Article de méthode

Une méthode d'isolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface

DOI :

10.3791/54315

⸱

20 septembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la fonctionnalisation de surface personnalisable de la desthiobiotine, de la streptavidine et du système APTES afin d’isoler des types de cellules spécifiques d’intérêt. De plus, ce manuscrit couvre les applications, l’optimisation et la vérification de ce processus.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’un des facteurs limitant l’adoption et l’avancement de la médecine personnalisée est l’incapacité à développer des outils de diagnostic permettant de sonder les nuances individuelles dans l’expression d’un patient à l’autre. Les méthodologies actuelles qui tentent de séparer les cellules pour remplir ce créneau entraînent une perturbation de l’expression physiologique, ce qui rend la technique de séparation inutile en tant qu’outil de diagnostic. Dans ce protocole, nous décrivons la fonctionnalisation et l’optimisation d’une surface pour la capture et la libération cellulaires. Cette surface fonctionnalisée intègre des anticorps biotinylés avec une surface vitrée fonctionnalisée avec un aminosilane (APTES), de la desthiobiotine et de la streptavidine. La libération cellulaire est facilitée par l’introduction de biotine, permettant la collecte et la purification des cellules capturées par la surface. Cette libération se fait par le ciblage de la fraction secondaire desthiobiotine, ce qui se traduit par un paradigme de libération beaucoup plus doux. Cette réduction des réactifs agressifs et des forces de cisaillement réduit les modifications de l’expression cellulaire. La surface fonctionnalisée capture jusqu’à 80 % des cellules dans un mélange à cellules uniques et a démontré une capture de 50 % dans un mélange à deux cellules. Les applications de cette technologie aux xénogreffes et aux études de séparation du cancer sont étudiées. Les techniques de quantification pour la vérification de surface, telles que les analyses de lecteur de plaques et d’ImageJ, sont également décrites.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Paillasse Les approches actuelles de séparation cellulaire (par exemple, cellules activées par fluorescence de tri 1, capture laser micro-dissection 2, immuno-bille magnétique séparation 1) peut prendre plusieurs heures de préparation et de tri. Ces grandes échelles de temps peuvent influer sur les niveaux d'intervention et d' expression physiologiques, résultant dans les analyses qui ne sont pas représentatifs de la réponse physiologique 3. Les systèmes sont nécessaires qui peuvent rapidement et efficacement isoler des types cellulaires spécifiques sans perturber le récepteur des niveaux de surface cellulaire afin d'améliorer l'isolement cellulaire et d'enrichissement pour des applications biomédicales. Par conséquent, la justification de notre approche est de développer une approche douce pour l'isolement cellulaire.

Le "laboratoire sur puce" concept offre la promesse d'ordres de grandeur plus rapide (heures à minutes) l'isolement cellulaire, et implique le plus souvent la capture des cellules sur une surface et de libérer des cellules ou intracellulaire contents par le biais physique 4,5 ou des méthodes chimiques 6. Bien que ces approches offrent quelques avantages tels que l' identification expression de protéines de 7,8, en identifiant l' expression de l' ARN 9-11, ou même fournir des cellules de culture in vitro 12,13, bon nombre de ces techniques ne peuvent pas être traduits à des diagnostics tels que le profilage de récepteur des cellules due à leurs environnements non-physiologiques. Agents de levage Enzymatic tels que les collagénases peuvent également affecter ces quantités de récepteurs 14,15, ce qui signifie des techniques de quantification du récepteur des cellules qui utilisent ces agents de levage ne ​​génère pas des données physiologiques précises. La lyse cellulaire prévient la différenciation entre les récepteurs de la surface d' origine, et celles qui ont déjà été internalisée 16. Ce protocole décrit une approche rapide et douce pour l'isolement cellulaire.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nettoyage de la surface en verre et préparation Réactifs

  1. Placer une surface de verre dans une machine à plasma d'oxygène pendant 5 min à 50% de la puissance pour le nettoyer.
  2. Préparer 2,5 ml de 2% reconstitué (3-aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) en solution, en ajoutant 50 pi de l'APTES et 2,45 ml d'éthanol dans un tube conique.

2. APTES et DSB fonctionnalisation

  1. Ajouter une solution APTES aux surfaces. Pipeter 150 ul par puits pour 8 plaques à puits. Pipeter 100 ul par puits pour plaques à 24 puits. Pipeter 1,1 ml pour les plats en verre 60 x 15 mm. Couvrir les surfaces pour éviter l'évaporation et la répartition inégale de la solution APTES. Placer les surfaces sur un agitateur à plate-forme pendant 50 minutes à la température ambiante, ce qui crée une distribution uniforme de la couche APTES.
    REMARQUE: APTES est un aminosilane qui forme la première couche de la surface. Si vous utilisez une surface différente, déterminer heuristically le volume de solution nécessaire pour couvrir la surface.
  2. Sélectionner la température du four, tandis que les surfaces se trouvent sur le shaker: Chauffer à 55 ° C pendant 2 h pour les plaques 8 puits et plaques à 24 puits. verre de chaleur uniquement des plats à 90 ° C pendant 1 heure.
  3. Rincer les surfaces avec de l'éthanol.
    1. Administrer la quantité d'éthanol requise en faisant référence à la base de la surface utilisée. Ajouter 150 ul d'éthanol à chaque puits pour 8 plaques à puits. Ajouter 125 ul d'éthanol à chaque puits pour plaques à 24 puits. Ajouter 1,1 ml d'éthanol pour les plats en verre.
    2. Rincer la surface par décharge et extraire le liquide à partir d'un point fixe tel que l'angle du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Rincer deux fois avec de l'éthanol.
      NOTE: Si l'une des plaques de verre de puits de fond ont toute matière plastique en eux, ne les chauffe pas au-dessus de 65 ° C, comme le plastique va commencer à fondre et la chaîne.
  4. Sec avec du gaz 100% d'azote distribué à partir d'un réservoir. Placer les surfaces en oême.
  5. Préparer 2,5 ml de d-desthiobiotine (ORD) en combinant une solution de 1,5 mg / ml dans DSB 37,5 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 5 mg / ml de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) à 2.462,5 ul de 0,1 M d'hydrate d'acide 4-morpholinoéthanesulfonique (MES) (pH 6) tampon. Puis combiner les deux solutions.
  6. Ajouter 1 pl de 2-β mercaptoéthanol, après 15 minutes, dans la solution pour arrêter la réaction entre ORD et EDC. Enlever APTES chaud fonctionnalisés surfaces de verre du four. Attendre 5-10 minutes pour les surfaces de verre pour refroidir.
  7. Ajouter MES tampon de la surface à rincer, en utilisant des quantités en fonction de la surface. Ajouter 150 ul tampon MES à chaque puits pour 8 plaques à puits. Ajouter 125 ul tampon MES à chaque puits pour plaques à 24 puits. Ajouter 1,1 ml de tampon MES pour les plats en verre.
  8. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement faitdans la surface. Rincer deux fois avec un tampon MES.
  9. Appliquer la solution ORD aux surfaces pour leur permettre d'incuber. Ajouter 150 ul solution DSB par puits pour 8 plaques à puits. Ajouter 100 ul solution DSB par puits pour les plaques à 24 puits. Ajouter 1,1 ml pour la solution de verre plats de DSB.
  10. Placez les surfaces de verre DSB couverts sur une serviette en papier humide dans une boîte de Pétri. Couvrir et incuber dans un C réfrigérateur 4 ° pendant 18-24 h.

3. Streptavidin fonctionnalisation

  1. Rincer chaque surface de verre à trois reprises avec 1 ml de 1,0x tampon phosphate salin (PBS). Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Diluer la solution streptavidine (SAv) stock à 0,4 mg / ml (recommandé).
    REMARQUE: Le PBS est isotonique et peut donc être utilisé comme moyen de dilution et de rinçage. PBS est utilisé comme solvant pour la SA,v et, par conséquent, ne sera pas affecter la capacité du SAv à se lier à la surface.
  2. Appliquer 0,4 mg / ml de solution de SAv uniformément sur les surfaces de telle sorte qu'une couche mince de forme au fond du verre, sélectionner la quantité de solution sur la surface. Pour 8 plaques à puits, ajouter la solution de SAv 150 ul de 0,4 mg / ml par puits. Pour plaques de 24 puits, ajouter la solution de SAv 100 ul de 0,4 mg / ml par puits. Pour les plats en verre, ajouter la solution de SAv / ml 1,1 ml 0,4 mg.
  3. Couvrir et déplacer les plaques à un plat de 14 cm de Pétri pour retenir l'humidité. Incuber la boîte de Pétri au réfrigérateur pendant 18-24 h.
    NOTE: Il est essentiel d'utiliser des volumes constants de APTES, DSB et SAv sur chaque surface.
  4. Rincer chaque surface de verre à trois reprises avec 150 pi de PBS pour éliminer SAv. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface.
  5. Mouiller une serviette en papier wvec l'eau de-ionisée et placez la serviette en papier à plat dans 14 cm boîte de Pétri entourant les plaques pour retenir l'humidité dans les puits. Couvrir la boîte de Pétri contenant les puits. Incuber la boîte de Petri dans un niveau 1 (BSL-1) réfrigérateur 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire prévention des risques biotechnologiques.

4. Cellule de capture et de sortie

  1. Commencez par flacon (s) de T175 de cellules destinées à l'expérience. Aspirer le support de flacon (s). Laver les médias restants avec 5 ml de la température ambiante PBS. Aspirer PBS à partir du flacon (s).
  2. Ajouter 10 ml d'agent de levage non enzymatique, tels que Cell Dissociation solution, dans le flacon T-175 de cellules. Mettez le ballon dans l'incubateur pendant 6 min pour permettre la levée des cellules du flacon.
  3. Après 6 minutes, ajouter 10 ml de solution saline équilibrée de Hank froide (HBSS; Voir la liste des matériaux) pour inactiver l'agent de levage. Sortez 20 pi de cellules pour compter le nombre de cellules en solution en utilisant un hématimètre.
    NOTE: Selon le foncles surfaces utilisées dans l'expérience de capture tionnalisé, le nombre de cellules nécessaires varie. Pour fonctionnalisés 8 plaques à puits, utiliser 300.000 cellules par puits. Pour les plats en verre fonctionnalisés, utiliser 1,1 million de cellules. Pour fonctionnalisés plaques à 24 puits, 125.000 cellules sont recommandées. Plus d'informations sur le comptage des cellules se trouve dans le supplément.
  4. Répétez les étapes 4.1- 4.3 pour un autre flacon de cellules, si moins de cellules sont présentes que nécessaire pour l'expérience. Combiner des suspensions de cellules et les cellules recompter pour obtenir le nombre total de cellules en solution.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire dans une centrifugeuse à 500 g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot de cellules ont été concentrées. Trouver la quantité appropriée de HBSS à ajouter à la suspension de cellules pour obtenir une concentration de 1 x 10 6 cellules par ml, puis aspirer le surnageant à partir des cellules filées vers le bas, et ajouter le volume calculé. Ce volume peut être calculé en utilisant les équations du Supplément.
  6. Pipette de haut en bas (triturer) pour resuspendre ecellules e en solution et réduire l'agglutination cellulaire dans une solution qui peut réduire la liaison d'anticorps. Diviser la solution cellulaire dans un contrôle séparé et des solutions expérimentales. Voir fichier supplémentaire pour les composants et les calculs.
  7. Ajouter les anticorps biotinylés aux solutions cellulaires respectives comme décrit dans le fichier supplémentaire. Incuber pendant 30 min à 4 ° C sur un mélangeur à tambour en bout.
    NOTE: Pour les cellules MCF7GFP, 0,5 mg / ml hIgG ou des anticorps / ml HLA-ABC 0,5 mg sont recommandées. Pour les macrophages RAW, 1 mg / ml, il est recommandé mCD11b à la moitié du volume pour tenir compte des différences de dilution. Pour les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 est recommandé.
  8. Laver la surface du verre fonctionnalisé avec du HBSS. Pour cette expérience, une plaque de 8 puits est conseillée.
    1. Ajouter 150 ul de HBSS à chaque puits pour 8 plaques à puits. Rincer deux fois plus en utilisant HBSS. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits.Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Gardez à froid à 4 ° C.
  9. Ajouter des solutions cellulaires aux puits et attendre 45 min pour les cellules à incuber sur de la glace sur l'agitateur. Rendre la solution de biotine dans du HBSS stérile en utilisant des volumes calculés de la manière décrite dans le supplément.
  10. Retirer la solution de cellules dans les puits de verre à l'aide de HBSS.
    1. pipette doucement 150 ul HBSS dans chaque puits. Puis la pipette le HBSS. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface.
    2. Répéter deux fois de plus. Après le lavage, ajouter HBSS aux puits pour maintenir les cellules humides.
  11. Ajouter 150 pi de solution de biotine 20 mM à chaque version respective bien, et puis attendre 20 minutes pour permettre à la réaction.
  12. Recollect cellules non spécifiquement liés par lavage avec du HBSS comme indiqué ci-dessus, puis si l'on utilise des cellules marquées par fluorescence, passer à l'image de fluorescence des cellules. Aussi l'image des cellules vivantes dans un ballon (comme un contrôle, à comparer avec les cellules dans le puits). Si l'on utilise une protéine fluorescente (GFP), les cellules transfectées vert, l'excitation sera de 470 nm, et l'émission sera de 515 nm.

5. Anticorps Optimisation: Anticorps Titration

  1. Commencer en soulevant les cellules de la fiole T75 ou T175, comme expliqué dans l'étape 4.1- 4.3.
    NOTE: Ces volumes sont calibrés pour plaques à 24 puits, mais peuvent être modifiés en fonction des surfaces de verre fonctionnalisées grâce à des tests heuristique. Un titrage d'anticorps représentatif est montré sur la figure 1.
  2. Compter les cellules à l'aide de l'hématimètre, puis centrifuger la solution de cellules dans un tube conique à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Reconstituer cellules à 1 million de cellules par ml, en utilisant les calculs décrits dans le supplément.
  3. Diviser le 1 mles cellules illions par ml de solution dans six solutions différentes de 500 pi dans des tubes de centrifugeuse différents pour l'anticorps (Ab) les solutions.
    1. Diluer la solution d'anticorps de titres à 10 pg / ml, 1 pg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Créer les commandes à l'aide de 100 pi de tampon de taches (PBS + 1% d'azoture de sodium + 1% de BSA) et 500 pi de cellules pour le contrôle sans Ab dedans. Pour le contrôle à blanc (No Ab et pas de cellules), utiliser une solution de 300 pi de PBS.
      NOTE: ATTENTION: L'azoture de sodium est extrêmement toxique, explosif, et un soin extrême doit être prise lors de son utilisation. S'il vous plaît consulter la fiche de données de sécurité (FDS) et utiliser l'équipement de sécurité approprié.
  4. Combiner et faire incuber des solutions Ab avec les solutions de cellules dans le mélangeur à tambour-end à 4 ° C pendant 30 min. Rincer les fonctionnalisés plaques à 24 puits avec HBSS trois fois. Rincer la surface par décharge et extraire le liquide à partir d'un point fixe tel que l'angle du puits. Maintenez la pipette un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface.
  5. Aliquoter 125 pi de chaque solution d'échantillon dans les APTES appropriés, DSB et SAv bien fonctionnalisés. Incuber à 4 ° C ou sur de la glace pendant 45 minutes sur la surface du verre. Rincer la surface avec HBSS trois fois pour éliminer les cellules non spécifiquement attachées. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Ne pas rincer la rangée du bas, comme ceux qui sont témoins.
  6. Ajouter 150 ul de HBSS à chaque puits lavé, mis sur la glace les plaques 24 puits, puis utiliser un lecteur de plaque pour mesurer la fluorescence des cellules GFP (Excitation 485 nm / émission 528 nm).

Optimisation 6. Cell: Cellule Titration

  1. Soulevez les cellules comme indiqué dans les étapes 4.1 -4.3.
  2. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Isoler cellule de sorterésolu- dans le tube conique à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Reconstituer les cellules à 1 million de cellules par ml.
    NOTE: Plus d'informations sur l'utilisation de l'hématimètre peut être trouvé dans le supplément.
  3. Pipette 1,6 ml de la solution de cellules pour le 1,6 million de cellules stock et place dans un tube conique. Pipeter 800 pi de cellules à partir de la solution de cellules pour 800.000 cellules stock et place dans un tube conique. Pipette 80 ul de la cellule boursier pour la 80.000 cellules stock et place dans un tube conique. Pipette 8 ul du stock cellulaire pour 8.000 cellules stock et placer dans un tube conique.
    NOTE: Les concentrations sont données par 8 mesures de la plaque ainsi, répliquer au besoin. Un exemple de sortie de la plaque est représentée sur la figure 2.
  4. Prenez les quatre solutions mères et de spin dans une centrifugeuse à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Re-suspendre toutes les solutions mères dans 400 pi de HBSS.
  5. Ajouter 1,6 pi de 100 anticorps ng / ml à 1,6 million de stock de cellules, 0,8 μl à 800.000 stock de cellules et 0,5 pi à tous les autres stocks. Incuber l'anticorps pendant 30 minutes dans le mélangeur à tambour vertical pendant 30 minutes à 4 ° C. Laver la surface du verre fonctionnalisé avec du HBSS à trois reprises.
    NOTE: La plaque de puits fonctionnalisés 8 est recommandé pour la microscopie quantification, tandis que la plaque ainsi fonctionnalisé 24 est recommandé pour lecteur de plaque quantification. concentration d'anticorps pour 8.000 stock de cellules n'a pas été réduite pour permettre le facteur limitant de la surface de capture pour ne pas être le manque d'anticorps dans la solution, mais plutôt les propriétés de capture de la surface.
  6. Appliquer 150 ul de solution d'échantillon dans chaque puits. Appliquer le 1,6 million de stock de cellules à la première colonne de puits sur la gauche. Appliquer le 800.000 stock de cellules à la deuxième colonne de la gauche. Appliquer le 80.000 stock de cellules à la troisième colonne de la gauche. Enfin, appliquez le stock de cellules 8000 à la dernière colonne. Incuber pendant 45 min à 4 ° C sur l'agitateur.
    NOTE: Le 1,6 millionstock de cellules sert de la plus forte concentration à tester, et est le double de la quantité de cellules qui est utilisé généralement dans des expériences de séparation des cellules (600.000 cellules par puits) La 800.000 stock de cellules sert de témoin pour l'expérience car il est la concentration cellulaire typique qui est utilisé dans les expériences de séparation de cellules (3.000.000 cellules par puits). Le 80.000 stock de cellules sert de dix fois la dilution pour tester des concentrations plus faibles pour la capture cellulaire (30.000 cellules par puits). Le stock de cellules 8000 sert de dilution centuple à utiliser comme un test pour vérifier la limite inférieure de la séparation cellulaire (3.000 cellules par puits).
  7. Rincer à l'HBSS trois fois. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Collecter tous les lavages.
  8. Image les cellules sur un microscope à fluorescence, en cas d'utilisation 8 plaques à puits, prendre des photos de chaque survisage, et appliquer 150 ul biotine à chaque surface pendant une heure à 4 ° C sur l'agitateur. Au bout d'une heure, rincer les puits de rejet de la biotine avec HBSS 3 fois comme précédemment. Recueillir tous les lavages des puits pour compter avec l'hémocytomètre et de l'image les rejets des puits.
  9. Appliquer 150 pi de 20 mM solution de biotine excès d'affecter la libération des puits biotine pendant 1 heure, si l'on utilise des plaques de 24 puits, puis rincer les puits 3 fois avec HBSS. Quantifient plaques à 24 puits en utilisant un lecteur de plaque. Utilisez un hématimètre pour compter les cellules de tous les lavages ainsi recueillies.

7. Analyse de l'image

Remarque: Le logiciel FIDJI (http://fiji.sc/Fiji) est recommandé pour l'analyse d'images. Initialement, les images ont été converties en images en niveaux de gris, puis la luminosité / contraste a été modifié pour mettre en évidence les cellules.

  1. Chargez l'image, et les convertir en niveaux de gris en cliquant sur l'onglet d'image puis en faisant défiler vers le bas pour "Type" puis en cliquant sur4; 8 bits ".
  2. Augmenter le contraste de l'image en cliquant sur l'onglet Image, puis faites défiler jusqu'à "Régler". Cliquez sur "Luminosité et Contraste", puis utiliser les barres de défilement pour rendre les cellules se détachent. Si vous utilisez des images de fluorescence, inverser les images pour rendre les cellules plus définies.
  3. Charger un plugin sur ImageJ appelé ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) pour analyser les images.
  4. Ouvrir ITCN. Quand une boîte de dialogue apparaît qui invite l'utilisateur avec plusieurs paramètres pour estimer la taille de la cellule, définir la largeur minimale de la cellule d'intérêt premier. Cliquez sur l'option "Détecter Sombres Peaks" si l'image est fluorescentes et les cellules sont obscurcie.
  5. Réglez la valeur de seuil à 2 au départ, puis cliquez sur le bouton "Count". Une nouvelle version compté de l'image apparaît avec des points rouges délimitant où les cellules ont été comptées.
  6. Réglez le paramètre de seuil et la largeur pour obtenir des données plus précises cellulaires par definitionng de la taille d'une «cellule». Note: Le nombre de cellules comptées sera dans une boîte de dialogue sur la droite. Modification des paramètres donneront un nombre différent de cellules comptées.
  7. Continuer à parcourir à travers les paramètres de seuil et la largeur jusqu'à ce qu'une bonne estimation est atteint pour le nombre de cellules.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant ce protocole , nous montrons la capture cellulaire (Figure 3A) et la libération de cellules (figure 3C) de cellules MCF7GFP ainsi que des contrôles de cellules vivantes (figure 4). Nous avons quantifié la capture cellulaire de 60% ​​et 80% ont été libérés (figure 3C). Lorsque nous avons étendu cette approche à un mélange de RAW 264.7 macrophages et les cellules MCF7GFP, 50% des macrophages RAW ont été captur...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L' amélioration des techniques d'isolement cellulaire favorise d' études scientifiques dans les relations structure-fonction en neurosciences 18, la tige de programmation de cellules en biologie régénérative, et la signalisation angiogénique en biologie vasculaire 19. En effet, la culture de cellules primaires 20 (par exemple, les HUVEC) dans la biologie vasculaire se fait principalement par l'utilisation de techniques d'isolement des cellules. L' isoleme...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier l’American Cancer Society, Illinois Division (282802) et la National Science Foundation CBET (1512598) pour leur soutien financier. Nous tenons également à remercier le Dr Dianwen Zhang de l’Institut Beckman de l’Université de l’Illinois pour sa formation en microscopie. Enfin, nous tenons à remercier Jared Weddell, Stacie Chen et Spencer Mamer pour leurs discussions instructives.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(3-Aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)Acros Organics919-30-2Utilisé pour fabriquer une solution APTES à 2 %
Nettoyeur plasma PicoDienerModèle 1Nettoie les surfaces et permet de lier le PDMS au verre
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Utilisé comme mécanisme de libération dans la surface de capture cellulaire.  ;
diméthylsulfoxyde (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDissout le DSB dans une solution
de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo-Scientific5g : 22980
25g : 22981		Active les acides carboxyliques et permet la liaison des protéines à la surface du verre.
lame de culture non traitée à 8 puitsBD FalconCas de 24 : 354118
Cas de 96 : 354108		Utilisé dans des expériences cellulaires impliquant un microscope à fluorescence Zeiss, telles que des expériences de capture initiale et de quantification
de libération Plaques à fond de verre à 24 puitsMatTekP24G-0-13-FUtilisé dans des expériences cellulaires impliquant le lecteur de plaques, telles que les expériences d’anticorps et de titrage cellulaire
MercaptoethanolScience Lab60-24-2Utilisé pour éteindre la réaction entre l’EDC et le DSB
Acide 4-morpholinoéthanesulfonique hydraté
(MES hydraté à 99 %)		Fisher ScientificAC172590250Utilisé pour fabriquer un tampon MES de 0,1 M à utiliser dans la réaction EDC
Four de précisionThermo Scientific11-475-153Utilisé dans le durcissement de la couche PDMS et APTES.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Utilisé pour assurer une répartition uniforme de l’APTES sur les surfaces.
1x Streptavidine 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Protéine de liaison à la biotine. Peut provoquer une irritation.
Plat en verre de 5 cmFisher Scientific08748AUtilisé dans les études HUVEC ainsi que dans les futures études de profilage.
Boîte de Pétri de 14 cm avec couvercleSigma-AldrichZ717231Utilisée pour contenir les échantillons en cours de fonctionnalisation et les transporter.
Cellules MCF7-GFPCell BiolabsAKR211Stocké dans de l’azote liquide
Macrophages de souris RAW264.7ATCCTIB-71Nous a été offert par le laboratoire Smith de l’Université de l’Illinois. Stocké dans de l’azote liquide.
TrypLELife Technologies12605036Conservé dans 100 ml à température ambiante
Dulbecco' s modified Eaglemedium Cell Media Facility à l’École des sciences chimiques de l’UIUC50003PCFournisseur : Corning
Acides aminés non essentielsCell Media Facility de l’École des sciences chimiques de l’UIUC25-025-CIDéjà ajouté au DMEM par l’installation. Fournisseur : Corning.
Grattoir cellulaireFisher Scientific12-565-58Petit 23 cm 50 paquet
dissociation cellulaireCorningMT-25-056CIUtilisé pour soulever des cellules de manière non enzymatique pour l’utilisation dans des expériences cellulaires
HémacytomètreHausser02-671-54Utilisé pour compter les cellules pour la quantification des solutions cellulaires et capturer et libérer l’efficacité.
BiotineAmresco58-85-5Utilisé pour libérer les cellules de la surface.
HBSSCréé à partir de la recetteN/AUtilisé pour maintenir les cellules en vie en suspension ainsi que pour laver les surfaces de liaison non spécifiques. Adapté de Cold Spring Harbor Protocols : In 500  ; ml, utilisez 4  ; g NaCl, 0,2  ; g KCl, 0,0402  ; g Na2PO4• ; 7H2O, 0,03 g KH2PO4 et 0,5 g de glucose. Ajouter de l’eau DI pour arriver  ; 500 ml, filtrer, puis réfrigérer.
Anticorps HLA-ABCBioLegend311402Anticorps utilisé pour capturer les cellules MCF7gfp
Anticorps hIgGBioLegendHP6017Anticorps utilisé pour capturer les cellules MCF7gfp
Cellules GFP MCF7 CellBiolabsAKR-211Lignée de cancer du sein luminal qui a été transfectée avec une protéine fluorescente verte.
ConiquesThermo-Scientific15mL : 12-565-26850/15 ml Coniques en plastique pour le stockage des solutions et des aliquotes.
Rotateurs mini-tubes (mélangeur d’bout en bout)Fisher Scientific05-450-127Utilisé pour incuber des anticorps et mélanger d’autres solutions cellulaires afin de mélanger
Axiovert 200M (microscope à fluorescence)ZeissN/AMicroscope à fluorescence inversée Zeiss Axiovert 200 M.
Colonnes de dessalage ZebaThermo-ScientificPI-87770Utilisé pour purifier les anticorps nouvellement biotinylés après l’utilisation du kit de biotinylation. Instructions fournies à l’adresse suivante : http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight BiotinylationKit Thermo-ScientificUtilisé pour biotinyler les anticorps afin de leur permettre de s’intégrer à la surface de capture
Lecteur de plaquesBioTekSynergy HTX Lecteur multimodeUtilisé pour mesurer quantitativement l’intensité fluorescente dans les expériences de titrage.
Solution de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791(2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

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