Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

Résumé

L’ingénierie et l’analyse des tissus porteurs avec des populations cellulaires hétérogènes restent un défi. Ici, nous décrivons une méthode pour créer des disques d’hydrogel d’alginate bicouches comme plate-forme pour la co-culture de diverses populations cellulaires au sein d’une seule construction.

Résumé

De nombreux tissus porteurs possèdent des régions structurellement et fonctionnellement distinctes, généralement accompagnées de différents phénotypes cellulaires avec des caractéristiques de mécanodétection différentielles. L’ingénierie et l’analyse de ces types de tissus restent un défi. Les constructions d’hydrogel en couches offrent la possibilité d’étudier les interactions entre plusieurs populations cellulaires au sein de constructions uniques. Les hydrogels d’alginate sont à la fois biocompatibles et permettent d’isoler facilement les cellules après l’expérimentation. Ici, nous décrivons une méthode pour le développement de disques d’hydrogel d’alginate à double couche de petite taille. Ce processus maintient une viabilité cellulaire élevée des cellules souches mésenchymateuses humaines pendant le processus de formation et ces disques stratifiés peuvent résister à la compression cyclique non confinée, couramment utilisée pour la stimulation des CSMh en cours de chondrogenèse. Ces constructions en couches peuvent potentiellement être mises à l’échelle pour inclure des niveaux supplémentaires, et également être utilisées pour séparer les populations cellulaires initialement après la superposition. Cette plate-forme de culture d’hydrogel d’alginate à double couche peut être utilisée pour de nombreuses applications différentes, notamment l’ingénierie et l’analyse de cellules de tissus porteurs et les co-cultures d’autres types de cellules.

Introduction

tissus porteurs de charge de compression tels que le cartilage articulaire ou les disques intervertébraux sont constitués de régions de tissus hétérogènes qui sont essentiels à la fois pour fonction biomécanique et mécano-transduction appropriée dans le tissu. Non seulement est l'organisation cellulaire et la fonction distincte dans différentes régions, mais les matrices extracellulaires (ECM) sont également variés dans la composition et de l'organisation. Par exemple, le cartilage articulaire est constituée de trois zones principales variant avec la morphologie cellulaire, la fonction mécanique, et l'ECM. Les différences dans leur ECM conduisent à une di....

Protocole

1. Préparation pour la formation de disques alginate

1. Préparer une 4% (p / v) de solution d'alginate dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans chlorure 1x ajouté de calcium ou le chlorure de magnésium et le placer dans un bain-marie à 37 °. Les concentrations de la solution d'alginate peuvent varier, mais de 1 à 4% (p / v) de solution d'alginate sont recommandées.
2. Mélanger la solution d'alginate dans un rapport de 1: 1 avec la base de milieux de culture cellulaire chaud (par exemple, milieu de Eagle modifié par Dulbecco.) Pour le type cellulaire souhaité. La concentration de l' alginate est maint....

Résultats

La figure 1 représente la formation et la stratification des hydrogels d'alginate. Complété gels bi-couches présentent une première séparation complète des populations de cellules comme le montre la figure 2. La viabilité cellulaire des cellules souches mésenchymateuses humaines) incorporés dans ces hydrogels et des couches reste élevée et comparable à celle des hydrogels en vrac comme le montre la figure 3. La viabilité a été évalué.......

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole pour la formation de disques d'hydrogel d' alginate pour l' étude des couches co-cultures de populations cellulaires multiples, tels que ceux dans les tissus physiologiquement stratifiés, par exemple, le cartilage. des structures en couches, telles que la plate-forme de culture décrit, peuvent être utilisés pour examiner l'interaction entre les deux populations cellulaires distinctes soumises au même milieu de culture ou sous charge.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sel de sodium d’acide alginique	Sigma Aldrich	A1112	Solution fabriquée en % en poids à l’aide de DPBS (-/-)
1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (-/-)	Gibco Life Technologies  ;	14190
1x Dulbecco’s Phosphate Tamponné Saline (+/+)	Gibco Life Technologies  ;	14190
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies  ;	11965	Exemple. Utilisez les filtres à seringue de type moyen souhaité
(0,02 μ ; m Nylon)	FisherBrand	0979C
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Bioréactifs	BP510	Préparer la solution dans de l’eau stérile
Critère Blotter Papier filtre	Biorad	1704085	Couper à la taille des plaques d’extrémité pour la formation de moisissures Membrane de
microtamis cellulaire (10 μ ; taille des pores)	Biodesign Inc de New York	N10R	Couper à la taille des plaques d’extrémité pour la formation de moisissures
Citrate de sodium dihydraté	FisherScience	S93364
Acide éthylènediaminetétraacétique sel tétrasodique dihydraté (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Sérum de veau fœtal  ;	Gibco Life Technologies  ;	26140	Utilisé dans l’exemple : milieu de croissance basale de cellules souches mésenchymateuses
péniciline/streptomycine (10 000 U/ml)	Gibco Life Technologies  ;	15140	Utilisé dans l’exemple : milieu de croissance basale des cellules souches mésenchymateuses
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies  ;	25030081	Utilisé par exemple : Cellules souches mésenchymateuses : milieux de croissance basale
Acides aminés non essentiels (100x)	Gibco Life Technologies  ;	11140050	Utilisé par exemple : milieu de croissance basale de cellules souches mésenchymateuses