Article de méthode
cultures sont un bon Neuronal modèle pour l'étude des techniques nouvelles de stimulation du cerveau par leurs effets sur les neurones individuels ou une population de neurones. Présentés ici sont des méthodes différentes pour la stimulation des cultures de neurones à motifs par un champ électrique produit par des électrodes directement de bain ou induite par un champ magnétique variant dans le temps.
Un neurone se déclenche un potentiel d'action lorsque son potentiel de membrane dépasse un certain seuil. Dans l'activité typique du cerveau, cela se produit à la suite d'intrants chimiques à ses synapses. Cependant, les neurones peuvent également être excités par un champ électrique imposé. En particulier, les applications cliniques récentes activent des neurones en créant un champ électrique externe. Il est donc intéressant d'étudier comment le neurone répond au champ extérieur et ce qui cause le potentiel d'action. Heureusement, une application précise et contrôlée d'un champ électrique extérieur est possible pour les cellules neuronales embryonnaires qui sont excisés, dissocié et cultivées dans des cultures. Cela permet à l'enquête sur ces questions dans un système hautement reproductible.
Dans cet article, quelques-unes des techniques utilisées pour l'application contrôlée de champ électrique externe sont passés en revue sur les cultures neuronales. Les réseaux peuvent être soit une dimension, à savoir un motif en lineaR forme ou autorisées à se développer sur tout le plan du substrat, et donc deux dimensions. De plus, l'excitation peut être créé par l'application directe du champ électrique par des électrodes immergées dans le fluide (électrodes de bain) ou en induisant le champ électrique à l'aide de la création à distance d'impulsions magnétiques.
L'interaction entre les neurones et les champs électriques externes a des implications fondamentales et des aspects pratiques. Bien qu'il soit connu depuis les temps de Volta qu'un champ électrique appliqué de l'extérieur peut exciter le tissu, les mécanismes responsables de la production d'un potentiel d'action résultant dans les neurones ne commencent qu'à se dévoiler 1 , 2 , 3 , 4 . Cela comprend la recherche de réponses aux questions concernant le mécanisme qui provoque la dépolarisation du potentiel membrana....
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Déclaration d'éthique: les procédures concernant le traitement des animaux ont été effectuées conformément aux directives du Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) de l'Institut Weizmann des sciences, et la loi israélienne appropriée. L'Institut Weizmann est accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation du laboratoire international de protection des animaux (AAALAC). Le Institutional Animal Care Weizmann et utilisation Comité a approuvé cette étude, menée avec les neurones hippocampiques.
1. Préparation de deux dimensions (2D) et unidimensionnels (1D) Cultures hippocampiques
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Le protocole présenté permet un modelage facile des cultures neuronales. Lorsqu'il est combiné avec plusieurs méthodes, nous avons développé pour la stimulation, il permet de mesurer certaines propriétés intrinsèques du neurone telles que Chronaxie et Rheobase 5 , pour comparer les propriétés des neurones sains et malades 27 , pour trouver des moyens optimaux de stimuler les cultures en fonction de Leur structure et beaucoup d'autres approc.......
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1D motif est un outil important qui peut être utilisé pour une variété d'applications. Par exemple, nous avons utilisé 1D motifs pour créer des portes logiques à partir des cultures de neurones 29 et plus récemment pour mesurer la Chronaxie et Rhéobase des neurones hippocampiques de rat 5, et le ralentissement de la vitesse de propagation du signal d'activité de mise à feu dans les neurones hippocampiques du syndrome de Down par rapport à la type sauvage (WT) neuro.......
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Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Les auteurs remercient Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef et Eitan Reuveny des discussions très utiles. Les auteurs remercient Ilan Breskin et Jordi Soriano pour développer les premières versions de la technologie. Les auteurs remercient Tsvi Tlusty et Jean-Pierre Eckmann aide les concepts théoriques. Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, le Ministère de la Science et de la technologie, Israël et par Israël pour la science subvention 1320-1309 et la science binationale Fondation subvention 2.008.331.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Déconnectez le réseau. Mentionné dans la section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Médium de placage. Mentionné dans la Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Déconnecter le réseau. Mentionné à la section 2.4.2 |
| Borax (tétraborate de sodium décahydraté) | Sigma-Aldrich | S9640 | Tampon au borate. Mentionné à la section 1.1.2 |
| Acide borique | Frutarom LTD | 5550710 | Tampon borate. Mentionné à la section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka ; | 21098 | Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné dans la Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Déconnectez le réseau. Mentionné à la section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Simulation numérique. Mentionné à la section 3.5.2 |
| D-(+)-glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Milieu de placage, solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné dans les sections 1.1.1 et 1.5.2 |
| Cultures cellulaires D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | . Mentionné dans les sections 1.2.4 et 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Agent de placage. Mentionné dans la section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentionné à la section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imagerie de l’activité spontanée ou évoquée. Mentionné dans les sections 1.5.1, 1.5.3 et 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Milieu changeant. Mentionné dans la section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné dans la section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné à la section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné aux sections 1.1.1, 1.4.1 et 1.4.2 |
| KCl, ; 3 M | Merck | 1049361000 | Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2 |
| Laminine ; | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentionné dans la section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Médium de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné à l’article 1.4.1 ; ; 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné dans la section 1.5.2 |
| Octadécanéthiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Nettoyage des lamelles enrobées de Cr-Au (cultures 1D). Mentionné à la section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation ; | 50475278 | Revêtement de bio-réjection, revêtement biologique. Mentionné dans les rubriques 1.2.4 et 1.2.6 |
| Solution de poly-L-lysine à 0,01 %. | Sigma-Aldrich | ; P47075 | Favorise la division cellulaire. Mentionné à la section 1.1.4 |
| Saccharose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2 |
| Thiol ; | Sigma-Aldrich | 1858 | . Mentionné dans la Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Milieu changeant. Mentionné à la section 1.4.1 |
| Machine de pulvérisation AJA | International, Inc | ATC Orion-5Series ; | revêtement du verre avec de fines couches de métal. Mentionné dans la section 1.2.2 |
| Traceur de stylo | Hewlett Packard ; | HP 7475A | Gravure du motif sur la lamelle revêtue. Mentionné à la section 1.2.5 |
| Fils d’électrodes ; | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Stimulation électrique de cultures neuronales. Mentionné aux sections 2.1, 2.2, 2.3 et 2.4.5 |
| Générateur de signaux | BKPrecision | 4079 | Mise en forme du signal électrique. Mentionné dans la section 2.3 |
| Amplificateur | maison | Amplification de tension du signal du générateur de signaux vers les électrodes. Mentionné dans la section 2.3 | |
| Matrice d’alimentation ; | MPS-3005 LK-3 ; | Alimentation de la machine à pulvériser. Mentionné dans la section 1.2.2.3 | |
| Stimulation magnétique transcrânienne | Magstim, Spring Gardens, Royaume-Uni | Rapid 2 | Stimulation magnétique de la culture neuronale. Mentionné dans les sections 3.1, 3.3 et 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Coulée de bobines faites maison. Mentionné dans la section 3.4 |
| Coque époxy | EPON 815 ; | Coulée de bobines faites maison. Mentionné à la section 3.4 | |
| Fils de platine 0,005'' d’épaisseur ; Systèmes A-M, ; | ; Carlsborg WA& | nbsp ; 767000 | Stimulation électrique de cultures neuronales. Mentionné dans la section 2.1 |
| Bobine magnétique circulaire | Stimulation magnétique maison | de la culture neuronale. Mentionné à la section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B& K Précision ; | Logiciel d’édition de formes d’onde. Mentionné dans la Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive. Mentionné à la section 2.4.4 |
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