Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Wasay M. Shaikh Qureshi; Lianjie Miao; David Shieh; Jingjing Li; Yangyang Lu; Saiyang Hu; Margarida Barroso; Joseph Mazurkiewicz; Mingfu Wu

doi:10.3791/54303

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Article de méthode

Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

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DOI :

10.3791/54303

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7 octobre 2016

Wasay M. Shaikh Qureshi¹ , Lianjie Miao¹ , David Shieh¹ , Jingjing Li¹ , Yangyang Lu¹ , Saiyang Hu¹ , Margarida Barroso¹ , Joseph Mazurkiewicz² , Mingfu Wu¹

¹Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, ²Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole permettant d’imager volumétriquement des cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur de cœurs embryonnaires et postnatals intacts. En utilisant des méthodes de nettoyage des tissus en combinaison avec la coloration de l’ensemble du support, des cellules uniques marquées par des protéines fluorescentes à l’intérieur d’un cœur embryonnaire ou postnatal peuvent être imagées de manière claire et précise.

Résumé

traçage clonale unique et analyse au niveau entier cardiaque peut déterminer le comportement des cellules progénitrices cardiaques et la différenciation au cours du développement cardiaque, et permettre l'étude de la base cellulaire et moléculaire de la morphogenèse cardiaque normale et anormale. Les technologies récentes émergentes d'analyses clonales simples rétrospectives rendent l'étude de la morphogenèse cardiaque à résolution cellulaire unique possible. Cependant, l'opacité des tissus et diffusion de la lumière du cœur comme la profondeur d'imagerie augmente l'imagerie entier coeur hinder à la résolution d'une seule cellule. Pour surmonter ces obstacles, un système de compensation entier embryon qui peut rendre le cœur très transparent à la fois l'éclairage et de détection doivent être développés. Heureusement, au cours des dernières années, de nombreuses méthodes pour les systèmes de compensation des organismes entiers tels que CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB et PACT ont été rapportés. Ce laboratoire est intéressé par les mécanismes cellulaires et moléculaires de la cartemorphogenèse iac. Récemment, nous avons établi seule lignée cellulaire de traçage via le ROSA26-Cre ^ERT2; système ROSA26-Confetti pour marquer les cellules à faible densité au cours du développement cardiaque. Nous avons adapté plusieurs méthodes entières d'embryons de compensation , y compris le Sca et CUBES (, dégagée cocktails d'imagerie cérébrale claires et une analyse informatique) pour effacer l'embryon en combinaison avec toute coloration de montage à l' image des clones individuels à l' intérieur du cœur. Le cœur a été imagé avec succès à la résolution d'une seule cellule. Nous avons constaté que Sca le peut effacer le coeur embryonnaire, mais ne peut pas effacer efficacement le cœur postnatale, tandis que CUBIC peut effacer le coeur postnatale, mais endommage le coeur embryonnaire en dissolvant le tissu. Les méthodes décrites ici permettront l'étude de la fonction des gènes à une résolution de clone unique lors de la morphogenèse cardiaque, qui, à son tour, peut révéler la base moléculaire et cellulaire des malformations cardiaques congénitales.

Introduction

Morphogenèse cardiaque est un événement séquentiel qui nécessite l'organisation spatio - temporelle des quatre types de cellules progénitrices cardiaques différentes dans des secteurs distincts du coeur, et requiert également des réseaux de régulation génétiques multiples pour orchestrer ce processus pour former le ^1,2 cardiaque fonctionnel. Cardiac spécification, la différenciation, la structuration et la chambre de maturation sont régies par des facteurs de transcription cardiogénique ^3. Une mutation génétique ou une aberration post - transcriptionnelle de ces facteurs dans les cellules progénitrices cardiaques pourraient entraîner soit un....