Nous décrivons ici une configuration comportementale et une méthode d’analyse de données permettant de doser les réponses olfactives de jusqu’à 100 mouches du vinaigre (Drosophila melanogaster). Ce système peut être utilisé avec un ou plusieurs stimuli olfactifs, et adaptable pour l’activation optogénétique ou le silençage de sous-ensembles neuronaux.
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Article de méthode
Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre comment les circuits neuronaux fonctionner pour guider les comportements des animaux appropriés. Drosophila melanogaster est un excellent modèle pour de telles enquêtes en raison de ses comportements complexes, techniques génétiques puissants, et le système nerveux compact. Laboratoire des essais de comportement ont longtemps été utilisés avec la drosophile pour simuler les propriétés de l'environnement naturel et d' étudier les mécanismes neuronaux sous - jacents aux comportements correspondants (par exemple phototaxie, chimiotactisme, apprentissage sensoriel et de la mémoire) 1-3. Avec la récente disponibilité de grandes collections de lignées transgéniques Drosophila qui étiquettent des sous - ensembles de neurones spécifiques, tests comportementaux ont pris un rôle de premier plan pour relier les neurones avec des comportements 4-11. paradigmes polyvalents et reproductibles, ainsi que les routines de calcul sous-jacentes à l'analyse des données, sont indispensables pour des tests rapides de lignes de mouches des candidats avec divers genotypes. Sont particulièrement utiles les configurations qui sont flexibles dans le nombre d'animaux testés, la durée des essais et la nature des stimuli présentés. Le dosage de choix devrait également générer des données reproductibles qui sont faciles à acquérir et à analyser. Ici, nous présentons une description détaillée d'un système et d'un protocole pour tester les réponses comportementales de Drosophila vole dans une grande arène de quatre champs. La configuration est utilisée ici pour évaluer la réponse de mouches à un seul stimulus olfactif; cependant, la même configuration peut être modifiée pour tester olfactives multiples, des stimuli visuels ou optogénétiques, ou une combinaison de ceux-ci. La configuration de l'olfactomètre enregistre l'activité des populations de mouches répondant aux odeurs, et les méthodes analytiques de calcul sont appliquées pour quantifier les comportements de mouche. Les données recueillies sont analysées pour obtenir une lecture rapide d'un essai expérimental, ce qui est essentiel pour la collecte de données efficace et l'optimisation des conditions expérimentales.
Introduction
La capacité d'adaptation et de répondre à l'environnement extérieur est essentiel pour la survie de tous les animaux. Un animal a besoin pour éviter les dangers, chercher la nourriture et trouver des partenaires, et d'apprendre des expériences précédentes. Les systèmes sensoriels fonctionnent pour recevoir une variété de stimuli, tels que visuelle, chimique et mécanosensorielle, et envoie ces signaux au système nerveux central doit être interprété et décodé. Le cerveau dirige ensuite les comportements moteurs appropriés en fonction de l'environnement perçu, comme la recherche de nourriture ou échapper à un prédateur. Comprendre comment les systèmes se....
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Protocole
1. Configuration Assemblée
- Fabrication l'arène en forme d'étoile (19,5 cm par 19,5 cm par 0,7 cm) de polytétrafluoroéthylène (PTFE) selon le dessin (les matériaux supplémentaires, de SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) fournies. L'arène peut être fabriquée par un commercial ou d'une installation personnalisée.
- L'acquisition de deux plaques de verre (20,25 cm par 20,25 cm avec une épaisseur de 2 mm), et percer un trou (~ 0,7 cm de diamètre) exactement au centre de l'une des plaques de verre à l'aide d'un trépan diamanté.
- Fabrication d'une boîte de comportement étanche à la lumière pour l'arène ....
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Résultats
Les quatre quadrants olfactomètre dossiers d'analyse et analyse les activités de marche de beaucoup de mouches sur un grand espace de comportement. Odorants peuvent être introduits dans les air-courants qui entrent dans un, deux, trois ou les quatre quadrants. En l'absence d'odeurs, les mouches se déplacer librement entre les quatre quadrants. Ce comportement est essentiel d'observer car elle indique que les biais un-intentionnel n'a pas été introduit dans le dosage. .......
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Discussion
Le olfactomètre quatre champ décrit ici est un système polyvalent de comportement pour étudier les réponses olfactives des grandes populations de type sauvage et mutant drosophile mouches. Chaque expérience prend ~ 1 h (y compris l'installation, essais expérimentaux, et le nettoyage), et 4-6 expériences peut être effectuée régulièrement chaque jour. Un essai typique utilisant 40-50 mouches pendant 5 minutes génère environ 450.000 suivis de points de données pour l'analyse. La configuration décrite peut .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous remercions Terry Shelley pour la fabrication de l’arène de mouches et de l’enceinte étanche à la lumière, Liz Marr pour son aide pour la maintenance du stock de mouches, et Xiaojing Gao et Junjie Luo pour leur aide avec le code Matlab utilisé pour l’analyse des données. Nous remercions Johan Lundström du Monell Chemical Senses Center d’avoir démontré sa configuration de diffusion des odeurs. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Whitehall Foundation (CJP) et du NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| air puissantnbsp ; | (Quantité nécessaire) | ||
| Tubes et connecteurs | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Mamelon réducteur hexagonal (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tube ( ID :1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 pieds |
| (ID :1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Raccords de tubes barbelés | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 paquet |
| raccords de tubes Push-to-connect | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| raccords de tubes barbelés (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, États-Unis | 5463K439 | 1 paquet (10) |
| Raccords de tubes cannelés (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 paquet de | 2 (10) ; |
| Raccords de tubes barbelés (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | paquet de 2 (10) ; |
| Raccords de tubes barbelés (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA& | nbsp ; 5670K84 | 1 |
| Bouchon à tête hexagonale | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Régulateur de pression d’air, filtre à air et débitmètres | (Quantité nécessaire) | ||
| Unité de séchage de gaz labatoire | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Modèle : L68-NP-303 ; stock #26840 | 1 |
| Cadres multitubes pour tubes d’écoulement de 150 mm | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Cadres multitubes pour tubes d’écoulement de 150 mm | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| Tubes d’écoulement de 150 mm | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | Cartouche |
| 9 vannes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Régulateur d’air de précision | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Électrovannes | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Contrôleur d’électrovanne | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Débitmètre électronique | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) et a ; | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Bloc d’alimentation | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Chambres anti-odeurs Pot | |||
| en polypropylène à large ouverture 2 oz ; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | Au moins 5 sont nécessaires par expérience, mais une chambre distincte est nécessaire pour chaque distribution de chaque odorisant. Disponible chez Container Store, pièce #635114) |
| Chambre odorante en verre, bouteille Sunburst de 0,25 oz | LB4B | Au moins 5 sont nécessaires par expérience. | |
| Vanne « In » pour chambre d’odorat | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 de ces pièces est utilisée par chambre d’odorat mais elles doivent être remplacées fréquemmentVanne |
| de sortie pour chambre d’odorat | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 de ces pièces est utilisée par chambre d’odorat mais elles doivent être remplacées fréquemment |
| Joint torique | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 paquet (100) |
| Fly arena, camera et behavior boxes | (Quantité nécessaire) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS noir extrudé (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Téflon pour manège à mouches et chambres à odeurs, 3/8 » d’épaisseur, 12 » x 12 | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 ; | 1 |
| Plaques de verre, 1/8 » d’épaisseur, 9 » x 9" | McMaster-Carr, IL, États-Unis | 8476K191 ; | deux |
| Contrôleur thermoélectrique à double action | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 matrices de LED et une alimentation électrique |
| Climatiseur Unité | Melcor Store | ; MAA280T-12 | 1 |
| Système d’imagerie | (Quantité nécessaire) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) Objectif à monture C | B ET H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | KP | 1 |
| CCXC-12P05N Câble d’interconnexion | B ET H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, États-Unis | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Adaptateur d’appareil photo | B ET H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 1 | |
| B+W 40,5 093 Filtre IR | B ET H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Polariseur circulaire | Amazon | 1 | |
| Caméra vidéo IR | Source de vision industrielle, FL, États-Unis | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| Convertisseur vidéo USB | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (logiciel de suivi des mouches) | Julian Brown, Stanford, Calfornia : julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, États-Unis (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Divers | (Quantité nécessaire) | ||
| Outil rotatif Dremel | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 ; | 1 |
| Forets diamantés pour la découpe du verre | Disponible auprès de différents fournisseurs ; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
Références
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (8....
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Réimpressions et autorisations
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