Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d'extraction d'ADN

Résumé

Ce protocole d’extraction modifié améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions d’intérêt plus précisément ciblées dans les blocs de tissus histopathologiques.

Résumé

Le tissu inclus dans la paraffine fixé au formol (FFPET) représente un substrat précieux et bien annoté pour les investigations moléculaires. L’utilité du FFPET dans l’analyse moléculaire est compliquée à la fois par la composition hétérogène des tissus et les faibles rendements lors de l’extraction des acides nucléiques. Une recherche documentaire a révélé qu’il y avait peu de protocoles abordant ces questions, et qu’aucun n’offrait de méthode validée pour l’extraction simultanée de l’ARN et de l’ADN à partir de régions d’intérêt pour le FFPET. Cette méthode résout ces deux problèmes. La spécificité tissulaire a été obtenue en cartographiant les zones cancéreuses d’intérêt sur des lames de microscope et en transférant les annotations sur des blocs FFPET. Des carottes de tissus ont été prélevées dans des zones d’intérêt à l’aide de poinçons de 0,6 mm. L’extraction des acides nucléiques a été réalisée à l’aide d’un système d’extraction commercial FFPET, avec des modifications aux étapes d’homogénéisation, de déparaffinisation et de digestion de la protéinase K pour améliorer la digestion des tissus et augmenter les rendements en acides nucléiques. Le protocole modifié produit une quantité et une qualité suffisantes d’acides nucléiques pour être utilisés dans un certain nombre d’analyses en aval, y compris une plateforme d’expression génique multi-analytes, ainsi que l’analyse PCR en temps réel de l’expression de l’ARNm couplée à la transcriptase inverse et l’analyse PCR spécifique à la méthylation (MSP) de la méthylation de l’ADN.

Introduction

La recherche de biomarqueurs génomiques cherche à identifier les corrélats moléculaires qui reflètent avec précision et de manière fiable l' état ​​de la maladie, et le font d'une manière cliniquement utile. ¹ Le développement Biomarker est tributaire de l' analyse rétrospective des échantillons de tissus bien annotés. des échantillons de tissus malades et normaux sont stockés soit le tissu frais congelé dans des biobanques spécialisées ou tissu enrobé de paraffine (FFPET) blocs fixés au formol dans les archives cliniques. Les tissus frais congelé permet l'extraction des acides nucléiques de haute qualité et a été largement utilisé dans les études de découverte de biomarqueurs génomiques. ^2,3 Cependant, moins d' échantillons de tissus sont disponibles dans les biobanques et à étudier un tel tissu introduit un biais vers des échantillons plus larges, des catégories inhabituelles de la maladie, et les patients vus dans des centres spécialisés avec une plus grande capacité au tissu bancaire. ⁴ FFPET, en revanche, est la méthode de stockage par défaut pour les tissus humains et animaux malades. Bien que les blocs FFPET maintiennent m cellulaireorphology, le processus de fixation des liens croisés autres constituants cellulaires à des acides nucléiques. ARN et l' ADN réticulé sont recouvrables, mais seulement dans des formes dégradées, très fragmentées. ^5,6 Cependant, ces fragments d'ADN et d' ARN se prêtent à une analyse par un éventail croissant de tests, y compris l' expression de l' ARNm, l' ADN hypermethylation, et le séquençage ciblé. ^7,8 pour exploiter cette occasion dans la grande quantité et variété de FFPET disponible pour la recherche, il existe un besoin pour un protocole d'extraction efficace et fiable.

Une grande partie de la recherche de marqueurs biologiques dans le tissu se concentre sur le cancer. Comme d'autres types de tissus malades, le tissu cancéreux se manifeste souvent hétérogénéité régionale importante en matière de préservation des cellules et le type de cellule. Puisque la recherche de marqueurs biologiques repose sur la capacité à corréler constituants du tissu malade avec des caractéristiques moléculaires, une étape critique de ce processus est la récolte précise du tissu qui est bien préservé et enrichi pour la dalad ie l'étude. Dans FFPET, deux techniques d'enrichissement sont souvent utilisées: microdissection par capture laser (LCM), et la coupe du microtome. LCM permet fortement axé la récolte des tissus et peut être utilisé pour isoler des types cellulaires spécifiques, bien conservés dans les tissus hétérogènes. ^9,10 Cependant, LCM nécessite un équipement coûteux et est extrêmement laborieuse , pour un grand nombre d'échantillons. Tronçonnage Microtome est un processus plus largement utilisé où les sections minces sont découpées à partir de blocs FFPET. ^11,12 sections Microtome coupées comprennent souvent un tissu qui est hétérogène dans la préservation de la cellule (par exemple, par rapport à nécrotique bien conservé) et de la composition (par exemple, le cancer vs. parenchyme bénigne), et peut donc conduire à l'homogénéisation des caractéristiques moléculaires meilleurs étudiés séparément. Par conséquent, il existe un besoin pour un procédé à haut débit, qui enrichit les cellules d'intérêt. Une troisième méthode, l'isolement des acides nucléiques à partir des noyaux de FFPET, fournit cet enrichissement, convient pour une grande throughput protocoles, et a été utilisé par d' autres pour isoler l' ARN ou de l' ADN à partir de noyaux de tissus séparés. ^7,13,14

Un certain nombre de protocoles publiés de préciser les méthodes d'extraction d' acides nucléiques à partir de FFPET (tableau 1). Cependant, les protocoles où l' ARN et l' ADN sont extraits du même tissu ont été optimisés pour des coupes de tissus microtome, mais pas pour les cœurs de tissu. ^15,16 protocoles De même, publiés qui offrent une spécificité accrue de tissus, soit par des noyaux de tissus ou microdissections de diapositives, spécifier les procédures pour l' extraction de l' ADN, mais pas l' ARN. ^7,17 ici, un protocole optimisé pour une double extraction à la fois de l' ADN et de l' ARN à partir du même cœur de tissu est démontrée. noyaux de tissus sont récoltés en insérant microarray de tissu (TMA) poinçons dans des régions d'intérêt mappés sur des blocs de FFPET. La mise en correspondance est effectuée en annotant une lame de microscope avec un stylo marqueur et transférer l'annotation à la surface correspondante de la FFPEBloc de T (figure 1).

Des travaux antérieurs qui ont conduit à l'élaboration de ce protocole comprenait une comparaison de plusieurs systèmes d'extraction d'acide nucléique disponibles dans le commerce. Dans cette comparaison, les modifications des protocoles commerciaux, tels que décrits ci - après à condition que les ADN et ARN plus hauts rendements et de la qualité (Selvarajah et al., En préparation). Carottes de tissu sont plus épaisses que les sections de 5 à 10 microns um typiquement utilisés dans des protocoles d'extraction FFPET ^{11,12,14,18 - 20,} et peuvent contenir des quantités variables de plus de paraffine. Pour compenser cela, déparaffinage a été renforcée par la répétition des traitements de xylène et l' éthanol et en introduisant une étape d'homogénéisation motorisé (Figure 1). Par ailleurs, la protéinase K temps de digestion ont été allongées pour augmenter le rendement de l'ADN. Dans l'ensemble, ce protocole est rentable et permet l'établissement de liens entre les caractéristiques moléculaires et histopathologiques de la maladie dans large, populations bien caractérisées. Le protocole dans son intégralité peut être effectuée de manière fiable dans les 2 jours, y compris 3 heures de mains sur le temps, avec peu de besoin d'équipement spécialisé ou coûteux.

Le protocole étape par étape est ci-après comme une version modifiée du protocole du fabricant. ²¹ S'il vous plaît voir le tableau des matériaux / équipement pour les réactifs spécifiques, l' équipement et les fabricants.

Protocole

1. Carottage tissulaire

1. Examinez la lame de microscope et tracez le contour de la ou des régions d’intérêt à l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine. Découpez une section de film de paraffine suffisamment grande pour couvrir la région d’intérêt sur la lame de microscope. Placez le film fermement sur la diapositive et enroulez le film sur les bords pour empêcher le film de glisser. À l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine, tracez le contour de l’ensemble du tissu et de la ou des régions d’intérêt à l’intérieur du tissu, en gardant le contour touchant, mais en dehors de la ou des régions.
2. Retirez le film et transférez-le dans le bloc de tissu correspondant. Orientez le film en le retournant ou en le tournant de sorte que le contour de l’ensemble du tissu corresponde à la forme observée du tissu dans le bloc (Figure 1). Appuyez fermement la section de film sur la surface du bloc pour éviter qu’elle ne glisse.
3. À l’aide de la pointe du marqueur permanent, faites des indentations peu profondes mais visibles (~0,2 mm) le long du contour de la ou des régions d’intérêt, puis retirez le film. Chargez 1 ml d’eau de Javel, d’éthanol à 70 % et d’eau dans des tubes à microcentrifuger séparés de 1,5 ou 2,0 ml.
4. Nettoyez le poinçon récepteur (rouge) du jeu de poinçons de 0,6 mm en faisant glisser le poinçon de haut en bas plusieurs fois pendant que la pointe est immergée dans le tube contenant de l’eau de Javel. Répétez l’étape ci-dessus avec de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau (essentiel pour s’assurer que l’eau de Javel est éliminée).
5. Appuyez le poinçon dans le tissu, à l’intérieur de la région d’intérêt jusqu’à une profondeur de 3 mm et retirez le poinçon. Libérez le noyau dans un tube de 1,5 ou 2 ml à faible reliure en le poussant hors du poinçon avec le stylet. Stockez les noyaux à -20 °C (à long terme) ou à 4 °C pour une utilisation à court terme.
6. Nettoyez le poinçon selon l’étape 1.4 et passez aux régions ou à l’échantillon suivants.

2. Déparaffiniser les noyaux de tissus FFPE

1. Effectuer la déparaffinisation dans des tubes de 1,5 ou 2 ml en ajoutant 1 ml de xylène au noyau du tissu et en agitant vigoureusement pendant 10 sec. Chauffer pendant 3 min à 50 °C.
2. Centrifugez pendant 2 min à température ambiante (RT) et à vitesse maximale (21 130 x g) et placez le tube sur de la glace pendant 5 min (permet au résidu cireux de se solidifier sur le dessus).
3. Retirez soigneusement la paraffine accumulée autour du ménisque avec du surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et répétez le traitement au xylène (étapes 2.1-2.2).
4. Ajouter 1 ml d’éthanol (100 %) et agiter vigoureusement pendant 10 secondes. Centrifuger pendant 2 minutes à RT (vitesse maximale) et jeter soigneusement l’éthanol. Répétez l’étape ci-dessus une fois.

3. Homogénéisation des noyaux déparaffinisés

1. Remettre les noyaux en suspension dans 700 μl d’éthanol (100 %) avant homogénéisation. À l’aide d’un homogénéisateur de tissus motorisé, broyez les noyaux en fines particules de tissu (~1 min à réglage moyen). Nettoyez la sonde de l’homogénéisateur entre chaque échantillon afin de minimiser la contamination par réverbération.
   1. Remplissez les tubes de 15 ml avec ~10 ml d’eau de Javel, de solution neutralisante de RNase et d’éthanol à 70 %. Après l’homogénéisation de l’échantillon, laver la sonde d’homogénéisation dans chacune des solutions de nettoyage dans l’ordre indiqué ci-dessus. Faites fonctionner l’homogénéisateur à la vitesse la plus élevée pendant l’étape de lavage.
   2. Essuyez la sonde avec du mouchoir en papier et laissez la sonde sécher complètement avant d’homogénéiser l’échantillon suivant. Inspectez visuellement les lames de la sonde à la recherche de morceaux de tissu résiduels. Si vous en trouvez, nettoyez à nouveau la sonde. Changez les solutions de nettoyage (eau de Javel, éthanol et solution neutralisante RNase) tous les jours.
2. Après homogénéisation, porter le volume de l’échantillon à 1 ml en ajoutant plus d’éthanol à 100 % (~300 μl). Centrifugez à vitesse maximale pendant 15 min, aspirez soigneusement l’éthanol et séchez la pastille à l’air libre pendant environ 15 à 20 minutes avant de procéder à l’extraction de l’ARN.

4. Digestion avec la protéinase K

1. Remettez la pastille en suspension dans un tampon de digestion de protéinase K de 150 μl et agissez le tube pour détacher la pastille. Ajouter 10 μl de protéinase K stable à la température et mélanger en effleurant (ne pas agiter le tube). Incuber le contenu dans le tube à 56 °C pendant 15 min en agitant doucement.
2. Laisser le tube incuber sur de la glace pendant 3 min. Un refroidissement complet est important pour une précipitation efficace à l’étape suivante. Centrifuger pendant 15 min à vitesse maximale.

5. Séparer l’ARN de l’ADN

1. Transférez soigneusement le surnageant, sans perturber la cuffe, dans un nouveau 1,5 ml pour la purification de l’ARN.
2. Conservez la pastille pour la purification de l’ADN (la pastille peut être conservée pendant 2 heures à RT, jusqu’à 1 jour à 2-8 °C, ou pendant de plus longues périodes à -20 °C).

6. Purification de l’ARN

1. Incuber le surnageant contenant de l’ARN à 80 °C pendant 15 min (ne pas dépasser ce temps). Ensuite, centrifugez brièvement le tube pour recueillir les gouttes à l’intérieur du couvercle.
2. Ajouter 320 μl de tampon RLT pour ajuster les conditions de liaison et mélanger par pipetage. Ensuite, ajoutez 720 μl d’éthanol (100 %) et vortex.
3. Transvasez 600 μl de l’échantillon, y compris tout précipité qui a pu se former, dans une colonne de spin d’ARN (fournie dans le kit) placée dans un tube de prélèvement de 2 ml et mettez de côté le reste du contenu. Centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le flux continu et réutilisez le tube de collecte.
4. Transférez l’échantillon restant sur une colonne, y compris les gouttelettes qui peuvent s’être accumulées dans le couvercle du tube, centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et jetez le flux.
5. Ajoutez 350 μl de tampon FRN dans la colonne d’essorage et centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le tube d’écoulement et réutilisez le tube de collecte.
6. Mélangez délicatement 10 μl de solution mère de DNase I avec 70 μl de tampon RDD, ajoutez-les directement à la membrane de la colonne de spin et incubez à RT pendant 15 min.
7. Ajoutez 500 μl de tampon FRN dans la colonne de centrifugation, centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et conservez le flux pour l’utiliser à l’étape suivante. Pour améliorer la récupération des petits ARN, placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et appliquez le flux de l’étape précédente sur la colonne de spin.
8. Centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le flux continu et réutilisez le tube de collecte à l’étape suivante. Ajoutez 500 μl de tampon RPE dans la colonne d’essorage et centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le flux continu et réutilisez le tube de collecte à l’étape suivante.
9. Ajoutez 500 μl de tampon RPE dans la colonne de centrifugation et centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et jetez le tube de collecte avec le flux continu.
10. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, ouvrez le couvercle et centrifugez à vitesse maximale pendant 5 min. Jetez le tube de collecte avec le flux continu.
11. Placez la colonne de centrifugation dans une nouvelle collection de 1,5 ml, ajoutez 20 μl d’eau sans RNase directement sur la membrane de la colonne de centrifugation et incubez le tube pendant 1 min à RT. Centrifugez à vitesse maximale pendant 1 min pour éluer l’ARN. Conservez l’échantillon d’ARN élué à -80 °C.

7. Purification de l’ADN

1. Remettre en suspension la pastille obtenue lors de l’extraction de l’ARN par addition progressive de 45 μl de tampon protéinase K (400 mM Tris 7.5, 400 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 4 % SDS), 45 μl H₂O et 400 μg de protéinase K de haute puissance.
2. Incuber la solution ci-dessus à 56 °C pendant 24 heures (recommandé) ou toute la nuit. Effectuer l’incubation à 90 °C pendant 2 heures sans agitation et centrifuger brièvement le tube de microcentrifugation pour recueillir les gouttes à l’intérieur du couvercle.
3. Laissez l’échantillon refroidir jusqu’à ce qu’il soit RT, puis ajoutez 4 μl de RNase A (100 mg/ml). Incuber l’échantillon pendant 2 min à RT.
4. Ajoutez 200 μl de tampon AL à l’échantillon et mélangez soigneusement par vortex. Ensuite, ajoutez 200 μl d’éthanol à 100 % et mélangez soigneusement par vortex. Transférez l’échantillon entier dans la colonne de centrifugation fournie, placez-le dans un tube de prélèvement de 2 ml et centrifugez-le pendant 1 min à ≥8 000 x g.
5. Jetez le tube de collecte avec le tube à écoulement continu et placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml. Ajouter 700 μl de tampon AW1 dans la colonne d’essorage, centrifuger pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jeter le flux continu et réutiliser le tube de collecte.
6. Ajouter 700 μl de tampon AW2 dans la colonne d’essorage, centrifuger pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jeter le flux continu et réutiliser le tube de collecte. Ensuite, ajoutez 700 μl d’éthanol à 100 % dans la colonne de centrifugation, centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et jetez le tube de collecte avec l’écoulement.
7. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, ouvrez le couvercle de la colonne d’essorage et centrifugez à pleine vitesse pendant 5 min. Jetez le tube de collecte avec l’écoulement.
8. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 ml et ajoutez 25 μl d’eau chauffée sans nucléase (50 °C). Incuber la colonne et le tube à 50 °C pendant 10 min. Centrifugez pendant 1 min à vitesse maximale, ajoutez 25 μl d’eau sans nucléase (RT) dans la colonne et incubez pendant 1 min à RT.
9. Centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale (21 130 x g) et récolter le flux contenant de l’ADN génomique (environ 50 μl d’ADN au total). Stockez la colonne à -20 °C (au cas où une autre élution serait nécessaire plus tard).

Résultats

Ce protocole représente une méthode optimisée pour la récupération de l'ADN et de l'ARN à partir de carottes de tissus, en utilisant des modifications d'un système d'extraction commerciale conçu pour des sections de tissus. L'optimisation a inclus l'homogénéisation du tissu, l'utilisation d'une protéinase K plus puissante pour l'extraction de l'ADN et une prolongation du temps de digestion du tissu. Les graphiques et les analyses statistiques comprenaient une ANOVA à deux facteurs, une régression linéaire et une analyse de corrélation.

Optimisation de la digestion par protéinase
Le kit commercial comprenait une solution de protéinase K stable à température ambiante, qui a été remplacée par une protéinase K plus puissante, conduisant à un rendement d'ADN plus élevé (Figure 2A). Afin d'augmenter davantage les rendements d'ADN, la digestion a été prolongée de 2 à 24 heures. Aucune différence significative n'a été observée entre ces deux durées, mais une digestion de 24 heures semblait offrir des rendements plus constants entre les échantillons. Toutefois, une incubation supplémentaire de 48 heures n'a pas amélioré davantage la récupération de l'ADN (Figure 2B ; p = 0,74).

Récupération typique d'ADN à partir d'échantillons de tissu prostatique cancéreux en inclusion paraffinée (FFPE)

À l’aide du protocole optimisé, l’ARN et l’ADN ont été co-extraits à partir de 333 échantillons de tissus cancéreux de la prostate en inclusion formolée et paraffinée (FFPET), dont l’âge variait de 3 à 14 ans. Pour chaque échantillon, 3 carottes de tissu (volume total moyen de tissu de 0,95 ± 0,13 mm³) ont été utilisées comme matériel d’entrée. Bien qu’il existe d’autres méthodes basées sur l’électrophorèse capillaire sur gel permettant d’estimer les concentrations et d’évaluer la distribution de taille des molécules d’acides nucléiques, ces méthodes ne permettent pas une quantification reproductible des acides nucléiques et ne peuvent pas distinguer l’ARN de l’ADN comme le font les dosages fluorométriques.²² De plus, étant donné que les résultats de l’électrophorèse capillaire sur gel ne sont pas fiables pour les acides nucléiques fragmentés provenant de FFPET,²³ les rendements en acides nucléiques ont été mesurés par fluorométrie (voir la liste des réactifs pour plus de détails). Le rendement moyen était de 2 270 ng d’ARN et de 820 ng d’ADN (Figure 3A). Environ 90 % de tous les échantillons FFPET analysés dans cette étude ont fourni ≥100 ng d’ADN et ≥500 ng d’ARN. Curieusement, aucune corrélation significative n’a été observée entre l’âge de l’échantillon FFPET et la récupération des acides nucléiques (Figure 3B). Dans l’ensemble, les rendements en ARN et en ADN étaient corrélés entre les échantillons (R² = 0,39 ; p <0,0001), bien que plus du double de la quantité d’ARN par rapport à l’ADN ait été récupérée à partir de chaque échantillon (Figure 3C).

Étant donné que les travaux pilotes et d'optimisation ont été réalisés sur des tissus prostatiques, l'étape suivante a consisté à évaluer les performances de ce protocole sur quelques autres types de tissus archivés. À partir d'échantillons de FFPET obtenus chirurgicalement ou lors d'autopsies, représentant un foie bénin (1 échantillon provenant de 1 cas), des cancers du cerveau (8 échantillons provenant de 1 cas), de la vessie urinaire (2 échantillons provenant de 2 cas) et du sein (3 échantillons provenant de 3 cas), le protocole a permis d'obtenir >100 ng d'ADN et d'ARN à partir de 90 % des échantillons (Figure 3D). Bien que les rendements en acides nucléiques aient été plus faibles dans les tissus d'autopsie que dans les tissus chirurgicaux, des résultats représentatifs indiquent que le protocole produit des rendements similaires pour les cancers provenant de sites différents.

Évaluation de l'intégrité de l'ARN et de l'ADN et de leur performance représentative dans les analyses en aval

Une analyse de l'expression des ARN de 47 gènes dans 8 échantillons sélectionnés de cancer de la prostate en tissu fixé à l'formol et inclus en paraffine (FFPET) et un échantillon frais de lignée cellulaire de cancer de la prostate PC-3 (utilisé comme témoin positif) a été réalisée à l'aide d'une plateforme commerciale multianalyte d'expression génique optimisée pour les échantillons FFPET. Les quantités d'ARNm dans PC-3 étaient généralement plus élevées que celles des échantillons FFPET (Figure 4A). Toutefois, en comparant l'expression relative de tous les gènes, les échantillons de cancer de la prostate FFPET présentaient des profils d'expression similaires à ceux de l'ARN de PC-3, indiquant que les deux sources d'ARN conviennent à l'analyse de l'expression des ARN.

Afin de démontrer la performance de l'ADN génomique extrait selon ce protocole, des extraits d'ADN converti au bisulfite provenant d'échantillons de tissus fixés et inclus en paraffine (FFPET) ont été amplifiés par PCR spécifique de la méthylation (MSP).²⁴ L'analyse MSP des éléments répétitifs ALU, des régions fortement méthylées présentes en millions de copies dans le génome humain,²⁵ a été utilisée comme contrôle de la méthylation génomique et devait montrer des variations minimes entre les échantillons. Comme illustré à la Figure 4B, peu ou pas de variation n'a été observée entre différents échantillons concernant les niveaux de méthylation MSP d'ALU. De plus, les tests MSP ciblant GSTP1, un gène connu pour être hyperméthylé dans le cancer de la prostate mais pas dans les échantillons bénins,²⁶ n'ont révélé aucune amplification détectable dans l'ADN provenant d'échantillons bénins. Comme prévu, des valeurs plus faibles du seuil de cycles en qPCR ont été détectées dans l'ADN provenant de tissus tumoraux, indiquant un enrichissement en copies de GSTP1 méthylées. L'utilité des acides nucléiques récupérés par ce protocole a été évaluée davantage dans des tests courants en aval, en utilisant des acides nucléiques extraits d'un foie bénin, d'un cerveau (post-mortem) et de deux échantillons de cancer du sein obtenus chirurgicalement. Les tests d'expression basés sur la RT-qPCR ainsi que les tests MSP ont bien fonctionné sur les échantillons FFPET de cancer du sein et de foie, mais le test de RT-PCR n'a pas permis d'amplifier un ARNm fortement exprimé à partir de l'échantillon de tumeur cérébrale post-mortem (Figure 4C), suggérant une dégradation de l'ARN, probablement due à un retard dans la fixation du tissu.

Figure 1 : Aperçu de la procédure d'extraction pour les échantillons de TFPEF. Cette figure illustre la manière dont une zone d'intérêt dans un bloc de tissu est localisée à partir d'une sélection histopathologique effectuée sur une lame microscopique. Trois carottes de tissu de 0,6 mm sont ensuite prélevées dans chaque zone tissulaire à l'aide de poinçons biopsiques, homogénéisées ensemble, puis soumises à l'extraction d'ARN et d'ADN. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Rendements en acides nucléiques (ADN et ARN) en ng/mm³ de FFPET à partir de deux protéinases K (enzymes thermostables et à haute puissance), testées sur une gamme de durées d'incubation pour cette dernière. (A) Performance de la protéinase K provenant de différents fournisseurs. Des extractions d'ADN ont été réalisées sur un échantillon représentatif de FFPET en utilisant l'enzyme thermostable fourni avec le kit par rapport à une enzyme plus puissante provenant d'un autre fabricant. (B) Détermination du temps d'incubation optimal de la protéinase K afin de maximiser le rendement en ADN. La performance de la digestion par une concentration élevée de protéinase K a été évaluée selon trois périodes d'incubation différentes, en utilisant trois échantillons de FFPET. Les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne (ETM). Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Rendements en acides nucléiques (ADN et ARN) en ng/mm³ de tissu inclus en paraffine après fixation formolée (FFPET), au total, selon les années d'échantillonnage et les types de tissus représentatifs. (A) Acides nucléiques totaux récupérés à partir de tissus inclus en paraffine après fixation formolée. Les quantités d'acides nucléiques présentées sont basées sur les extractions de 333 échantillons de FFPET réalisées selon le protocole optimisé. (B) Graphique de corrélation entre la quantité totale d'ADN et d'ARNT récupérés et l'âge des échantillons de FFPET. Les échantillons de FFPET extraits utilisés provenaient des années 2000 à 2012. (C) Corrélation entre les rendements d'ADN et d'ARNT extraits simultanément à partir de 333 échantillons de prostate. Une corrélation positive existe entre les rendements d'ADN et d'ARNT. (D) Application du protocole à d'autres types de tissus archivés. Le protocole optimisé a été utilisé pour extraire des acides nucléiques à partir de 14 échantillons cancéreux (sein, vessie et cerveau) et normaux (foie). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Performance de l'ARN et de l'ADN co-extraits à partir de carottes tissulaires dans des applications en aval. (A) Nombre de transcrits d'ARNm pour des tissus de cancer de la prostate en inclusion FFPE et pour un témoin de lignée cellulaire PC-3 fraîche. Chaque point représente la moyenne de 3 réplicats techniques extraits séparément. Les valeurs d'ARN de la lignée cellulaire PC-3 fraîche sont illustrées par des barres jaunes et les valeurs des tissus FFPE sont représentées par des points colorés. (B) Essais de PCR spécifique de la méthylation sur l'ADN d'échantillons de cancer de la prostate en FFPE. Les valeurs de seuil de cycle ont été obtenues pour 10 échantillons analysés comme prévu, en utilisant 50 ng/réaction d'ADN converti au bisulfite. Les essais MSP du gène ALU à partir de tous les échantillons FFPE ont montré des valeurs de seuil de cycle similaires (p >0,67). Les essais MSP du gène GSTP1 ont révélé des niveaux plus élevés de méthylation (seuil de cycle plus bas) dans le cancer de la prostate que dans la prostate bénigne. (C) Évaluation de la qualité de l'ADN et de l'ARN provenant d'autres types de tissus. Des essais d'expression du gène HPRT1 et de méthylation du gène Alu ont été réalisés sur des acides nucléiques (ARN et ADN respectivement) extraits de foie normal (autopsie), de cerveau (autopsie) et de cancers du sein (tous en FFPE). Les résultats obtenus avec la prostate sont présentés à titre comparatif. Remarque : des résultats similaires ont été observés pour chaque type de tissu, sauf pour un échec d'amplification de l'ARNm dans un échantillon d'autopsie. Chaque point ou barre représente un échantillon, et les barres d'erreur indiquent l'ETM. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Cores de tissu
	Apport de tissu (mm3)	Acide nucléique extrait	Validation		Contrôle de qualité : ADN			Contrôle de qualité : ARN
			(nombre d'échantillons)	Âge de l'échantillon (années)	Rendement total (ng)	Taille du fragment (pb)	PCR	Rendement total (ng)	Taille du fragment (pb)	PCR	NanoString
Pikor et al.	43 - 129	ADN	Aucune donnée	Aucune donnée	Aucune donnée	Aucune donnée
Montaser-Kouhsari et al.	18 - 29,5	ARN	763	0-25				843	Aucune donnée
Cet article	1,71	ADN et ARN	>350	3-12	820	100 - 500		2270	100-500
Sections de tissu
	Apport de tissu	Acide nucléique extrait	Validation		Contrôle de qualité : ADN			Contrôle de qualité : ARN
			(nombre d'échantillons)	Âge de l'échantillon (années)	Rendement total (ng)	Taille du fragment (pb)	PCR	Rendement total (ng)	Taille du fragment (pb)	PCR	NanoString
Heikal et al.	5 x 5 µm	ADN	12	7-22	88-300	103-351
Chung et al.	1 x 20 µm	ARN	9	>5				16 000-   23 000	100-200
Antica et al.	2 x 4 µm	ARN	18	Aucune donnée				Inconnu (621 ng/µl)	80-202 +
Ghatak et al.	5 x 5 µm	ADN et ARN	5	1	14 256	<1030		16 000	109-400 +
Hennig et al.	1 x 10 µm	ADN et ARN	210	1-25	Aucune donnée	Aucune donnée		Aucune donnée	Aucune donnée
Microdissection par capture laser
	Apport de tissu (mm2)	Acide nucléique extrait	Validation		Contrôle de qualité : ADN			Contrôle de qualité : ARN
			(nombre d'échantillons)	Âge de l'échantillon (années)	Rendement total (ng)	Taille du fragment (pb)	PCR	Rendement total (ng)	Taille du fragment (pb)	PCR	NanoString
Snow et al.	1-2	ADN	110	0-2	430	Aucune donnée

Tableau 1 :  Comparaison des protocoles publiés d'extraction d'ADN et d'ARN pour les carottes tissulaires, les coupes et les microdissections par capture laser. Plusieurs évaluations de points terminaux moléculaires de ces méthodes à l'aide de tests PCR et Nanostring sont également incluses.

Discussion

Pour une extraction réussie de l’ADN et de l’ARN à partir des régions tissulaires d’intérêt, un carottage précis est essentiel. Ce protocole décrit l’utilisation d’un poinçon tissulaire pour isoler des carottes de 0,6 mm de diamètre et décrit le processus de transfert des notations des lames de microscope vers les blocs FFPET correspondants. Des modifications ont été apportées au protocole du fabricant pour extraire efficacement les acides nucléiques des carottes, qui sont environ 50 fois plus épaisses que les sections de microtome auxquelles le protocole était destiné. Étant donné que les carottes peuvent contenir plus de cire de paraffine que les sections de tissus, une déparaffinisation efficace des carottes par des étapes répétées de traitement au xylène et à l’éthanol a été nécessaire. Le succès des étapes de post-déparaffinisation dépendait d’une bonne homogénéisation mécanique des noyaux de tissus et d’une digestion efficace de la protéinase K. Une optimisation supplémentaire de la digestion de la protéinase K peut être effectuée.

Il convient de mentionner que cette méthode identifie les zones d’intérêt à la surface du bloc, telles qu’identifiées dans les lames d’histopathologie correspondantes. Comme la carotte prélève des tissus qui peuvent avoir une profondeur de 3 ou 4 mm, les utilisateurs de ce protocole peuvent s’inquiéter des cellules ou des tissus qui se trouvent sous la surface du bloc. Bien qu’il s’agisse d’une préoccupation légitime, de nombreuses études (examinées dans la référence²⁷) ont démontré que les carottes de tissus représentent fidèlement les caractéristiques histologiques et moléculaires des blocs de tissus pathologiques, en particulier lorsque des carottes en double ou en trois exemplaires sont échantillonnées dans la zone d’intérêt.

Comme le kit d’extraction commerciale modifié adopté dans ce protocole permet l’extraction simultanée de l’ADN et de l’ARN à partir du même tissu, le protocole permet de conserver du matériel biologique précieux et permet une comparaison directe entre les deux acides nucléiques résultants à partir du même échantillon. L’extraction simultanée de l’ARN et de l’ADN réduit de moitié le travail et l’épuisement des tissus, et permet une analyse intégrée précise de l’expression des gènes, ainsi que des caractéristiques épigénétiques et génétiques de l’ADN. Étant donné que les rendements de l’ARN et de l’ADN de ces carottes de tissus représentatives dépassent généralement 600 et 300 ng, respectivement, et que la plupart des applications actuelles de PCR et de séquençage de nouvelle génération nécessitent généralement 10 à 100 ng, la plupart des échantillons purifiés par ce protocole devraient fournir du matériel adéquat pour plusieurs tests en aval. Il a été démontré que ce protocole est reproductible dans des laboratoires indépendants (Selvarajah et al., In Prep.). L’ARN de ce protocole était de qualité suffisante pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-PCR ou d’une plateforme multianalyte populaire, et l’ADN s’est bien comporté dans les tests PCR spécifiques à la méthylation. Des études futures visant à évaluer l’utilité des acides nucléiques récupérés dans le séquençage de la prochaine génération sont justifiées.

Ainsi, plusieurs modifications ont été apportées à un protocole disponible dans le commerce, conçu pour les coupes minces de FFPET, le rendant adapté à la co-extraction d’ARN et d’ADN à partir de carottes de FFPET de 0,6 mm. Le protocole a démontré des rendements constamment élevés dans une grande cohorte d’échantillons de cancer de la prostate et dans un ensemble limité d’échantillons de cancers du sein, du cerveau et de la vessie. Dans l’ensemble, le protocole devrait permettre aux utilisateurs d’effectuer des analyses génétiques ciblées de grandes collections de tissus bien annotées. Il est important de noter que le protocole permet un échantillonnage ciblé efficace des régions d’intérêt dans le FFPET, un temps de manipulation relativement faible et des rendements suffisamment élevés pour la plupart des applications en aval.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Film de paraffine en plastique, « Parafilm 'M'"	Bemis  ;	RK-06720-40	Tout film de paraffine générique fonctionnera comme un substitut
l’hypochlorite de sodium, « Ultra Bleach"	De même	53-2879-2	Tout agent de blanchiment générique fonctionnera comme un substitut. Matière dangereuse pouvant provoquer des brûlures au contact.
L’éthanol absolu de qualité biologique	Fisher BioReagents	BP2818-500	Sigma-Aldrich E7023 suffit comme substitut
Grade moléculaire H2O	G-Biosciences	786-293	Sigma W4502 suffit, ainsi que toute autre marque de set de poinçons H2O
0,6 mm de qualité moléculaire pour Beecher Instruments.	Estigen	MPO6[Jaune]	Assurez-vous d’utiliser le poinçon récepteur rouge de l’ensemble
Marqueur permanent à pointe fine	Sharpie	10365796S	L’utilisation du marqueur sur les tissus FFPE le fait sécher rapidement, de sorte que plusieurs peuvent être nécessaires
Bloc
Lame de tissu colorée correspondant au bloc
1,5 ml Micro-Tubes à centrifuger	Fisher BioReagents	05-408-137
2,0 ml Tubes à faible liaison (tubes à micro-centrifugeuse LoBind)	Eppendorf	22431048
1,5 ml Tubes à faible liaison (tubes à micro-centrifugeuse LoBind)	Eppendorf	22431021
Histologie Xylene	VWR	CA 95057-822	Fisher Scientific X5-500 suffit comme substitut
Biologie moléculaire Grade 2-Propanol	Sigma	I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit  ;	Qiagen	80234	Préparer les tampons selon l’ADN/ARN AllPrep FFPE Handbook21
Buffers : RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution	Qiagen	80234	Préparer les tampons selon l’ADN/ARN AllPrep FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K	Qiagen	80234
Protéinase K à haute puissance	Invitrogen	25530-049	Invitrogen 25530-015 suffit comme solution neutralisante de substitution
à base d’ARNase (Rnase AWAY)	Molecular BioProducts	7003
RNaseA 100 mg/ml	Qiagen	19101
BD Integra Seringue 3 ml 21G x 1/2	BD  ;
Homogénéisateur de tissus motorisé (TissueRuptor)	Qiagen  ;	9001271	Fisher Scientific 14-261-29 suffit comme substitut-20
° ; C et -80 ° ; C Congélateur de laboratoire
Micro-centrifugeuse avec rotor pour tubes
Mélangeur
Pipettes et pointes
Blocs chauffants ou bains-marie Chlorhydrate
Tris  ;	Amresco	0234
Chlorure de sodium  ;	Amresco	0241
Chlorure de magnésium anhydre	Sigma	M8266
Dodécylsulfate	de sodium Sigma	L4509
Acrodisc 25 mm filtres à seringue avec 0,45 µ ; m Supor membrane	Pall	PN 4614
Seringue avec aiguille rétractable BD PrecisionGlide 3 ml	BD Integra	305274
Acide chlorhydrique	BDH	3026
Plateforme d’expression génique multianalyte (nCounter ® ; Plateforme	Nanostring nCounter,
quantification fluorométrique des acides nucléiques (kit de dosage HS Qubit dsDNA et Qubit® ; Kit de dosage de l’ARN BR)	Invitrogen