvre (1: 100) les anticorps dilués dans un tampon de blocage dans chaque puits et incuber à 4 ° C pendant une nuit.
14. Le lendemain, décante la solution anti-corps et laver les cellules avec 1 x PBS trois fois (5 min à chaque fois), comme décrit ci-dessus. Décanter le PBS.
15. Ajouter 40 ul par puits de dilués (1: 200) à dos d'âne anti-souris biotinylé IgG d'âne conjugué à la rhodamine-IgG anti-chèvre dans un tampon de blocage. Incuber pendant 1 heureà température ambiante.
16. Laver les cellules avec PBS 1x trois fois, 5 minutes chacun. Ajouter 40 ul de dilution (1: 400 dans un tampon de blocage) conjugué à la fluorescéine streptavidine à chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
17. Laver les cellules avec PBS 1x trois fois, 5 minutes chacun. Ajouter 40 ul par puits de DAPI (300 nM dans du tampon de blocage) et on incube pendant 15 min à température ambiante.
18. Laver les cellules avec PBS 1x deux fois et laisser les cellules dans 40 ul PBS 1x. La plaque est maintenant prête à être analysé.

Analyse de la réplication 7. β-Cell

Remarque: Un protocole d'essai doit être établi pour le contenu microscope haute de dépistage utilisé pour mesurer la réplication β-cellulaire. Dans sa composition la plus simple, ce protocole est un essai de deux couleurs où un marqueur d'identité est utilisée pour définir les cellules ß (PDX-1 ⁺ -Cells) et un marqueur de réplication (Ki-67) est utilisé pour définir les événements de la division cellulaire.

1. Identifier des objets (cellules ß) sur la base average intensité de fluorescence de la coloration PDX-1 (549 nm filtrant) à l' intérieur d' un cercle approximatif (longueur: largeur <1,6) dans la zone de pixels attendue d'un noyau β-cellules (figure 2A).
2. Ensuite, établir des paramètres pour identifier les événements de réplication (Ki-67-positivité) en fonction de l'intensité de fluorescence moyenne (485 nm filtre) dans le PDX-1 ⁺ zone (figure 2B).
   Note: Les temps d'exposition doivent être fixés pour permettre des comparaisons d'intensité de pixel à travers les images. les paramètres du protocole de dosage sont ajustées de telle sorte que les appels de la machine excluent systématiquement les taches, les débris et les cellules agrégats non spécifiques qui pourraient nuire à la qualité des données.
3. Analyser un minimum de 500 cellules ß par puits pour maximiser la précision et la limite de la variabilité.
   Note: L'indice de réplication β-cellules basales dans les cultures d'îlots de rat devrait être de 0,5 à 3%. En règle générale, 40 images par puits est plus que suffisante pour identifier les cellules ß-500.
4. Avant d'analyser laplaque entière, analyser négative- (DMSO-traités) et positifs de contrôle sélectionné (5-iodotubercidin [1 uM] ou dipyridamole [15 uM]) a traité des puits pour évaluer la validité du protocole d'essai. Lorsque le dosage est mis en place correctement, les composés témoins positifs induisent au moins une augmentation de deux fois dans le pourcentage de la réplication des cellules ß.
5. Lire l'ensemble de la plaque une fois que le protocole d'essai est validé.

Résultats

Pour évaluer β-cellulaire ou la réplication α-cellule, un protocole d'essai de quatre couleurs est nécessaire. Tout d'abord, les objets sont identifiés par coloration DAPI (canal 1, 386 nm). Ensuite, les cellules ß (événement 1) sont comptés: objets qui co-exprimer PDX-1 ⁺ (canal 2, 650 nm) et de l' insuline péri-nucléaire (canal 3, 549 nm). Par la suite, les cellules ß répliquant (événement 2) sont comptées: ß-cellules (événement 1) qui co-express Ki-67 (canal 4, 485 nm)

Discussion

Les méthodes expérimentales pour étudier les voies moléculaires qui contrôlent la croissance β-cellulaire et la régénération sont des outils importants pour les chercheurs sur le diabète. Ici, une plate-forme de criblage à base de rat-îlot pour identifier et caractériser les stimulateurs de petites molécules de réplication β-cellulaire est présenté.

Alors que la plupart des aspects de ce protocole sont facilement réalisées par des chercheurs expérimentés, quelques étapes nécessitent techniqu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
250 g mâle Sprague Dawly Rat	Charles River	Tache # 400
12 cm dents pince à tisuue	Outils de science fine	11021-12
ciseaux fins de 11,5 cm	Outils de science fine	14058-11
ciseaux chirurgicaux de 14,5 cm	Outils de science fine	14001-14
Pince courbe de 16 cm	Outils de science fine	11003-16
Hepostat incurvé de 12 cm	Outils de science fine	13011-12
Manche de scalpel de 12 cm	Outils de science fine	10003-12
Tamis à tissus-30 maille	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375 000 unités CDA	VitaCyte	005-1030
Solution saline équilibrée de Hanks (Ca++ et Mg++)	Gibco	24020-117
Kétamine HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	pour faire un cocktail anesthésique  ;
Xylazine (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	pour faire un cocktail anesthésique  ;
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	à faire histopaque 1100
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	à fabriquer histopaque 1100
Sérum pour veau nouveau-né 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Solution de sel équilibré	de Hanks Hyclone	SH30268.01
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Low Glucose  ;	Hyclone	SH30021.01
Solution de fonctionnalité/viabilité  ;	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 media  ;	Hyclone	SH30096.01	pour fabriquer
lignée cellulaire de carcinome de la vessie du rat 804G	conditionnée Disponible sur demande		pour fabriquer un sérum
veau fœtal moyen conditionné, qualifié	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Pénicilline (5 000 UI/ml/Strptomycine (5 mg/ml)  ;	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 ml	Fisher BioReagents	BP227-500
Solution de démasquage de l’antigène 250 ml (pH 6,0)	Vector Laboratories	H-3300	pour fabriquer une solution de sitrate de sodium 0,15 M
Dextrose, Anhydrus	EMD Chemicals	DX0145-1	pour faire une solution de glucose 1 M
Sérum d’âne Nomal (poudre)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Souris anti-humain Anticorps Ki67	BD Biosciences	556003
Chèvre anti-humain PDX-1	anticorps R& D Systems	AF2419
Polyclonal Cobaye Anticorps anti-insuline	Dako	2016-08
Polyclonal Rabbit Anti-glucagon	Dako	2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatine	Dako	2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin	anticorps abcam	ab24525
Biotine-SP-conjugué, Âne Anti-souris IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugué  ;	Invitrogen	S32354
Âne conjugué à la rhodamine Anti-Goat IgG  ;	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
Âne conjugué à la rhodamine Anti-cochon d’Inde IgG  ;	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
Âne conjugué à la rhodamine Anti-Lapin IgG	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
Âne conjugué Cy 5 Anti-Cochon d’Inde IgG  ;	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Âne conjugué Cy 5 Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Âne conjugué Cy 5 Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Âne conjugué Cy 5 Anti-Chicken	IgG Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Réservoir de réactif jetable 25 ml	Sorenson BioScience	39900
384 puits, noir/clair, plaque traitée pour culture tissulaire	BD Falcon	353962
96 puits, noir/transparent, plaque traitée pour culture tissulaire	Costar	3603
Pipette multicanaux	Costar	4880
Aspirateur 12 canaux	Drummond	3-000-096
Racleur cellulaire	Falcon	353085
bain-marie Isotemp Modèle 2223  ;	Fisher Scientific
Instrument de criblage à haut contenu : ArrayScan VTI	Thermo Scientific