Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Résumé

Nous décrivons un protocole permettant d’imager volumétriquement des cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur de cœurs embryonnaires et postnatals intacts. En utilisant des méthodes de nettoyage des tissus en combinaison avec la coloration de l’ensemble du support, des cellules uniques marquées par des protéines fluorescentes à l’intérieur d’un cœur embryonnaire ou postnatal peuvent être imagées de manière claire et précise.

Résumé

traçage clonale unique et analyse au niveau entier cardiaque peut déterminer le comportement des cellules progénitrices cardiaques et la différenciation au cours du développement cardiaque, et permettre l'étude de la base cellulaire et moléculaire de la morphogenèse cardiaque normale et anormale. Les technologies récentes émergentes d'analyses clonales simples rétrospectives rendent l'étude de la morphogenèse cardiaque à résolution cellulaire unique possible. Cependant, l'opacité des tissus et diffusion de la lumière du cœur comme la profondeur d'imagerie augmente l'imagerie entier coeur hinder à la résolution d'une seule cellule. Pour surmonter ces obstacles, un système de compensation entier embryon qui peut rendre le cœur très transparent à la fois l'éclairage et de détection doivent être développés. Heureusement, au cours des dernières années, de nombreuses méthodes pour les systèmes de compensation des organismes entiers tels que CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB et PACT ont été rapportés. Ce laboratoire est intéressé par les mécanismes cellulaires et moléculaires de la cartemorphogenèse iac. Récemment, nous avons établi seule lignée cellulaire de traçage via le ROSA26-Cre ^ERT2; système ROSA26-Confetti pour marquer les cellules à faible densité au cours du développement cardiaque. Nous avons adapté plusieurs méthodes entières d'embryons de compensation , y compris le Sca et CUBES (, dégagée cocktails d'imagerie cérébrale claires et une analyse informatique) pour effacer l'embryon en combinaison avec toute coloration de montage à l' image des clones individuels à l' intérieur du cœur. Le cœur a été imagé avec succès à la résolution d'une seule cellule. Nous avons constaté que Sca le peut effacer le coeur embryonnaire, mais ne peut pas effacer efficacement le cœur postnatale, tandis que CUBIC peut effacer le coeur postnatale, mais endommage le coeur embryonnaire en dissolvant le tissu. Les méthodes décrites ici permettront l'étude de la fonction des gènes à une résolution de clone unique lors de la morphogenèse cardiaque, qui, à son tour, peut révéler la base moléculaire et cellulaire des malformations cardiaques congénitales.

Introduction

Morphogenèse cardiaque est un événement séquentiel qui nécessite l'organisation spatio - temporelle des quatre types de cellules progénitrices cardiaques différentes dans des secteurs distincts du coeur, et requiert également des réseaux de régulation génétiques multiples pour orchestrer ce processus pour former le ^1,2 cardiaque fonctionnel. Cardiac spécification, la différenciation, la structuration et la chambre de maturation sont régies par des facteurs de transcription cardiogénique ^3. Une mutation génétique ou une aberration post - transcriptionnelle de ces facteurs dans les cellules progénitrices cardiaques pourraient entraîner soit une létalité embryonnaire ou malformations cardiaques congénitales (CHD) ^4. L'étude de la morphogenèse cardiaque nécessite une compréhension des détails inhérents structurels en trois dimensions (3D) et seule cardiaque lignée de cellules progénitrices marqué de traçage au cours du développement cardiaque favorisera la compréhension de la morphogenèse cardiaque. Un certain nombre de sections sur la base des méthodes de tomographie à haute résolution ont été développés en ee depuis quelques décennies à la structure ^5,6 d'organes d'image; Cependant, ces méthodes nécessitent coûteuses, des instruments spécialisés, une vaste main - d'œuvre, et manquent de l' organisation structurelle détaillée à une résolution de cellule dans l' image ^7,8 volumétrique finale reconstruite.

Imagerie volumétrique 3D au niveau de la cellule unique fournit un moyen pour étudier la différenciation des cellules progénitrices et le comportement cellulaire in vivo ^7. Cependant, la diffusion de lumière de tissu reste le principal obstacle à l'imagerie des cellules et des structures en 3D en profondeur dans le cœur intact. Les lipides sont une source majeure de diffusion de la lumière, et l'élimination des lipides et / ou le réglage de la différence d'indice de réfraction entre les lipides et les zones environnantes sont les approches possibles pour accroître la transparence des tissus ^8. Au cours des dernières années, un certain nombre de méthodes de compensation de tissus ont été développés, qui réduisent l'opacité des tissus et diffusion de la lumière, comme BABB (alcool benzylique et benzyle benzoatemélange e) et DBE (tétrahydrofuranne et dibenzylether); mais dans ces méthodes, la fluorescence reste un problème ^8-10. Le solvant basé méthodes hydrophiles, tels que SeeDB (fructose / thioglycérol) et 3DISCO (dichlorométhane / dibenzylether), préserver des signaux fluorescents, mais ne rendent pas tout l' organe transparent ^7,8,11. En comparaison, la méthode de dégagement du tissu CLARITY rend l'organe transparent, mais il a besoin d' un dispositif d'électrophorèse spécialisé pour éliminer les lipides ^8,12, comme le fait PACT (technique de clarté passive), qui nécessite également un hydrogel enrobage ^7,13. Pour des informations détaillées sur toutes les méthodes de tissus de compensation disponibles, reportez - vous au tableau 1 Richardson et Lichtman, et al. ^7.

En 2011, Hama et coll. Serendipitously découvert un mélange hydrophile 'Sca le' ( l' urée, le glycérol et le Triton X-100 du mélange) qui rend le cerveau de souris et de l' embryon transpaent tout en préservant totalement des signaux fluorescents provenant des clones étiquetés ^14. Ceci permet l'imagerie du cerveau intacte à une profondeur de quelques millimètres et la reconstruction à grande échelle des populations neuronales et les projections à une résolution subcellulaire. Susaki et al. encore amélioré Sca le en ajoutant aminoalcools et développé le 'cubic' (, dégagée cocktails clairs d'imagerie cérébrale et une analyse informatique) méthode de compensation des tissus, qui ont augmenté solubilisation phospholipides, la réduction du temps de compensation, et a permis multicolore fluorescent imagerie ^8. Dans la présente étude, en profitant de la Sca le et les techniques de compensation des tissus CUBES et haute résolution tronçonnage optique 3D, des clones individuels à l' intérieur du coeur pendant cardiogenèse ont été retracés en utilisant Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ^17, cTnT-Cre ^18, NFATc1-Cre ¹⁹ et Rosa26-MTMG (MTMG) ²⁰ Les lignées de souris. La combinaison de la méthode toute coloration de montage (WMS) développé précédemment ^21,22 avec des méthodes de compensation des tissus plus autorisés pour la coloration d'autres protéines dans les clones étiquetés et pour l'étude de leur comportement dans un contexte volumétrique 3D. La combinaison de la compensation des tissus et WMS permet une meilleure compréhension des rôles des différents gènes et des protéines au cours du développement cardiaque, et l'étiologie des malformations cardiaques congénitales. Ce protocole peut être appliqué à d'autres études de différenciation des cellules progénitrices, le comportement cellulaire, et les événements de morphogenèse d'organes au cours du développement.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à Albany Medical College et effectué selon le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation de la solution

NOTE: Le Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ¹⁷ et Rosa26-MTMG (MTMG) ²⁰ lignées de souris ont été achetés dans le commerce cTnT-Cre ¹⁸ était un don du Dr Jiao à l' Université de l' Alabama NFATc1-Cre.. était un don du Dr Bin Zhou Albert Einstein College of Medicine ^19. Les souris ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone dans une chambre fermée pendant au moins 60 secondes, suivi par des moyens physiques de vérification de la mort par thoracotomie bilatérale, la décapitation ou la dislocation cervicale.

1. Préparer Tamoxifène. Dissolvez 10 mg de tamoxifène dans 10 ml d'oi de graines de tournesoll. Une fois qu'il est complètement dissous, aliquote et conserver à -20 ° C.
2. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissoudre Na ₂ HPO ₄ (1,41960 g), du KH ₂ PO ₄ (0,24496 g), du NaCl (8,0669 g) et de KCl (0,20129 g) dans 1 litre d'eau distillée et d' ajuster le pH à 7,4.
3. Préparer PBST: 0,1% de Tween-20 dans du PBS solution en dissolvant 100 pi de Tween-20 dans 100 ml de PBS.
4. Préparer un tampon de blocage. Faire 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) à une solution de blocage en dissolvant 3 g de BSA dans 100 ml de PBST contenant 0,2% de Tween-20.
5. Préparer CUBIC-1 (réactif 1). Mélanger 25% en poids d' urée, 25% en poids de N, N, N ', N'-tétrakis (2-hydroxypropyl) éthylène - diamine et 15% en poids de Triton X-100 dans dH ₂ O.
6. Préparer CUBIC-2 (réactif 2). Mélanger 50% en poids de saccharose, 25% en poids d' urée, 10% en poids de 2, 2 ', 2' '- Nitrilotriéthanol et 0,1% (v / v) de Triton X-100 dans dH ₂ O.
7. Préparer le Sca A2: 4 M d' urée, 10% p / v de glycérol et 0,1% p / v de Triton X-100 dans dH ₂ O. Ajuster le pH à 7,7.
8. Préparer Sca le B4: 8 M d' urée et 0,1% p / v de Triton X-100 dans dH ₂ O. Ajuster le pH à 8,7.
9. Préparer Sca le 70: 4 M d' urée, 70% p / v de glycérol et 0,1% p / v de Triton X-100 dans dH ₂ O.

2. Tamoxifen Induction, Embryon Isolement et fixation

1. Tamoxifen Induction et Embryo Isolation
   1. En utilisant un protocole tube d'alimentation courbe approuvé (ACUP 13-12007), gavage des souris R26Cre ^ERT2 Confetti femelles (obturé par des souris mâles R26Cre ^ERT2) avec 10 pg / g de tamoxifène au jour de développement embryonnaire E7.75 ^33. Au jour embryonnaire 9,5 (de E9.5) ou E10.5, euthanasier les souris femelles avec du CO ₂ et la dislocation cervicale.
   2. Après vérification de la mort de la souris (voir la section 1 Note), ouvrir la cavité abdominale de souris avec des ciseaux et disséquer la corne utérine, enlever les couches de tubes de l'utérus à l'aide de ciseaux et des pinces, et relouer les embryons du ^23,24 tube utérin.
      1. Transférer les embryons dans une boîte de Pétri contenant du PBS (pH 7,4). Sous le microscope de dissection, enlever les couches non-embryonnaires (chorion, jaune sac et amnios) avec l'aide de pinces.
   3. Utilisation de pinces et ciseaux, prélever les échantillons de souris et de l' embryon de queue femelle pour le génotypage comme indiqué précédemment ^22. En utilisant une pipette en plastique, transférer chaque embryon vers un puits d'une plaque à 48 puits contenant 1 ml de 1 x PBS.
   4. Sous un microscope à fluorescence, identifier les GFP / RFP / embryons positifs PCP via un microscope inversé avec un appareil photo. Décollez le péricarde en utilisant des pinces et tourner le coeur / embryon avec l'aide de pinces incurvées pour déterminer le nombre de clones fluorescents sur les deux côtés du cœur avec les filtres GFP / RFP / CFP. Aucune réduction sont nécessaires.
2. Après avoir identifié GFP / RFP / embryons positifs de la PCP, lavez rapidement les embryons deux fois (2 min chacun) avec 1x PBS the 48 bien-plaque sur un agitateur de plaque à la température ambiante (RT). Cela permettra d'éliminer l'excès de sang.
3. Fixer l'embryon / coeur embryonnaire en utilisant 4% de paraformaldehyde (PFA) à température ambiante. Le temps de fixation dépend de l'âge et du tissu taille embryonnaire. Pour E9.5 fixer l'embryon pendant 2 heures à la température ambiante. Les embryons au stade embryonnaire fin nécessitent plus de temps de fixation, qui peut même être prolongé à 24 heures pour le coeur postnatale.
   ATTENTION: paraformaldéhyde est toxique, éviter tout contact avec la peau, les yeux et les muqueuses.
4. Après fixation, laver l'embryon / coeur dans le bien-plaque 48 deux fois (10 min chacun) avec 1x PBS sur un agitateur de plaque à la température ambiante. Cela supprime l'excès PFA de l'embryon / coeur. Les embryons sont ensuite traités pour toute coloration de montage et de compensation des tissus.

3. Tout le mont Coloration

NOTE: Après PFA fixation de l'embryon / coeur est soumis à l'ensemble de la coloration de montage comme suit.

1. Perméabiliser l'embryon / coeur dans un puits de plaque 48, en utilisant 1 ml de 0,1% PBST pendant 2 heures sur la plaque agitateur à température ambiante.
2. Après perméabilisation, immergez l'embryon / coeur dans 1 ml de tampon de blocage, pendant 2 heures ou toute la nuit sur un agitateur de plaque à 4 ºC.
3. Immerger l'embryon / cœur à l'endothélium anticorps PECAM spécifique des cellules (CD31), dilué (1: 100) dans 0,3 ml de tampon de blocage pendant 48 heures sur la plaque agitateur à 4 ºC.
4. Laver l'embryon / coeur en utilisant PBST 5 fois, 30 min chacune à la température ambiante sur la plaque shaker. Cela supprime l'excès anticorps primaire lié non spécifique du tissu.
5. Immerger l'embryon / coeur dans Alexa Fluor 647 anticorps secondaire de chèvre anti-rat, dilué (1: 1000) dans 1 ml de tampon de blocage pendant 48 heures sur la plaque agitateur à 4 ºC.
6. Répétez l'étape 3.4 pour laver l'anticorps secondaire.
7. Post-fixer l'embryon / coeur avec 4% de PFA pendant 1 heure à température ambiante sur la plaque shaker et laver deux fois avec PBS 5 min chacune.
8. Colorer l'embryon / coeur avec la tache nucléaire 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilué dans du PBST à une concentration de 0,01 mg / mL) pendant 10 min sur la plaque agitateur à température ambiante. Suivez avec deux lavages PBS 5 min chacune.

4. Embryo / Clearing cardiaque avec Sca l e ou méthode CUBIC

NOTE: Après toute coloration de montage, l'embryon / coeur est soumis soit à la Sca le ou CUBIC méthode de compensation des tissus. Le choix de la méthode dépend de la taille et de l'âge du tissu embryonnaire. Pour E11.5 ou antérieures embryons d'âge, l' utilisation Sca l e méthode de compensation des tissus, tandis que pour les embryons âgés ou coeurs postnatales la méthode de compensation des tissus CUBIC est préféré.

1. Méthode de compensation échelle tissulaire
   1. Incuber l'embryon / coeur avec 1 ml de solution e A2 Sca l dans un flacon de scintillation (enveloppés dans une feuille d'aluminium) avec agitation douce occasionnelle (à la main) pendant 48 heures à 4 ° C.
   2. Après Sca l e A2 incubation, incuber l'embryon / coeur avec 1 ml de solution e B4 Sca l à 4 ° C dans le même flacon avec occasionnelle agitation douce pour anotsa 48 h.
   3. Incuber l'embryon / coeur pour un autre 48 heures avec 1 ml Sca l e 70 à 4 ° C avec agitation douce occasionnelle. embryon mont en utilisant 90% de glycérol (voir rubrique 5.1).
2. Méthode de compensation de tissus CUBIC
   1. Pour l' ensemble de l' embryon / coeur compensation CUBIC, immerger chaque embryon / coeur dans 1 ml de CUBIC-1 avec occasionnelle agitation douce pendant 48 heures à 37 ° C ^7. Après 48 heures, remplacer la solution avec le même volume de réactif frais CUBIC 1, et incuber l'échantillon pour un 48 heures supplémentaires à 37 ° C en agitant de temps en temps avec la main.
   2. Laver le CUBIC-1 traité coeur / embryon 1x PBS plusieurs fois à la température ambiante en agitant doucement avec la main. Cela supprime l'excès CUBIC-1 solution.
   3. Après lavage CUBIC-1 avec du PBS, plonger les embryons / coeurs en solution CUBIC-2 (1 g par embryon / coeur) pendant 48 heures à 37 ° C avec agitation douce occasionnelle avec la main. Cela fait suite à l'embryon / coeur de montage en utilisant du glycérol (voir la section 5.2).

5. Montage de l'échantillon et d'imagerie

NOTE: Les embryons ou des organes défrichées dans Sca l e 70 ou CUBIC-2 solution peuvent être visualisés directement avec échelle 70 et CUBIC-2 solution comme le moyen d'imagerie, respectivement. Toutefois, compte tenu de la vulnérabilité des échantillons embryonnaires à des réactifs de compensation, si les échantillons ne sont pas imager immédiatement, mais stockées à long terme, de stocker les échantillons dans 90% de glycérol en suivant le protocole ci-dessous.

1. Directement immerger le Sca le dégagé échantillon dans 1 ml de 90% de glycérol et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que l' imagerie.
2. Laver l'échantillon traité cubique avec 1 x PBS deux fois, 5 minutes à chaque fois de manière séquentielle et laisser incuber l'échantillon avec 1 ml de 30%, 50%, 70% et une solution de glycerol à 90% pendant 30 minutes chacun.
3. Pour la formation d'image, transférer l'échantillon à fond de verre boîte de Petri avec une quantité minimale de 90% de glycérol et de l'image de clones avec un microscope confocal équipé de deux capacités de photons.
4. Image du cœur ou de l'embryon dans le glycérol avec un 10X / 0,3 NA, NA immersion 25X / 0,8, ou un objectif de correction 40X / 1.2 NA de l'eau. Image DAPI utilisant 2-photon excitation d'un titane cohérent: saphir laser caméléon. Le choix du microscope et objectif dépendra de la fin des expériences, par exemple pour de super-résolution, un microscope à fluorescence de nappe de lumière pourrait être utilisé.

Résultats

Imagerie du coeur embryonnaire autorisé

La formation de coeur vertébré est un processus morphogénétique réglementé spatiotemporellement et dépend de l'organisation et la différenciation des cellules progénitrices de quatre sources différentes ^1. Les cellules de la première zone de coeur du croissant cardiaque se replient vers la ligne médiane ventrale pour former un tube de coeur linéaire. Les cellules du deuxième c...

Discussion

L'isolement de l'embryon est une étape très critique. embryons E9.5 sont très fragiles et de petite taille, de sorte que des précautions supplémentaires doivent être prises pour ne pas endommager les structures embryon / coeur lors de l'isolement. Les couches supplémentaires non embryonnaires enveloppant l'embryon / cardiaque doivent être soigneusement enlevées en particulier lorsque l'imagerie de l'embryon entier. Ceci permet la pénétration du mélange d'anticorps et de compensation de profon...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,2&prime ;,2&prime ; '-nitrilotriéthanol  ;	Sigma Aldrich	90279
4 % Paraformaldéhyde dans PBS	Affymetrix	19943
BSA	Fischer Scientific  ;
N,N,N',N'-tétrakis(2-hydroxypropyl)éthylènediamine  ;	Sigma Aldrich	122262
Tampon Phosphate Saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Triton  ; X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urée	Sigma Aldrich	U-1250
Saccharose	Sigma Aldrich	84097
Glycérol	Sigma Aldrich	G8773
Tamoxifène	Sigma Aldrich	T5648
Huile de tournesol	Sigma Aldrich	S5007
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
PECAM (CD31)	BD Pharmingen  ;
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21247
DAPI coloration nucléaire	Sigma Aldrich	D9542
37oC Incubateur	Thermoscientifique Fischer	Heratherm, Compact Incubateurs
48 plaques	Cell Treat	229148
Balance Analytique	Metler Toledo	PB153-S/FACT
Confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510 Microscope
dissection	Unitron	Z850
Microscope fluorescent	Zeiss	Observer. Z1
Germinator 500 Stérilisateur à billes de verre	CellPoint Scientific	GER-5287-120V
Source lumineuse	SCHOTT	ACE I
Paire de ciseaux	Outils scientifiques fins	14084-08
Boîte de Pétri 60 mm x15 mm  ;	TPP Techno Plastic Products AG	93060
Rocker II  ; Plate-forme Rocker	Boekel Scientific	260350
Tubes scintillants	Fischer Scientific  ;	03-337-26
Pipette de transfert	Samco Scientific	202
Pince à épiler	Outils de science fine	11251-20