Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

Summary

Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d'une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.

Abstract

La peau est essentielle pour notre survie. La couche externe est constituée de l'épiderme de l'épiderme interfolliculaire, qui est un épithélium pavimenteux stratifié qui couvre la majeure partie de notre corps, et les phanères comme les follicules pileux et des glandes sudoripares. L'épiderme subit la régénération pendant toute la vie et en réponse à une blessure. Ceci est activé par K14 exprimant des populations souches / cellules progénitrices épidermiques basales qui sont étroitement régulés par des mécanismes de régulation multiples actifs dans l'épiderme et entre l'épiderme et le derme. Cet article décrit une méthode simple pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine K14, Ki67 étiquetés cellules proliférantes, rouge Nil étiqueté sébocytes, et l'étiquetage nucléaire DAPI à la résolution de la cellule unique en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise et la quantification de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Le protocole CUBIC est ee meilleure méthode disponible à ce jour pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires en pleine épaisseur biopsies de la peau à la résolution d'une seule cellule.

Introduction

La peau est essentielle pour notre survie. Il se compose de trois couches principales de l'épiderme les extérieurs, le derme et l'hypoderme. L'épiderme est un tissu très régénérative. Il est un épithélium pavimenteux stratifié, composé principalement de kératinocytes. Les kératinocytes sont nés dans la couche basale, et se déplacent vers le haut à travers les couches suprabasales tout en différenciant, et finalement ils tombent dans la couche externe cornified environ un mois après leur naissance. L'épiderme se développe un certain nombre d'appendices, y compris les follicules pileux et des glandes sébacées. Les follicules pileux se régénèrent également de façon cyclique tout au long de la vie ^1. La capacité de régénération de l'épiderme est activé par la présence de cellules souches et progénitrices qui sont situés dans la couche basale de l'épiderme interfolliculaire des follicules pileux et ^2.

De nombreuses voies de signalisation ont été impliquées dans le développement et la régénération de l'épiderme. Certaines d'entre elles se produisent à l'intérieurseulement l'épiderme, telles que la voie Hedgehog. D' autres événements de signalisation ont lieu entre le derme et l' épiderme ^3. Par exemple, les signaux Wnt du derme sont considérées comme importantes pour le développement des follicules pileux, et ils sont sécrétés par la papille dermique au début de la phase anagène pour activer le follicule pileux gonflement souches / progénitrices la prolifération cellulaire et la croissance des follicules pileux ^4. Il est important de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le développement de l'épiderme et de la régénération afin de mieux comprendre comment ils peuvent être perturbés dans les maladies régénératrice de la peau telles que le cancer de la peau.

Cet article décrit un lear C, U nobstructed B pluie I cocktails forgemagie et C analyse omputational (CUBIC) protocole ^5-7 pour clarifier les préparatifs de la peau de montage entières, et de visualiser les profils d'expression des protéines dans les 3 dimensions à la résolution d'une seule cellule par microscopie confocale. La méthode CUBIC implique l'immersion de la peautissu en deux cocktails chimiques à base de aminoalcools. Ces solutions ajuster les indices de réfraction de l'échantillon de peau, en laissant le tissu transparent et les protéines intactes, ce qui permet immunodétection à une résolution à une seule cellule.

En utilisant ce protocole CUBIQUE, la base et la prolifération des populations de kératinocytes dans l'épiderme interfolliculaire et dans les follicules pileux ont été imagées en totalité des biopsies de peau d'épaisseur des souris de type sauvage en utilisant l'anti-Keratin14 (K14) et des anticorps anti-Ki67. Les glandes sébacées dans les biopsies de la peau de type sauvage ont également été visualisés en utilisant du Nil Rouge coloration. Enfin, les populations de kératinocytes basaux de type sauvage et hyperplasiques biopsies cutanées YAP2-5SA-Ac ⁸ ont été comparés.

Ce protocole CUBIC permet une évaluation visuelle de l'expression des protéines dans leur intégralité des biopsies de peau d'épaisseur à la résolution d'une seule cellule, et est un outil important pour apprécier l'anatomie épidermique et défauts morphologiques dans la peau d'organismes génétiquement modifiéssouris, et d'enquêter sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le développement de l'épiderme et de la régénération.

Protocol

Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des sujets animaux suivent les directives du Comité des soins aux animaux et de l'éthique (ACEC) à UNSW Australie sous protocole approuvé AFIC 13 / 64B.

1. Préparation du tissu transparent de la peau de la souris

Remarque: Toutes les souris utilisées dans cette étude étaient sur une C57BL / 6 de fond génétique

1. Collection de tissus de la peau de la souris.
   1. Humainement euthanasier les souris par dislocation cervicale.
   2. Retirez délicatement les poils de la zone de la peau concernée avec une coupe en prenant soin de ne pas blesser la peau.
   3. Laver la peau à décontaminer avec de l'éthanol à 70% en tampon phosphate salin (PBS).
   4. Soulevez la peau du cou dorsale avec une pince et de faire l'incision avec des ciseaux.
   5. Disséquer une grande surface de la peau dorsale de souris (environ 1,5 x 4 cm).
   6. Aplatir la peau derme vers le bas sur un papier filtre, et prendre note de l'orientation antérieure-postérieure de l'échantillon.
   7. Tripapier m de filtre autour de la peau disséquée, et placer dans un tube de 15 ml rempli de 4% fraîchement préparé paraformaldéhyde (PFA) solution dans PBS.
   8. Fixer pendant 1 h à température ambiante, ou une nuit au réfrigérateur à 4 ° C.
   9. Laver la peau 2 x 5 min dans du PBS dans un tube de 15 ml.
      Note: Ce qui suit (1.1.10 - 1.1.12) sont des étapes facultatives pour le stockage à long terme des tissus.
   10. Déshydrater la peau disséqués dans du PBS avec une concentration croissante d'éthanol (25%, 50% à 70%) dans un tube de 15 ml pendant 1 h sur des étapes de lavage à la température ambiante.
   11. Stocker les peaux déshydratées dans de l'éthanol à 70% dans du PBS dans un tube de 15 ml à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
   12. 4 heures avant le dégagement, réhydrater le tissu cutané dans du PBS avec une concentration décroissante de l'éthanol (70%, 50%, 25%, 0%) dans un tube de 15 ml pendant 1 h sur des étapes de lavage à la température ambiante.
2. Effacement des biopsies de la peau de la souris
   1. Préparer la solution CUBIC1 de compensation en dissolvant 3,85 g d' urée et 3,85 g de N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) éthylènediamine dans 5,38 ml d'eau distillée sur un appareil de chauffage réglé à 60 - 70 ° C. Utiliser un agitateur à chaud.
   2. Ajouter 2,31 g de polyéthylène glycol éther mono-p-isooctylphényle / Triton X-100 à la solution une fois qu'il est clair et a refroidi à température ambiante.
   3. Couper la peau de la souris avec une lame de rasoir dans des biopsies de dimensions approximatives de 0,2 x 0,5 cm, et plonger dans 5 ml de solution CUBIC1 de compensation dans un tube de 15 ml. Afin d'optimiser la visualisation des follicules pileux, en sorte que le côté le plus long de la biopsie est découpée le long de la direction de l'échantillon antéro-postérieur.
   4. Placer sur une plate-forme tournante dans un four d'hybridation à 37 ° C.
   5. Changer la solution de compensation après 7 jours. Préparer la solution de CUBIC1 frais avant utilisation.
   6. Vérifier la transparence du tissu après 7 jours. Si nécessaire, laisser des biopsies en solution de compensation CUBIC1 jusqu'à ce que le tissu est complètement transparent.
   7. Une fois que la biopsie de la peau est transparente,retirer la solution de CUBIC1, et ajouter 4 ml de 1 x PBS pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures à 37 ° C.
   8. Laver le tissu cutané à 20% p / v de saccharose dans du PBS dans un tube de 15 ml pendant 4 heures à 37 ° C.
   9. Congeler le tissu en milieu de montage optimal Cutting Temperature (OCT) Le composé dans un tube de 15 ml pendant une nuit dans un congélateur à -80 ° C.
      Remarque: Cette étape va augmenter la perméabilité de la biopsie pour la pénétration d'anticorps dans les étapes suivantes.

2. immunofluorescence

1. Décongeler les tissus de 1.2.9) à la température ambiante pendant 2 - 3 h.
2. un tissu de lavage dans le tube de 15 ml avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à la température ambiante pour éliminer le composé octobre.
3. Des biopsies de transfert à un tube de 2 ml, et on incube le tissu dans 1 ml de lapin anti-Keratin14 lapin ou un anticorps anti-Ki67, tous deux dilués 1: 100 dans PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) pendant 3 jours sur un agitateur dans une 37 ° C four.
4. biopsies de transfert à un tube de 15 ml, une laver le tissu 4 fois pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un agitateur dans un four à 37 °.
5. biopsies de transfert à un tube de 2 ml, ajouter 1 ml anti-lapin Alexa594 anticorps secondaire dilué à 1: 100 dans du PBST et incuber 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °.
6. Des biopsies de transfert à un tube de 15 ml et on lave 4 fois les tissus pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un agitateur dans un four à 37 °.
7. biopsies de transfert à un tube de 2 ml, ajouter 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution nucléaire de contraste (1: 1000) dans PBST et incuber pendant la nuit sur un agitateur dans un four à 37 °.
8. Enlever la solution de DAPI contre-coloration et ajouter 1 ml de PBST au tube de 2 ml pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures sur un agitateur dans un four à 37 °.
   Remarque: L'étape facultative: Biopsies peuvent être stockés dans l'obscurité 1x PBS avec l'azoture de sodium à 0,02% pendant au moins 3 semaines.

3. Rouge Nil Staining

1. Dissoudre la poudre rouge Nil dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 1 mg / ml
2. Ajouter 1 pi de solution de rouge Nil à 1 ml de PBS à une concentration finale de 1 pg / ml.
3. tissu Thaw de 1.2.9) à la température ambiante pendant 2 - 3 h, et laver avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à la température ambiante.
4. Transférer les biopsies à un tube de 2 ml et immerger le tissu dans 1 ml de solution de coloration rouge Nil pendant 2,5 heures à la température ambiante.
5. Laver les biopsies de peau dans le tube de 2 ml avec 1 ml de PBST 4 fois pendant 30 min à température ambiante.
6. Enlever la solution de PBST du tube de 2 ml, ajouter 1 ml de solution DAPI nucléaire de contre-coloration (1: 1000) dans PBST et incuber une nuit à température ambiante.
7. Enlever la solution de DAPI contre-coloration, et ajoutez 1 ml de PBST dans le tube de 2 ml pour laver le tissu de la peau 4 fois pendant 6 heures à la température ambiante.
   Remarque: L'étape facultative: Biopsies peuvent être stockés dans l'obscurité 1x PBS avec l'azoture de sodium à 0,02% pendant au moins 3 semaines.

4. Imaging

1. Préparer la solution CUBIC2 de compensation, qui contient 50% (P / v) de saccharose, 25% (p / v) d'urée, 10% (p / v) de 2,2 ', 2' '- Nitrilotriéthanol et 0,1% (v / v) de Triton X-100.
2. Laisser incuber le tissu cutané dans 1 ml de solution CUBIC2 dans un tube de 2 ml sur un agitateur pendant 24 heures dans un four à 37 ° C. Cette étape sera même l'indice de réfraction du tissu.
3. Vérifier la limpidité du tissu. Une fois qu'il est clair, placer l'ensemble de la biopsie cutanée (0,2 x 0,5 cm) sur son côté le plus long sur une lamelle de verre, de telle sorte que la direction de la longueur des follicules pileux est parallèle à la surface de la lamelle couvre-objet (# 1 24 x 60 mm)
   Note: Etape facultative: biopsies Antibody-colorées peuvent être stockés dans une solution de CUBIC2 pendant environ 7 jours. biopsies du Nil Rouge tachés ne peuvent être stockés dans une solution CUBIC2 jusqu'à 1 jour, et devraient être imagés dès que possible.
4. Préparer chambre d'imagerie (Figure 1)
   Remarque: Consommables nécessaires à la préparation de la chambre d'imagerie sont: tack bleu, pâte à modeler ou similaire, et 2 lamelles (24 x 50 mm) (Figure 1A).
   1. Préparer deux bandes minces de tack bleu (diamètre d' environ 1 mm x 2 cm), et deux lamelles (figure 1B).
   2. Placez des bandes collantes bleues sur un feuillet de couverture, en laissant suffisamment d' espace pour une biopsie de la peau (figure 1C). 4.4.3)
   3. Placer une biopsie de la peau entre les bandes sur la lamelle dans une goutte de solution CUBIC2 (figure 1C).
   4. Couvrir la biopsie de la peau avec la deuxième lamelle (figure 1D).
5. Placez la chambre d'imagerie avec la biopsie de la peau montée sur la scène d'un microscope confocal et déplacer le tissu dans la voie de la lumière.
6. Balayez l'échantillon en utilisant une source de lumière au mercure ou un halogène et les filtres à épifluorescence standards (par exemple, DAPI / GFP / CY3 / CY5) pour identifier les régions colorées par fluorescence d'intérêt.
7. Régions de l' image d'intérêt en utilisant un objectif 10X et 20X (NA 0,75) et des techniques d'imagerie de fluorescence confocale standards (par exemple., Avec DAéchantillons PI teinté éclairent avec un laser de 405 nm et de recueillir le signal de fluorescence entre 425-475 nm, et avec Alexa Fluor 594 ou des échantillons du Nil rouge-colorés illuminent avec un laser 561 nm et de recueillir le signal de fluorescence entre 570-620 nm).
8. Générer l' image Z-piles de chaque région d'intérêt en utilisant Z-stack logiciel d'acquisition d'images de microscope (par exemple., En utilisant des éléments NIS logiciel d' imagerie 4.13 comme décrit ci - dessous).
   1. Assurer la puissance laser optimale et PMT HV / Offset paramètres ont été sélectionnés pour collecter la fluorescence de l'échantillon.
   2. Ouvrez la barre d'outils "ND Acquisition" de "Contrôles d'acquisition".
   3. Sélectionnez l'onglet "Z Setup série" (assurer que tous les autres onglets sont désélectionnée).
   4. Lors de la numérisation en direct, se concentrer sur le haut de l'échantillon et appuyez sur la touche "Haut".
   5. Concentrez au fond de l'échantillon et appuyez sur le bouton "Bas".
   6. Taille d'entrée requise de l'étape (ou appuyez optimisé étape bouton taille).
   7. Préss le bouton "maintenant Run".
   8. Enregistrer Z-piles résultantes comme Tiff individuelle piles d'images (1 fluorochrome par image Z-stack).
9. Utilisez l' image Z-piles pour reconstruire les régions de volume 3D d'intérêt en utilisant un logiciel d'analyse 3D (par exemple., En utilisant Imaris x64 7.2.3 , comme décrit ci - dessous).
   1. Démarrez le logiciel d'analyse.
   2. Choisissez le bouton "Surpass" dans la barre d'outils pour la production de volume 3D.
   3. Ouvrir la première image couleur Z-stack (ex., DAPI).
   4. Utilisez l'outil 'ajouter la chaîne' pour ajouter des canaux de couleurs supplémentaires, un canal par fluorochrome. Ainsi, un échantillon contenant à la fois DAPI et Alexa Fluor 594 fluorochromes aura besoin de deux canaux.
   5. Utilisez l'outil "Propriétés de l'image" pour régler correctement pixel (voxel) dimensions (XYZ), tel que déterminé à 4.7 ci-dessus.
   6. Utiliser l' outil "de réglage de l' affichage" pour changer les couleurs de canal selon les besoins (par exemple, régler le canal DAPI au bleu, Alexa Fluor 594 canal rouge).
   7. Pour poSITION le volume 3D dans la fenêtre d'image, utilisez la souris d'ordinateur pour cliquer et faire glisser le volume au besoin.
   8. Utilisez l'outil "Snapshot" dans la barre d'outils pour générer des captures d'écran de l'image 3D.
   9. Utilisez l'outil "Animation" dans la barre d'outils pour générer des films de 3D rotation de l'échantillon.

Results

Épaisseur dorsale entière des biopsies de peau de souris adultes de type sauvage ont été clarifiées, colorées avec un anticorps se liant marqueur kératinocytaire de base Keratin14 (K14) , un anticorps, et les noyaux ont été contre -colorées avec une solution de coloration DAPI (Figure 2 et le film 1).

Les noyaux DAPI positifs étaient visibles à travers l'échantillon (figure 2A, C) et K14 coloration était visible exclusivement dans la couche ...

Discussion

Les mécanismes de régulation contrôlant le développement de la peau et de l'homéostasie sont le plus souvent étudiées en 2D à l'aide de sectionnement des tissus et une coloration histologique ou marquage avec des anticorps, ce qui permet seulement une reconnaissance restreinte de la morphologie de la peau, des populations de cellules ou de l'expression de la protéine. Un certain nombre de méthodes ont été développées pour améliorer la visualisation de l'organisation spatiale des cellules et des protéines...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich  ;	P6418
Éthanol à 96 % (non dénaturé)	Chem-supply	UN1170
Nile Red	Sigma-Aldrich  ;	72485-100MG
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -tétrakis (2-hydroxypropyl)éthylènediamine	Merck Millipore	821940
Polyéthylène glycol mono-p-isooctylphényléther	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Saccharose	Sigma-Aldrich  ;	S0389
Température de coupe optimale (OCT) Composé	Tissue-Tek	4583
anticorps anti-kératine14	Covance	PRB-155P
anticorps anti-Ki67  ;	Abcam	ab16667
Âne anti-lapin Alexa 594	Life Technologies	A21207
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich  ;	D2650
Urée	Merck Millipore	66612
2,2&prime ;,2&prime ; '-nitrilotriéthanol	Merck Millipore	137002
Microscope confocal	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Microscope
cruZer6 Tondeuse pour le visage	Braun	Braun cruZer6 Azoture
	Sigma-Aldrich  ;