Article de méthode

Comparaison de tabac Méthodes hôte cellulaire Protein suppression par Blanchir plantes intactes ou par traitement thermique des extraits

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DOI :

10.3791/54343

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8 août 2016

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1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Dans cet article

Résumé

Trois chaleur des procédés de précipitation sont présentées qui éliminent efficacement plus de 90% des protéines de la cellule hôte (SPH) de tabac extrait avant toute autre étape de purification. L'usine RSG agréger de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C.

Résumé

Les plantes fournissent non seulement la nourriture, l'alimentation et des matières premières pour l'homme, mais ont également été mis au point en tant que système de production économique pour les protéines biopharmaceutiques, tels que des anticorps, des vaccins candidats et des enzymes. Ceux-ci doivent être purifiés à partir de la biomasse des plantes, mais des étapes de Chromatographie sont gênées par les concentrations élevées de protéines de cellule hôte (HCP) dans les extraits de plantes. Cependant, la plupart des professionnels de la santé agrégées de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C facilitant la purification ultérieure de la protéine cible. Ici, trois méthodes sont présentées pour obtenir la précipitation de la chaleur des RSG de tabac soit dans des feuilles intactes ou des extraits. Le blanchissement des feuilles intactes peut facilement être incorporé dans les processus existants, mais peut avoir un impact négatif sur les étapes subséquentes de filtration. L'inverse est vrai pour la précipitation de la chaleur des extraits de feuilles dans un récipient agité, ce qui peut améliorer la performance des opérations en aval mais avec des changements majeurs dans la conception de l'équipement de procédé, tels quela géométrie de la homogénéisateur. Enfin, une configuration de l'échangeur de chaleur est bien caractérisée en termes de conditions de transfert de chaleur et facile à l'échelle, mais le nettoyage peut être difficile et il peut y avoir un impact négatif sur la capacité du filtre. L'approche de conception-de-expériences peut être utilisé pour identifier les paramètres de processus les plus pertinents affectant l'élimination des HCP et la récupération du produit. Ceci facilite l'application de chaque méthode dans d'autres plates-formes d'expression et l'identification de la méthode la plus appropriée pour une stratégie de purification donné.

Introduction

Les systèmes de santé modernes dépendent de plus en plus sur les protéines biopharmaceutiques 1. La production de ces protéines dans les plantes est avantageuse en raison de la charge pathogène faible et une plus grande évolutivité par rapport aux systèmes d'expression classiques 2-4. Cependant, le traitement en aval (DSP) de produits pharmaceutiques d'origine végétale peut être difficile parce que les procédures d'extraction perturbateurs se traduisent par une charge élevée de particules, dont la turbidité dépassant 5.000 unités néphélométriques de turbidité (NTU), et de la protéine de la cellule hôte (HCP) concentrations dépassant souvent 95 % [m / m] 5,6.

Procédures de clarification Elaborate sont nécessaires pour éliminer les particules dispersées 7-9, mais l' équipement de chromatographie est moins coûteux à exploiter en mode bind-et-éluent lors de la récupération initiale du produit s'il y a une étape antérieure pour l'élimination efficace des professionnels de la santé 10,11. Ceci peut être réalisé soit par précipitation de la protéine cible à l'aide flocculfourmis 12 ou à faible pH 13,14, ainsi que par l' origine du RSG pour agréger. L'agrégation sélective de la ribulose-1,5-biphosphate carboxylase / oxygénase (RuBisCO), le HCP le plus abondant dans les plantes vertes telles que le tabac (Nicotiana tabacum), peut être favorisée par l' addition de polyéthylène - glycol 15, mais ceci est coûteux et incompatible avec un grand fabrication -scale. Le traitement thermique a été montré pour dénaturer et précipiter plus de 95% des professionnels de la santé du tabac, tandis que les vaccins candidats protéines telles que le paludisme Vax8 demeurent stables en solution 16-18.

Trois approches différentes ont été utilisées pour réaliser la précipitation induite par la chaleur des professionnels de la santé du tabac (i) de blanchiment, à savoir l'immersion des feuilles intactes dans un liquide chaud, (ii) une température contrôlée récipient sous agitation, et (iii) un échangeur de chaleur ( Figure 1) 16. Pour des feuilles intactes, Blanchir atteint la précipitation rapide et efficace des professionnels de la santé et a été également facileà l' échelle et compatible avec les procédés de fabrication à grande échelle existantes qui comprennent une étape initiale pour laver la biomasse végétale 19. En revanche, les navires à température contrôlée sont déjà disponibles dans certains procédés , et peuvent être utilisés pour le traitement thermique d'extraits de plantes 20, mais leur évolutivité et une vitesse de transfert d'énergie sont limitées parce que le rapport de la surface au volume des réservoirs est réduite progressivement et devient impropre à l'échelle du processus. Un échangeur de chaleur est une alternative techniquement bien défini pour chauffer des cuves agitées , mais nécessite une offre abondante de chauffage et de milieux de refroidissement, par exemple, de la vapeur et de l' eau froide, ainsi qu'un débit volumétrique étroitement contrôlé qui est adaptée à la géométrie de l' échangeur de chaleur et propriétés des médias, par exemple., la capacité thermique spécifique. Cet article montre comment les trois méthodes peuvent être utilisées pour la précipitation induite par la chaleur des RSG du tabac, et RSG végétales en général. La mise en place et le fonctionnement de each méthode dans un environnement de laboratoire peut être utilisé pour évaluer leur aptitude à des processus à plus grande échelle. Le principal défi consiste à identifier les modèles à échelle réduite adéquates et les conditions de fonctionnement pour chaque opération qui ressemblent à des dispositifs et des conditions utilisées lors de la fabrication processus échelle. Les données présentées ici se réfèrent à des expériences menées avec des plants de tabac transgéniques exprimant le paludisme candidat vaccin Vax8 et protéine fluorescente DsRed 16, mais la méthode a également été appliquée avec succès à N. benthamiana plantes exprimant de manière transitoire 21 d' autres protéines biopharmaceutiques.

A expériences de conception-de-(DoE) approche 22 peut faciliter le processus de développement, et de floculants 23 peut également être bénéfique dans ce contexte comme décrit précédemment 8. La principale différence entre le blanchiment, les navires chauffés et des échangeurs de chaleur est que blanchissement est appliquée à des feuilles intactes au début du processus alors que le otla sienne sont appliqués aux extraits de plantes (figure 1).

figure-introduction-1
Figure 1:. Schéma de flux de processus illustrant la mise en œuvre de trois méthodes différentes pour le tabac HCP Heat Précipitation Le matériel végétal est lavé et homogénéisé avant clarification et purification. L'équipement pour l'étape de blanchiment (rouge) peut facilement être ajouté à la machine existante. En revanche, en utilisant un récipient agité (orange) et en particulier un échangeur de chaleur (bleu) nécessite un ou plusieurs dispositifs supplémentaires et les tubes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocole

1. Cultiver les plantes de tabac

  1. Rincer chaque bloc de laine minérale avec 1 à 2 litres d'eau déminéralisée, puis avec 1 L de 0,1% [p / v] Solution d'engrais. Placez une graine de tabac dans chaque bloc de laine minérale et rincer doucement avec 0,25 L de solution d'engrais sans se laver la postérité 16.
  2. Cultiver les plants de tabac pendant 7 semaines dans une serre avec 70% d' humidité relative, 16 h photopériode (180 pmol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) et un sombre régime 25/22 ° C lumière / température.
  3. Récolter toutes les feuilles sauf les quatre feuilles de cotylédons, qui sont situés à la base de la tige de la plante.

2. Facultatif: Heat Précipitation par Blanchir

REMARQUE: Effectuez les étapes décrites dans les étapes 2.1 à 2.12 pour précipiter RSG du tabac par le blanchiment. Passer toute la section 2, si les RSG seront précipitésdans un récipient chauffé (section 4) ou en utilisant un échangeur de chaleur (section 5).

  1. Mettre de côté 50 g de matériel végétal et de procéder à l'extraction sans blanchissement (section 3). Prélever un échantillon de cet extrait comme un contrôle interne lors de l'analyse ultérieure (section 7).
  2. Mettre en place un bain de 8 litres de volume de travail de l' eau, par exemple, 50 x 40 x 40 cm, dans un seau en mousse de polystyrène à isolation thermique ou similaire. Monter le thermostat réglable sur le bain d'eau pour réguler la température suivante (étape 2.7).
  3. Transférer la totalité de l'ensemble sur une plaque d'agitation magnétique et placer une barre d'agitation magnétique dans le bain d'eau. Assurez-vous que le champ magnétique est assez forte pour faire tourner la barre d'agitation.
  4. Entourez la barre d'agitation avec au moins quatre tuiles de support sur lequel un panier de polypropylène (étape 2.6) sera placé plus tard au cours de la procédure de blanchissement. Assurez - vous que les tuiles de support sont fabriqués à partir d' un matériau non magnétique (par exemple, un alliage d'acier inoxydable contenant du nickel) et qu'ilssont plus élevés que la barre d'agitation (Figure 2).
  5. Ajouter 8 litres d'eau déminéralisée dans le bain d'eau.
    NOTE:. L' utilisation d' un tampon, par exemple, le phosphate de sodium 50 mM (pH 7,5), peut améliorer les rendements en protéines cible si faibles précipitations de pH est un problème.
  6. Placez un cm en polypropylène panier 23 x 23 x 23 sur les tuiles de soutien et assurez-vous que le panier ne pas interférer avec la rotation de la barre d'agitation et qu'il est complètement immergé dans le liquide. Si nécessaire, ajouter plus d'eau / tampon jusqu'à ce que le panier est complètement immergée, puis retirer le panier à nouveau.
    ATTENTION: Toutes les étapes ultérieures de 2.12 impliquent la manipulation de liquide chaud. Porter un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants isolés thermiquement.
  7. Utiliser le thermostat réglable pour amener le bain d'eau à 70 ° C (ou la température requise pour les expériences). Attendre au moins 15 minutes après que la température désirée est atteinte pour assurer la totalité de l'ensemble a atteint un thermal 'équilibre.
  8. Préparer des aliquotes 150 g de feuilles de tabac récoltées. Placer une aliquote dans le panier , tout en évitant la compression irréversible et les dégâts sur les feuilles, par exemple par déchirure. Évitez de trop remplir le panier avec du matériel végétal ou d'un empilement dense de ce dernier.
  9. Soigneusement mais rapidement plonger le panier dans le liquide chaud et placez-le sur les tuiles de soutien. Placer un bloc d'acier inoxydable sur le dessus du panier afin d'éviter la flottation.
  10. Incuber les feuilles pendant 5 min dans le liquide de blanchiment, ou sélectionnez un temps convenant à la conception expérimentale. Surveiller la température du liquide pendant la totalité de la période d'incubation.
  11. Retirez délicatement le panier du fluide blanchissement et laisser résiduelle fuite liquide à partir des feuilles pendant 30 secondes. Prendre ensuite la plante laisse de la corbeille, les transférer dans le mélangeur et commencer immédiatement l'extraction (section 3).
    NOTE: Les plantes peuvent être conservés pendant de longues périodes de temps après la décoloration et avant le début de the extraction, par exemple, plus de 30 minutes sur la glace ou congelé à -20 ° C pendant plusieurs semaines a été testé avec succès. Cependant, la stabilité du produit peut diminuer avec l'augmentation des temps de stockage et donc un traitement immédiat est recommandé.
  12. Répétez les étapes 2.8 à 2.11 avec un matériau de feuille fraîche jusqu'à ce que la totalité de la biomasse récoltée est traitée.

3. Extraction des protéines de feuilles de tabac

ATTENTION: Les prochaines étapes impliquent un mélangeur avec des lames rotatives. Ne pas travailler dans le seau de mélangeur lorsqu'il est monté sur le moteur du mélangeur.

  1. Placer 150 g (masse humide) de la récolte (étape 1.3) ou blanchies (étape 2.11) des feuilles dans le mélangeur et ajouter 450 ml de tampon d'extraction (phosphate de sodium 50 mM, chlorure de sodium 500 mM, du disulfite de sodium 10 mM, pH 8,0).
    REMARQUE: La composition du tampon d'extraction dépend de la protéine à extraire et peut donc nécessiter un ajustement, par exemple, l' utilisation d'un tampon de pH ou de composant tel que Trest.
  2. Homogénéiser les feuilles pendant 3 x 30 impulsions par seconde avec 30 sec entrecoupé des pauses. Veiller à ce que les feuilles sont homogénéisés et ne bouchent pas le godet mélangeur. Arrêter le mélangeur et soulever les feuilles pour éviter le colmatage si nécessaire, et ensuite continuer l'homogénéisation.
  3. Prenez un échantillon de 1 ml de chaque extrait qui est produit pour une analyse ultérieure (section 7). Si le matériel végétal est blanchies, passez à la section 6. Sinon continuer la précipitation de la chaleur dans un récipient (section 4) ou de l'échangeur de chaleur (section 5), en fonction de l'approche expérimentale sélectionnée.

4. Facultatif: Heat Précipitation dans un navire Brassé

REMARQUE: Effectuer les étapes décrites dans les sections 4.2 à 4.11 afin de précipiter RSG du tabac dans un récipient agité. Passer toute la section 4, si RSG ont été précipités par blanchissement (section 2) ou seront précipités en utilisant un échangeur de chaleur (section 5).

  1. Mettre en place deux 8-L d'eau du volume de travailbains, par exemple, 50 x 40 x 40 cm, en mousse de polystyrène thermiquement isolé ou similaire. Dans le premier bain, monter le thermostat réglable pour le réglage de la température subséquente (étape 4.6). Dans le second, ajouter 5 litres d'eau déminéralisée et 2 kg de glace pour le refroidissement ultérieur (étape 4.9).
  2. Transférer le premier bain d'eau sur une plaque d'agitation magnétique et placer le récipient en acier inoxydable de 2 L dans le bain d'eau de telle sorte que le centre du récipient est aligné sur le centre de la plaque d'agitation.
  3. Placez une barre d'agitation magnétique dans le récipient en acier inoxydable. Assurez-vous que le champ magnétique est assez forte pour faire tourner la barre d'agitation.
  4. Remplir le bain d'eau avec de l'eau déminéralisée à 5 cm en dessous du bord supérieur du récipient en acier inoxydable. Ensuite, remplissez le récipient avec un tampon d'extraction. Placer un couvercle en mousse de polystyrène sur le navire.
    ATTENTION: Toutes les étapes ultérieures jusqu'à 4.9 impliquent la manipulation de liquide chaud. Porter un équipement de protection individuelle approprié, y compris ins thermiquementgants menté.
  5. Insérer un thermomètre dans le récipient en acier inoxydable à travers un trou dans le couvercle draperie en mousse de polystyrène. Régler la température du bain d'eau à 78 ° C et laisser incuber la totalité de l'ensemble pendant 15 minutes pour atteindre l'équilibre thermique. Faire en sorte que la température dans le récipient est de 70 ° C à environ 8 ° C en dessous du point le bain d'eau réglé.
  6. Si la température dans le récipient en acier inoxydable est différent de 70 ° C, régler la température du bain d'eau en conséquence et laisser le système équilibrer pendant encore 15 minutes. Répéter cette étape jusqu'à ce que la température dans le récipient est de 70 ° C ou selon les besoins de l'expérience, et vider la cuve en acier inoxydable.
  7. Verser 300 ml d'extrait (étape 3.2) dans le récipient en acier inoxydable pendant qu'il est encore dans le bain d'eau et de démarrer une minuterie. Incorporer l'extrait à 150 rpm et incuber pendant 5 min. Faire en sorte que l'extrait atteigne une température de 70 ° C pendant au moins 2 minutes au cours de cette période d'incubation.
  8. Retirer le bain d'eau chaude à partir de l'agitateur magnétique, retirez la cuve en acier inoxydable et le placer dans le seau à glace. Placez ce dernier sur l'agitateur magnétique et retirez le couvercle de mousse de polystyrène.
  9. Faire en sorte que l'homogénat de plante est bien agité à 150 tours par minute, placer le thermomètre dans l'extrait et laisser incuber jusqu'à ce qu'il atteigne une température de 20 ° C ou à la température indiquée par la conception expérimentale.
  10. Répéter les étapes 04.07 à 04.09 pour toutes les aliquotes. Prenez un échantillon de 1 ml de chaque chaleur précipité extrait une fois qu'il a atteint la température finale, puis passez à l'article 6.

5. Facultatif: Heat Précipitation dans un échangeur de chaleur

REMARQUE: Effectuer les étapes décrites dans les sections 5.2 à 5.12 afin de précipiter RSG de tabac en utilisant un échangeur de chaleur. Passer toute la section 5, si RSG ont été précipités par blanchissement (section 2) ou dans un récipient chauffé (section 4).

  1. Mettre en place deux volumes de travail 8-Lbains d'eau, par exemple, 50 x 40 x 40 cm, en polystyrène seaux en mousse à isolation thermique ou similaire. Dans le premier bain, monter le thermostat réglable pour le réglage de la température subséquente (étape 5.3). Dans le second, ajouter 5 litres d'eau déminéralisée et 2 kg de glace pour le refroidissement ultérieur (étape 5.10).
    ATTENTION: Toutes les étapes ultérieures jusqu'à 5,9 impliquent la manipulation de liquide chaud. Porter un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants isolés thermiquement.
  2. Remplissez le premier bain d'eau avec 8 litres d'eau déminéralisée. Réglez la température à 74,5 ° C en utilisant le thermostat. Incuber l'ensemble pendant 15 minutes pour atteindre l'équilibre thermique.
  3. Préparer un récipient de stockage isolé en plaçant un 0,5-L bêcher en plastique dans un 1-L bêcher en plastique et combler les lacunes avec de la laine de coton. Vous pouvez également utiliser un récipient isolé thermiquement dédié avec un volume de travail de 0,5 L.
  4. Relier l'échangeur de chaleur à la pompe péristaltique à une extrémité et à un tuyau de sortie de la other fin en utilisant L / S 24 tubes. Placer les deux extrémités de tubage le long d'un thermomètre dans le récipient de stockage isolé et le remplir avec un tampon d'extraction 300 ml (Figure 2).
  5. Placez l'échangeur de chaleur dans le bain d'eau chaude et démarrer la pompe péristaltique à un débit de 300 ml min -1. Faire en sorte que la température qui en résulte dans le récipient est de 70 ° C à environ 4,5 ° C en dessous du point le bain d'eau réglé, après 3 min.
  6. Si la température dans la cuve à isolation diffère de 70 ° C, régler la température du bain d'eau en conséquence et laisser le système équilibrer pendant encore 15 minutes. Répéter cette étape jusqu'à ce que la température du tampon d'extraction augmente de la température ambiante à 70 ° C en moins de 3 minutes, ou égale à celle requise pour l'essai, et vider la cuve en acier inoxydable.
  7. Jeter le tampon d'extraction de la cuve isotherme et préparer des aliquotes de 300 ml de l'extrait végétal. Remplir le récipient avec une aliquote isolée.
  8. Pomper l'extrait de plante (section 3.3) à travers l'échangeur de chaleur à 300 ml min -1 pendant 5 min. Faire en sorte que la température d'extraction est de 70 ° C au bout de 3 min, ou égale à la température définie dans la conception expérimentale.
  9. Après 5 min, placer l'échangeur de chaleur dans le bain d'eau glacée tandis que l'extrait est toujours en cours de pompage. Laisser incuber dans ce milieu jusqu'à ce que la température atteigne exactement 20 ° C ou à la température définie dans la conception expérimentale.
  10. Retirer le tuyau d'entrée relié à la pompe péristaltique du récipient isolé et continuer le pompage résiduel pour recueillir un extrait végétal chaleur précipité à partir de l'échangeur de chaleur. Ensuite, arrêter la pompe.
  11. Répéter les étapes 5.7 à 5.10 pour toutes les aliquotes. Prenez un échantillon de 1 ml de chaque extrait de chaleur précipité une fois qu'il a atteint la température finale, puis transmettre les extraits à sac de filtration (section 6).
    Remarque: après un premier cycle à travers les étapes 05.07 à 05.10 il n'y aura pas de tampon d'extractionjeter à l'étape 5.7.

6. Sac de filtration de l'extrait végétal

  1. Monter un filtre à sac dans le panier de support correspondant qui est monté dans le boîtier de filtre et fournit un support mécanique pour le matériau filtrant flexible. Placez un récipient de 1 L sous le panier et appliquer les aliquotes d'extrait (de la section 3.3, 4.10 ou 5.11 selon le traitement thermique choisi) à la poche à un débit de 150 ml min -1.
  2. Après filtration, on mesure la turbidité d'une dilution 1:10 du filtrat dans un tampon d'extraction à l'aide du turbidimètre.
  3. Prenez un échantillon de 1 ml et traiter le sac filtrat tel que défini dans le plan expérimental, par exemple, la filtration en profondeur et Chromatographie 7,10.

7. Analyse de l'échantillon

  1. Mesurer la quantité de protéine totale soluble (TSP) en utilisant la méthode de Bradford 24,25.
    1. En trois exemplaires, pipette 2,5 pi de chaque échantillon dans les puits individuels d'uneplaque de 96 puits. Inclure huit sérum - albumine bovine (BSA) normes en triple exemplaire , couvrant la gamme 0 - 2,000 pg ml -1.
    2. Ajouter 200 ul de réactif Bradford chaque puits et mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas, mais assez doucement pour éviter la formation de bulles.
    3. Incuber pendant 10 min à 22 ° C et on mesure l'absorbance à 595 nm dans un spectrophotomètre. Calculer la concentration de TSP dans les échantillons sur la base d'une courbe d'étalonnage à travers les points de référence BSA.
  2. Quantifier Vax8 par plasmon de surface 26 spectroscopie de résonance.
    1. Configurer l'appareil de la surface de la résonance plasmonique de 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) exécutant un tampon (10 mM d'HEPES, l'acide éthylènediaminetétraacétique 3 mM (EDTA), le chlorure de sodium mM 1,500, 0,05% v / v de polysorbate 20, pH 7,4) et monter une puce de surface dextran carboxyméthylé dans le dispositif. Utilisez la fonction première pour purger le système et commencer une course manuelle avec un taux de 30 fluxmin -1 ul sur des cellules d'écoulement 1 et 2. Injecter 30 mM de chlorure d'hydrogène à deux reprises pendant 60 secondes avec 60 secondes par injection intercalés d'hydroxyde de sodium à 25 mM.
    2. Préparer 200 pi de 500 pg ml - 1 de mAb 5,2 solution dans de l' acétate de sodium 10 mM (pH 4,0). Décongeler 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et du N - hydroxysuccinimide (NHS) et des flacons à centrifuger les 16 000 x g pendant 1 min. Mélanger 70 pi d'EDC avec 70 pi de NHS et transférer dans un flacon en plastique de 7 mm.
    3. Activer la surface de la puce de la surface de dextran carboxyméthylé en injectant le mélange EDC / NHS sur des cellules d'écoulement 1 et 2 pendant 10 min avec un débit de 10 min -1 ul d'écoulement.
    4. Définir le chemin d'écoulement vers la cellule 2 que l'écoulement. Couple mAb 5.2 en l' injectant pendant 15 min à une vitesse de 10 pi min -1.
    5. Mettez le chemin d'écoulement à l' écoulement des cellules 1 et 2 et injecter éthanolamine pendant 7 min à une vitesse de 5 pi min -1 pour désactiver la surface. Then injectent 30 mM de chlorure d'hydrogène à deux reprises pendant 60 secondes avec 60 secondes par injection intercalés d'hydroxyde de sodium à 25 mM.
    6. Injecter les échantillons et MSP1 - normes 19 à un taux de 30 min pi -1 pour 180 sec. Assurez -vous que la concentration Vax8 est de 50 - 1000 ng ml -1. Préparer pré-dilutions en HEPES solution saline tamponnée contenant de l'EDTA et de polysorbate 20 (HBSEP) si nécessaire.
    7. Soustraire le signal de crête de la cellule d'écoulement 1 de celle de la cellule d'écoulement 2 et utiliser la différence pour calculer la concentration Vax8 dans des échantillons en fonction du signal de MSP 1 - injection 19 avec une concentration en protéine connue de 500 ng ml - 1.
    8. Régénérer la surface de la puce après chaque échantillon ou MSP 1-19 injection par l' exposition à 30 mM de chlorure d'hydrogène pendant 60 secondes à une vitesse de 30 min ul d'écoulement -1.
  3. Quantifier DsRed par spectrométrie de fluorescence
    1. En trois exemplaires, pipette 50 ul de chaque échantillon dans les puits individuels d'une demi-ar noirea plaque de 96 puits. Inclure six normes DsRed couvrant la gamme 0 - 225 pg ml -1.
    2. Mesurer la fluorescence en double en utilisant un filtre à 530 ± 30 nm d'excitation et un filtre d'émission de 590 ± 35 nm dans un spectrophotomètre. Calculer la concentration DsRed dans les échantillons sur la base d'une courbe standard par les points de référence DsRed.
  4. Détermination de la distribution des tailles de particules
    1. Laver une cuvette avec 1 ml d'isopropanol, puis avec 2 ml d'eau déminéralisée pour éliminer les particules de poussière. Introduire à la pipette 850 ul de l'échantillon dans la cuvette.
    2. Placez la cuvette dans le potentiel et particules analyseur zeta de taille. Ouvrez le «Logiciel» et démarrer une mesure manuelle avec "Protein" en tant que matière et "PBS" comme dispersant. Sélectionner une température comprise entre 25 ° C et un temps d'attente de 180 s.
    3. Choisissez la cellule "DTS0012" et la mesure à 173 ° rétrodiffusion. Cochez la case "auto" fonction pendant la durée de mesure et de sélectionner trois mesures sans retard intercalés.
    4. Enquêter sur la taille des particules de distribution de pointe profil une fois que la mesure est terminée en sélectionnant les trois mesures de l'échantillon dans la vue de l'expérience. Choisissez l'onglet "Volume PSD".

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Résultats

La précipitation thermique des protéines cellulaires de tabac hôte par blanchissement
La procédure de blanchiment décrit dans la section 2. a été utilisé avec succès pour précipiter RSG de feuilles de tabac avec 70 ° C, ce qui réduit le FST de 96 ± 1% (n = 3) tout en récupérant jusqu'à 51% de la protéine cible Vax8, augmentant ainsi sa pureté de 0,1% à 1,2% avant la séparation chromatographique 16. Il a également été possible de récupérer 83 ± 1% (...

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Discussion

Les trois méthodes pour la précipitation de chaleur décrites ci - dessus peuvent éliminer efficacement RSG du tabac avant toute étape de purification chromatographique 16,17. Elles complètent d' autres stratégies visant à accroître la pureté initiale du produit, par exemple, guttation 29, rhizosecretion 30 ou centrifuge extraction 31,32, qui sont limitées à des protéines sécrétées. Cependant, les méthodes basées sur la chaleur ne peuvent être utilisés d'une ma...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Thomas Rademacher, Alexander Boes et Véronique Beiß pour avoir fourni les graines de tabac transgéniques, et Ibrahim Al Amedi pour la culture des plants de tabac. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Richard M. Twyman pour son aide rédactionnelle ainsi que Güven Edgü pour avoir fourni la référence MSP1-19. Ce travail a été financé en partie par la subvention avancée du Conseil européen de la recherche ''Future-Pharma'', proposition numéro 269110, la Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fondation Fraunhofer Future) et les programmes internes Fraunhofer-Gesellschaft sous la subvention n°. Attirer 125-600164.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2100P Turbidimètre portableHach4650000
Kit de couplage d’aminesGE HealthcareBR100050  ;Kit de couplage de puces SPR
Panier d’autoclaveNalgene6917-0230Panier pour blanchiment des feuilles
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01Appareil SPR
Bio Cell Analyser BCA 003 R& D avec 3D ORMSequipn.a.Analyseurde taille de particules
BlenderWaring800EGBlender
BP-410Furh2632410001Filtre à manches
Centrifugeuse 5415DEppendorf5424 000.410Centrifugeuse
Tube à centrifuger 15 mlLabomedic2017106Tube à réaction
Tube à centrifuger 50 ml autonomeLabomedic1110504Tube de réaction
puce CM5GE HealthcareBR100012  ;Puce pour les mesures SPR
Cuvette 10 x 10 x 45Sarsted67.754Cuvette pour Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEsoftware
Phosphate disodiqueCarl Roth GmbH  ; 4984.3  ;Composant multimédia
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Engrais
Forma -86C Congélateur ULTThermoFisher88400Congélateur
Serren.a.n.a.Pourla culture des plantes
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Bloc de laine de roche
Échangeur de chaleur à vingt boucles (longueur 4,8 m)n.a. (conception sur mesure)n.a.Heat échangeur
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Composant de média
K200P 60DPall5302303Couche filtrante en profondeur
KS50P 60DPallB12486Couche filtrante en profondeur
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Thermostat à bain d’eau
L/S 24MasterflexSN-06508-24Tube
mAb 5.2American Type Culture CollectionHB-9148Vax8 Anticorps spécifique
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Pompe péristaltique
MiraclothLabomedic475855-1RTissu filtrant
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-mètre / conductimètre
Osram cool white 36 WOsram4930440Source lumineuse
PhytotronIlka Zelln.a.Pourla culture des plantes
Disulfite de sodiumCarl Roth GmbH8554.1Composant de média
Chlorure de sodiumCarl Roth GmbHP029.2Composant
de média Récipient en acier inoxydable ; 0,7 kg 2,0 L ; hauteur 180 mm ; diamètre 120 mmn.a. (conception sur mesure)n.a.Récipientpour précipitation de chaleur
Synergy HTBioTekSIAFRTLecteur de plaques de fluorescence et spectrométrique
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Boîtier de filtre
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS Mesure de la distribution granulométrique
Zetasizer Software v7.11Malvernn.a.Logicielpour faire fonctionner l’appareil Zetasizer Nano ZS
de turbidimètre

Références

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