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Article de méthode

Externe Excitation Neurones Utilisation de champs électriques et magnétiques et des cultures dans One- à deux dimensions

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DOI :

10.3791/54357

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7 mai 2017

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1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Dans cet article

Résumé

cultures sont un bon Neuronal modèle pour l'étude des techniques nouvelles de stimulation du cerveau par leurs effets sur les neurones individuels ou une population de neurones. Présentés ici sont des méthodes différentes pour la stimulation des cultures de neurones à motifs par un champ électrique produit par des électrodes directement de bain ou induite par un champ magnétique variant dans le temps.

Résumé

Un neurone se déclenche un potentiel d'action lorsque son potentiel de membrane dépasse un certain seuil. Dans l'activité typique du cerveau, cela se produit à la suite d'intrants chimiques à ses synapses. Cependant, les neurones peuvent également être excités par un champ électrique imposé. En particulier, les applications cliniques récentes activent des neurones en créant un champ électrique externe. Il est donc intéressant d'étudier comment le neurone répond au champ extérieur et ce qui cause le potentiel d'action. Heureusement, une application précise et contrôlée d'un champ électrique extérieur est possible pour les cellules neuronales embryonnaires qui sont excisés, dissocié et cultivées dans des cultures. Cela permet à l'enquête sur ces questions dans un système hautement reproductible.

Dans cet article, quelques-unes des techniques utilisées pour l'application contrôlée de champ électrique externe sont passés en revue sur les cultures neuronales. Les réseaux peuvent être soit une dimension, à savoir un motif en lineaR forme ou autorisées à se développer sur tout le plan du substrat, et donc deux dimensions. De plus, l'excitation peut être créé par l'application directe du champ électrique par des électrodes immergées dans le fluide (électrodes de bain) ou en induisant le champ électrique à l'aide de la création à distance d'impulsions magnétiques.

Introduction

L'interaction entre les neurones et les champs électriques externes a des implications fondamentales et des aspects pratiques. Bien qu'il soit connu depuis les temps de Volta qu'un champ électrique appliqué de l'extérieur peut exciter le tissu, les mécanismes responsables de la production d'un potentiel d'action résultant dans les neurones ne commencent qu'à se dévoiler 1 , 2 , 3 , 4 . Cela comprend la recherche de réponses aux questions concernant le mécanisme qui provoque la dépolarisation du potentiel membranaire, le rôle des propriétés membranaires et des canaux ioniques, et même la région dans le neurone qui répond au champ électrique 2 , 5 . Neurostimulation thérapeutique 6 , 7 , 8 , 9 , 10 méthodologies sont particulièrement dépendantes de cette information, ce qui peut être crucial pour cibler les zones affligées et pour comprendre les résultats de la thérapie. Une telle compréhension peut également aider à développer des protocoles de traitement et de nouvelles approches pour la stimulation de différentes zones dans le cerveau.

La mesure de l'interaction dans le cerveau in vivo ajoute une composante importante à cette compréhension, mais elle est entravée par l'imprécision et la faible maîtrise des mesures au sein du crâne. En revanche, les mesures dans les cultures peuvent être facilement réalisées en volume élevé avec une grande précision, une excellente performance signal à bruit et un degré élevé de reproductibilité et de contrôle. En utilisant des cultures, une grande variété de propriétés neuronales du comportement du réseau collectif peut être élucidée 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . De même, on s'attend à ce que ce système bien contrôlé soit très efficace pour élucider le mécanisme par lequel d'autres méthodes de stimulation fonctionnent, par exemple, comment l'ouverture de canal pendant la stimulation optique dans les neurones optogénétiquement actifs 17 , 18 , 19 est responsable de créer un potentiel d'action.

Ici, l'accent est mis sur la description du développement et la compréhension des outils qui peuvent exciter efficacement le neurone via un champ électrique externe. Dans cet article, nous décrivons la préparation de cultures hippocampiques bidimensionnelles et unidimensionnelles à motifs, la stimulation utilisant différentes configurations et l'orientation d'un champ électrique directement appliqué par des électrodes de bain et enfin la stimulation de cultures bidimensionnelles et à motifs unidimensionnels par un Champ magnétique variable dans le temps, qui induit un champ électrique5 , 20 , 21 .

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Protocole

Déclaration d'éthique: les procédures concernant le traitement des animaux ont été effectuées conformément aux directives du Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) de l'Institut Weizmann des sciences, et la loi israélienne appropriée. L'Institut Weizmann est accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation du laboratoire international de protection des animaux (AAALAC). Le Institutional Animal Care Weizmann et utilisation Comité a approuvé cette étude, menée avec les neurones hippocampiques.

1. Préparation de deux dimensions (2D) et unidimensionnels (1D) Cultures hippocampiques

  1. Préparation des cultures pour 2D lamelles.
    1. Préparer le milieu de plaquage (PM), composée de 0,9 ml minimum médias essentiel (MEM) + 3G, 0,05 ml de sérum de veau foetal (FCS), 0,05 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur (HI HS) et 1 pl de complément B27. Remarque: MEM + 3G contient pour chaque 500 ml de MEM x 1, 1 ml de gentamycine, 5 ml de 100x de L-glutamine stabilisée (voir
    2. Préparer du tampon borate composée de 1,9 g de borax (tetraborate de sodium décahydraté) dans 200 ml d'eau bidistillée (DDW) (mélange à 60 ° C) et 1,24 g d'acide borique dans 200 ml de DDW. Titrer la solution finale à un pH de 8,5 en utilisant du HCl 1 M. Remarque: La solution finale est de 400 ml 0,1 M tampon borate.
    3. Immerger des lamelles de verre à 65% d'acide nitrique pendant 2 h. Rinçage trois fois dans DDW, suivi par trois rinçages avec du réactif analytique absolue (ABS AR) dans l'éthanol.
    4. Passer chaque lamelle brièvement à travers la flamme d'un brûleur Bunsen deux ou trois fois pendant 1 - 2 s, et ensuite laisser à incuber pendant une nuit dans des plaques de 24 puits avec 1 ml de poly-L-lysine solution à 0,01% dilué 1: 5 dans du tampon borate ( 0,1 M, pH 8,4). Ensuite , rincez à DDW trois lamelles fois et repartez avec 1 ml par puits PM dans un incubateur standard 37 ° C, 5% de CO 2 pendant la nuit.
  2. Préparation des cultures pour 1D lamelles.
    1. Clean glass lamelles par immersion dans une solution piranha de base constituée de 75 ml DDW, 25 ml 25% de solution d'ammoniac et 25 ml de 30% de peroxyde d'hydrogène. solution de place avec les lamelles de verre sur une plaque chauffante à environ 50 ° C pendant 30 min, puis sécher les lamelles de verre avec de l'azote.
    2. Manteau de lamelles d'abord avec une couche mince de chrome (99,999%) de 6 Å d'épaisseur suivie par une couche de 30 Å d'or (99,999%), en utilisant de la vapeur ou de dépôt par pulvérisation cathodique.
      1. Pour parvenir à une vitesse de pulvérisation de 0,05 à 1 Å / s utiliser une machine de pulvérisation cathodique avec 2 e-faisceaux et un système d'aspiration de 260 l / s avec des tailles de cible 2" et 4" . Utilisez une étape de rotation qui peut aller de 0 - 100 tours par minute (RPM). Utiliser un courant continu (CC) par pulvérisation cathodique puissance de 0 - 750 Watts.
      2. Utiliser une rotation de 30 tours par minute et d'argon 99,999% pour obtenir le plasma à pression 10 mTorr dans la chambre.
      3. Faire fonctionner l'alimentation électrique des pistolets de pulvérisation à 40 W de puissance à courant continu de pulvérisation cathodique pour le chrome, conduisant à ~ 0,12 Taux de couverture s Å / et à 10 W DC par pulvérisation cathodique puissance pour l'or, ce qui conduit à ~ 0,28 Å / s.
    3. Dissoudre 0,1 g de 1-octadécanethiol dans 100 ml d'éthanol ABS AR en utilisant des ultrasons pendant 30 min. Placez les lamelles recouvertes Cr-Au pendant 2 h dans cette solution, puis laver avec de l'éthanol ABS AR et sec avec de l'azote.
    4. Préparer une solution de 100 ml de phosphate de Dulbecco tamponnée saline (D-PBS) et 3,5 g d'un co-polymère tri-séquencé (voir le tableau des Matériaux / réactifs) par agitation pendant 1 - 2 h à 600-700 tours par minute. Placez dans la solution des lamelles pendant 1 h. avec de l'azote sec des lamelles.
    5. Gravure mécanique de la configuration désirée en grattant la couche bio-rejet 22. Pour ce faire, en utilisant un traceur à plume, lorsque le stylo est remplacée par une aiguille de gravure. Gratter le motif à travers les couches de métal pour atteindre le verre sous-jacent. Contrôler ce processus par un ordinateur pour obtenir un motif souhaité répliqué. Motifs formés par ce procédé sont démontrent d sur la figure 2 et la figure 3.
    6. Préparer une couche de bio-compatible de 100 ml de D-PBS, 3,5 g de tri-bloc co-polymère, 35,7 uL / ​​mL de fibronectine et 29 ul / ml de laminine.
      1. Stériliser les lamelles à la lumière ultra-violet pendant au moins 10 min. Incuber dans la nuit des lamelles de solution bio-compatible préparé.
        NOTE: La couche bio-compatible formera que lorsque la couche bio-rejet a été éliminé par attaque à l'étape précédente.
      2. Sur le lavage lendemain deux fois avec des lamelles couvre-P-DBS. Incuber PM dans la nuit des lamelles. Les lamelles couvre sont maintenant prêts pour le placage cellulaire.
  3. Effectuer la dissection selon les procédures standard qui ont été publiées abondamment auparavant 23, 24.
    1. En bref, l' hippocampe extrait ou cortex d'embryons de rat, généralement au jour E19 ou de souris, généralement au jour E17 23,class = "xref"> 24.
    2. Cellules Dissocier première en solution de papaïne pour 20 - 30 min, suivie d' une trituration mécanique 24 avec des pipettes en verre dont les pointes sont polies au feu.
      NOTE: Si les cellules proviennent de souris génétiquement modifiées ensuite le tissu à partir de chaque embryon doit être maintenue dans un tube de 1,5 ml en matière plastique séparée pendant tout le processus.
    3. Compter les cellules avec du bleu trypan avant l'ensemencement.
      NOTE: Pour les animaux génétiquement modifiés le comptage doit être effectué séparément pour chaque embryon.
    4. Pour les cultures 2D, des neurones de souris de semences à 750.000 et les neurones de rat à 850.000 cellules par puits. Pour 1D, des semences à 650.000 cellules par puits. Agiter légèrement la plaque immédiatement après le semis, pour assurer une couverture homogène de la lamelle.
  4. L'entretien des cultures de neurones.
    1. Préparer le milieu changeant (CM), composée de (par ml). 0,9 ml de MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 ul de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR) avec uridine 100x
    2. Préparer moyen final (FM), composée de (par ml): 0,9 ml MEM + 3G et 0,1 ml HI SH.
    3. Remplacer PM avec 1-1,5 ml CM après 4 jours in vitro (DIV). A 6 DIV, remplacer 50% de la CM CM avec frais. A DIV 8, changer le milieu à 1,5 ml FM, suivi d'un changement de 50% de FM tous les 2 jours. Après environ une semaine l'activité synchrone spontanée émerge.
  5. L'imagerie de l'activité spontanée ou évoquée dans les cultures neuronales avec des colorants fluorescents.
    1. Préparer une solution de colorant fluorescent sensible 50 pg de calcium (voir le tableau des Matériaux / réactifs) dans 50 ul de DMSO (diméthylsulfoxyde).
    2. Préparer la solution d'enregistrement extracellulaire (EM) contenant (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, CaCl 2 2, MgCl 2 1, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 le saccharose (pH 7,4).
    3. Incuber la culture neuronale dans 2 mL EM avec 8 ul de la solution de colorant fluorescent sensible au calcium pendant 1 h. Protéger de la lumière et tourner doucement pour assurer homogenDe la teinture aux cellules.
    4. Remplacez la solution par EM frais avant l'imagerie. L'imagerie fluorescente est démontrée à la figure 4 .
    5. Image dans un microscope à fluorescence avec des filtres optiques pour l'imagerie par fluorescence de calcium (pic d'excitation à 488 nm, pic d'émission à 520 nm), en utilisant une caméra et un logiciel capable de quantifier l'intensité de toute région d'intérêt (ROI) dans le champ de vision de Le microscope.

2. Stimulation électrique des cultures

REMARQUE: la configuration de base pour la stimulation électrique est illustrée à la figure 1 . Un slip de couverture sur lequel la culture neuronale a été cultivée pendant environ 14 jours est placé dans une boîte de Pétri sous un microscope à fluorescence. L'activité électrique des neurones est imagée en utilisant des colorants sensibles au calcium alors qu'une tension est appliquée via deux paires d'électrodes de bain qui sont positionnées en dehors de la culture. Les électrodes sont guidées parGénérateur ignal dont la sortie est amplifiée par un amplificateur à deux canaux. Réglage de la tension de stimulation est préférée à la commande de courant plus standard 25, 26 parce que les vecteurs de champ électrique sont déterminés directement, permettant ainsi plus simple vecteur et la combinaison. Cela exige un contrôle minutieux de l'uniformité du champ électrique, qui peut être réalisée sur l'ensemble de l'échantillon pour le cas de contrôle de la tension. Lors de l'utilisation des soins de contrôle de tension doivent être prises pour éviter les boucles de masse et l'homogénéité du champ électrique doit être vérifiée (voir 2.2 ci-dessous).

  1. Pour la stimulation électrique avec un champ électrique homogène en utilisant une paire de fils d'électrodes parallèles.
    1. Utiliser des électrodes en platine d'une épaisseur de l'ordre de 0,005 « » (127 um). Lorsqu'il est utilisé avec les lamelles 13 mm, en sorte que la distance entre les deux électrodes est d'environ 11 mm, et la position de l'électrodes 1 mm au-dessus de la culture.
      NOTE: Pour que le porte-électrode (figures 5A et 6A) utiliser le polytétrafluoroéthylène (PTFE). Percer des trous étroits à travers le PTFE pour insérer les électrodes. Le dispositif doit être supérieure à la solution extracellulaire de sorte que l'extrémité supérieure, où les électrodes sont exposées, ne sera jamais en contact avec la solution. Pour l'isolation, en utilisant de la colle époxy sur une partie des conducteurs d'électrode qui pourraient être exposées.
    2. Utiliser une forme d'impulsion carrée avec 50% de cycle, sans composante de courant continu afin d'éviter l'électrolyse. Varier la durée d'impulsion comprise entre 10 ms et 4 ms pour provoquer une stimulation efficace sans brûler la culture. Assurez -vous que l'amplitude est de l'ordre de ± 22 V (voir la figure 5). L'impulsion carrée peut être observée sur un oscilloscope branché en parallèle aux électrodes.
      REMARQUE: Pour faciliter la programmation de toute forme d' onde souhaitée, utilisez un logiciel d'édition de forme d'onde commerciale (voir la liste des matériaux
  2. Pour tester l'homogénéité de champ utiliser une électrode de sonde. Utilisation d'une grille d'au moins 1 mm x 1 mm pour permettre à la sonde d'être déplacée dans la zone entre les électrodes et mesurer le potentiel électrique.
    1. Mesurer le potentiel électrique. Utilisation figure-protocol-1 pour calculer le champ électrique. Utiliser une des électrodes comme une électrode de référence. Mesurer le champ électrique variant avec des durées d'impulsion comprise entre 100 us à 4 ms (voir la figure 5B un exemple de durée d'impulsion de 100 ms) pour vérifier que le champ est homogène dans la plage de durées de stimulation.
      REMARQUE: voir la figure 5D pour un exemple d'une homogénéité du champ électrique mesuré lorsque la durée d'impulsion est de 1 ms.
  3. Utiliser 2 paires d'électrodes perpendiculaires de bain pour produire des formes de champ électrique plus complexes, etêtre capable d'orienter le champ dans différentes directions (Fig. 6B). Dispositif de 2 paires d'électrodes sera utilisé, et le signal sur chaque paire d'électrodes est observé sur deux oscilloscopes séparés.
    1. Placer les électrodes 1 mm au-dessus de la culture et à une distance de 10 - 11 mm les unes des autres. Assurez-vous que les deux paires d'électrodes sont flottantes (avoir aucune connexion à la terre), et ne possède pas de motif commun en mesurant la résistance entre un ensemble d'électrodes et la vérification de l'absence de courts-circuits entre une quelconque des électrodes. Vérifiez que tout le matériel utilisé, qui est relié aux électrodes (tels que les oscilloscopes, les amplificateurs, les générateurs de signaux, etc.) est flottante par rapport à la masse en vérifiant que tout le matériel est flottant et qu'aucune des électrodes de référence est en contact avec tout équipement mis à la terre.
    2. Pour modifier l'orientation du champ, faire varier l'amplitude de la tension introduite dans les deux paires d'électrodes avec respect à l'autre (voir la figure 7A). Par exemple, pour une utilisation 0 ° ± 22 V sur la paire d'électrodes qui sont perpendiculaires à la configuration et à 0 V pour l'autre électrode. Pour 45 °, utiliser ± 15,6 V sur les deux paires d'électrodes sans décalage de phase, pour une somme d' amplitude de vecteur de 15,6 2 15,6 2 = 22 2.
    3. Pour appliquer un champ tournant à utiliser une seule forme d' onde d'une impulsion de tension sinusoïdale et une seule forme d' onde d'une impulsion de tension de cosinus pour les deux paires d'électrodes pour produire un champ électrique d' amplitude fixe en rotation (voir figure 6B).
      Remarque: Comme on peut le voit sur la figure 6B, en utilisant un cycle d'une onde sinusoïdale avec ± 22 V à une électrode et un cycle d'une onde cosinusoïdale à ± 22 V dans l'autre électrode, la somme vectorielle est un champ électrique tournant avec la durée du cycle même que les ondes sinus et cosinus, et avec une amplitude de ± 22 V.
  4. Pour mesurer et calculer ChronAxie et Rhéobase des axones dans la culture neuronale contre dendrites dans la même culture effectuer les étapes suivantes.
    1. Utilisation d' un colorant fluorescent sensible au calcium pour l' imagerie du calcium , comme décrit dans le tableau des Matériaux / réactifs et 1,5) avec une culture 1D à motifs sur les lignes fines (170 pm), longue (10 mm). colorant sensible au calcium sera appliquée à la culture, et mis en incubation pendant 45 minutes. Le colorant sera lavé par le remplacement d'une solution d'enregistrement frais.
    2. Débranchez le réseau pour obtenir des statistiques de la population de la réponse directe à la stimulation électrique, sans l'effet de la transmission synaptique. Pour ce faire, appliquer une combinaison de 40 pM de bicuculline, qui bloque l'action inhibitrice de l' acide A-gamma-aminobutyrique (GABA A) récepteurs, 10 uM de 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) , pour bloquer l'α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) et les récepteurs kainate et 20 uM de (2R) -amino-5-phosphonovaleacide ric (APV), qui bloque les récepteurs de N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Les bloqueurs seront ajoutés à la solution d'enregistrement.
    3. Appliquer une impulsion carrée comme décrit dans 2.1 et 2.3 avec des durées variables de temps comprise entre 100 ms et 4 ms. Le signal peut être observé sur l'oscilloscope.
    4. Utiliser un microscope à fluorescence avec un programme d'acquisition d'image (voir 1.5) pour contrôler l'intensité des transitoires de calcium à plusieurs régions d'intérêt, contenant chacun quelques centaines de neurones. Acquérir des images à l'aide d'une caméra EMCCD sensibles (voir la liste des matériaux), capables d'un taux d'acquisition d'images d'au moins 20 images par seconde. La variation de l'intensité lumineuse est proportionnelle à la quantité de neurones qui ont été stimulés. Estimer la fraction de neurones stimulées à l'aide de la variation relative de l'intensité.
    5. Pour chaque durée d'impulsion (100 ms à 4 ms), de changer l'amplitude de la tension appliquée aux électrodes à partir d'une tension ou aucun changement d'intensité est considéré (quelques Volts), à la ièmeE tension où les variations d'intensité dues à la tension appliquée sont saturées (jusqu'à ± 22 V).
      NOTE: Le changement d'intensité sera distribué en Gaussian cumulatif 5 par rapport à la tension appliquée pour la stimulation pour chaque durée de l'impulsion de tension.
    6. Ajuster une distribution gaussienne cumulative pour l'intensité par rapport à la tension appliquée pour chaque durée et extraire le moyen gaussien de cet ajustement.
      NOTE: Cette moyenne est la tension représentative à laquelle les neurones ont répondu.
    7. À la fin de ce processus, obtenir pour chaque durée de stimulation une tension moyenne à laquelle les neurones ont répondu. Utilisez ces paires de durées et de forces pour tracer les courbes force-durée (voir la figure 7 ).

3. Stimulation magnétique des cultures

Remarque: La configuration de base pour la stimulation magnétique est illustrée à la Figure 2 . En haut à droite s'afficheUn microscope à fluorescence inversée qui sert à imaginer des colorants sensibles au calcium dans les neurones. La bobine magnétique (cercles bleus) est positionnée d'environ 5 mm concentriquement au-dessus d'une culture de cycle neuronal (contour bleu). Une bobine de ramassage (cercle rouge) sur la circonférence de la boîte de Petri surveille la tension induite par l'impulsion magnétique. En haut à gauche, on montre la dynamique mesurée de la bobine de stimulateur magnétique (MS) avec une charge de tension de condensateur de 5 000 kV, intégrée à partir de la bobine de prélèvement. Le champ électrique induit (calculé pour un rayon annulaire de 14 mm) est représenté en vert alors que le champ magnétique est représenté en bleu. En bas, on retrouve des images de la culture neuronale. Au bas à gauche est une image de champ lumineux d'une lamelle de 24 mm à motifs. Les zones blanches sont les neurones. Le motif photographié se compose de cultures d'anneaux concentriques avec différents rayons. En bas à droite, un zoom sur un court segment des anneaux, montrant des neurones individuels. Pour une échelle, les anneaux 'wide est d'environ 200 um.

  1. Cultiver les neurones dans un profil en anneau de cercle (gravé comme décrit dans 1.2.5) pour la stimulation de la culture 1D. Utilisation d'un colorant fluorescent sensible au calcium pour l'imagerie du calcium (comme décrit dans la section 1.5) avec une culture 1D motif sur des lignes fines (170 pm), de longues (10 mm).
    1. Utiliser une bobine magnétique circulaire et positionner une boîte de Petri à environ 5 mm au-dessous et concentrique à la bobine. Utiliser une bobine bobine personnalisée d'environ 30 mm (diamètre intérieur, diamètre extérieur de 46 mm) avec une inductance de L = 90 mH entraîné par un MS maison ou commerciales chargées avec une tension maximale de 5 kV.
    2. Décharger une haute tension et de courant à travers une bobine conductrice à l'aide d'un interrupteur à haute tension à courant élevé pour stimuler magnétiquement des cultures de neurones. Peut être construit Le stimulateur magnétique (MS) comme décrit dans 21 l' aide de gros condensateurs, de l'ordre de 100 mF, pour obtenir une haute tension de 1 à 5 kV. En variante utiliser un commercialementMS disponible (voir Table des matières / réactifs).
      REMARQUE: utiliser un fil de cuivre rectangulaire large revêtu polyester d' une épaisseur de 6,35 mm et 0,254 mm pour fabriquer une bobine 21 fait maison. Tournez fils sur des cadres sur mesure, isolés avec des fibres de verre et moulé en résine époxy (voir le tableau des Matériaux / réactifs). En variante utiliser des bobines disponibles dans le commerce (voir le tableau des Matériaux / réactifs).
  2. Utiliser des champs magnétiques rotatifs pour stimuler les cultures 2D.
  3. Maintenant, utilisez les champs magnétiques rotatifs pour stimuler les cultures 2D. Feu le TMS sans culture dans le plat, à des intensités différentes, pour montrer la corrélation linéaire de la lecture de la bobine avec les intensités.
  4. Ensuite, lors de l'enregistrement des transitoires de calcium avec une culture neuronale, commencer à tirer le TMS à augmenter l'intensité lors de l'enregistrement les transitoires de calcium et la bobine. Dans un premier temps, des rafales de réseau ont observé que les transitoires de calcium, shoULD ne se synchronise pas avec des pointes ramasser bobine de TMS. Continuer à augmenter l'intensité, à un moment donné, les transitoires de calcium commencent à se synchroniser avec les pointes TMS. En variante, ou en outre, après l'obtention d'une réponse synchronisée, commencer à diminuer l'intensité jusqu'à ce que la synchronisation est supprimée, afin de déterminer le seuil de TMS.
    NOTE: Les conditions doivent être maintenues strictement fixées pour chacune des configurations, en utilisant le volume exact à chaque fois, les mêmes navires et positions de bobine exactes et orientations.
    1. Monter la bobine de détection sur la base de la cuvette d'enregistrement afin qu'elle se trouve dans un plan parallèle à la culture neuronale et dans une position fixe par rapport à la culture.
      NOTE: Cela garantit que la dépendance du positionnement de la bobine de capteur par rapport à l'aimant est fidèle à la position de la culture et que toute divergence dans le positionnement sera négligeable sur les lectures de la bobine de pick-up.
      1. Utiliser deux bobines indépendantes,positionné perpendiculairement à l'autre (figure 8B) pour générer un champ électrique et magnétique induit rotatif. Connectez chaque bobine à ses propres MS. Assurez -vous que les stimulateurs déchargent des courants semblables à un décalage de phase de 90 degrés (figure 10A), ayant pour résultat un champ magnétique rotatif qui balaie 270 degrés de l'espace réel à un champ maximum de ~ 270 V / m (Figure 10B).
      2. Positionner la culture neuronale à l'intérieur d'un récipient en verre sphérique remplie de la solution d'enregistrement externe (EM).
      3. surveiller stimulation (changement d'intensité de fluorescence des neurones) avec l'appareil comme décrit dans l'étape 2.4.4.
      4. Dans le cas des bobines croisées (figure 8B), positionner la bobine de détection et parallèlement à une certaine distance en dessous de la culture des neurones. Maintenir soigneusement cette configuration à travers les expériences.
  5. Calculer analytiquement le champ électrique pour 1D CONFIGURAtion par E max = k 1 Br, dans laquelle E max est l'amplitude maximale du champ électrique induit et est dirigé le long de la tangente des anneaux de rayon r. B est l'amplitude de l'impulsion magnétique et k 1 est une constante de proportionnalité dimensionnelle qui peut être mesurée en utilisant la bobine de détection (Figure 8A).
  6. Utilisez un logiciel de simulation numérique (voir la liste des matériaux) pour simuler numériquement le champ électrique 21.

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Résultats

Le protocole présenté permet un modelage facile des cultures neuronales. Lorsqu'il est combiné avec plusieurs méthodes, nous avons développé pour la stimulation, il permet de mesurer certaines propriétés intrinsèques du neurone telles que Chronaxie et Rheobase 5 , pour comparer les propriétés des neurones sains et malades 27 , pour trouver des moyens optimaux de stimuler les cultures en fonction de Leur structure et beaucoup d'autres approc...

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Discussion

1D motif est un outil important qui peut être utilisé pour une variété d'applications. Par exemple, nous avons utilisé 1D motifs pour créer des portes logiques à partir des cultures de neurones 29 et plus récemment pour mesurer la Chronaxie et Rhéobase des neurones hippocampiques de rat 5, et le ralentissement de la vitesse de propagation du signal d'activité de mise à feu dans les neurones hippocampiques du syndrome de Down par rapport à la type sauvage (WT) neuro...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef et Eitan Reuveny des discussions très utiles. Les auteurs remercient Ilan Breskin et Jordi Soriano pour développer les premières versions de la technologie. Les auteurs remercient Tsvi Tlusty et Jean-Pierre Eckmann aide les concepts théoriques. Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, le Ministère de la Science et de la technologie, Israël et par Israël pour la science subvention 1320-1309 et la science binationale Fondation subvention 2.008.331.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
APVSigma-AldrichA8054Déconnectez le réseau. Mentionné dans la section 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Médium de placage. Mentionné dans la Section 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Déconnecter le réseau. Mentionné à la section 2.4.2
Borax (tétraborate de sodium décahydraté)Sigma-AldrichS9640Tampon au borate. Mentionné à la section 1.1.2
Acide boriqueFrutarom LTD5550710Tampon borate. Mentionné à la section 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka  ;21098Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné dans la Section 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Déconnectez le réseau. Mentionné à la section 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Simulation numérique. Mentionné à la section 3.5.2
D-(+)-glucose, 1 MSigma-Aldrich65146Milieu de placage, solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné dans les sections 1.1.1 et 1.5.2
Cultures cellulaires D-PBSSigma-AldrichD8537. Mentionné dans les sections 1.2.4 et 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Agent de placage. Mentionné dans la section 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141Bio Coating. Mentionné à la section 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Imagerie de l’activité spontanée ou évoquée. Mentionné dans les sections 1.5.1, 1.5.3 et 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Milieu changeant. Mentionné dans la section 1.4.1
GentamycinSigma-AldrichG1272Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné dans la section 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné à la section 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2
HI HSBI04-124-1AMilieu de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné aux sections 1.1.1, 1.4.1 et 1.4.2
KCl,  ; 3 MMerck1049361000Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2
Laminine  ;Sigma-AldrichL2020Bio Coating. Mentionné dans la section 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Médium de placage, Milieu changeant, Milieu final. Mentionné à l’article 1.4.1   ;   ; 1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné dans la section 1.5.2
OctadécanéthiolSigma-Aldrich01858Nettoyage des lamelles enrobées de Cr-Au (cultures 1D). Mentionné à la section 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation  ;50475278Revêtement de bio-réjection, revêtement biologique. Mentionné dans les rubriques 1.2.4 et 1.2.6
Solution de poly-L-lysine à 0,01 %.Sigma-Aldrich  ; P47075Favorise la division cellulaire. Mentionné à la section 1.1.4
Saccharose, 1 MSigma-AldrichS1888Solution d’enregistrement extracellulaire. Mentionné à la section 1.5.2
Thiol  ;Sigma-Aldrich1858. Mentionné dans la Section 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Milieu changeant. Mentionné à la section 1.4.1
Machine de pulvérisation AJAInternational, IncATC Orion-5Series  ;revêtement du verre avec de fines couches de métal. Mentionné dans la section 1.2.2
Traceur de styloHewlett Packard  ;HP 7475AGravure du motif sur la lamelle revêtue. Mentionné à la section 1.2.5
Fils d’électrodes  ;A-M Systems, Carlsborg WA767000Stimulation électrique de cultures neuronales. Mentionné aux sections 2.1, 2.2, 2.3 et 2.4.5
Générateur de signauxBKPrecision4079Mise en forme du signal électrique. Mentionné dans la section 2.3
AmplificateurmaisonAmplification de tension du signal du générateur de signaux vers les électrodes. Mentionné dans la section 2.3
Matrice d’alimentation  ;MPS-3005 LK-3  ;Alimentation de la machine à pulvériser. Mentionné dans la section 1.2.2.3
Stimulation magnétique transcrânienneMagstim, Spring Gardens, Royaume-UniRapid 2Stimulation magnétique de la culture neuronale. Mentionné dans les sections 3.1, 3.3 et 3.4
EpoxyCognisVersamid 140Coulée de bobines faites maison. Mentionné dans la section 3.4
Coque époxyEPON 815  ;Coulée de bobines faites maison. Mentionné à la section 3.4
Fils de platine 0,005'' d’épaisseur ; Systèmes A-M,  ;  ; Carlsborg WA&nbsp ; 767000Stimulation électrique de cultures neuronales. Mentionné dans la section 2.1
Bobine magnétique circulaireStimulation magnétique maisonde la culture neuronale. Mentionné à la section 3.3
WaveXpress SWB& K Précision  ;Logiciel d’édition de formes d’onde. Mentionné dans la Section 2.1.32
Xion Ultra 897AndorSensitive. Mentionné à la section 2.4.4
Revêtement de bio-réjection Caméra EMCCD

Références

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