Article de méthode

Le concept Terroir Interprété par Grape Berry métabolomique et transcriptomique

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DOI :

10.3791/54410

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5 octobre 2016

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1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l'application de la métabolomique untargeted, transcriptomique et analyse statistique multivariée à raisin transcriptions de baies et de métabolites, afin de mieux comprendre le concept de terroir, à savoir, l'impact de l'environnement sur les caractéristiques de qualité des baies.

Résumé

Terroir se réfère à la combinaison de facteurs environnementaux qui influent sur les caractéristiques des cultures telles que la vigne (Vitis vinifera) selon des habitats particuliers et les pratiques de gestion. Cet article montre comment certaines signatures du terroir peuvent être détectés dans le métabolome de baies et de transcriptome du Corvina vigne cultivar en utilisant une analyse statistique multivariée. La méthode nécessite d'abord un plan d'échantillonnage approprié. Dans cette étude de cas, un clone spécifique du cultivar Corvina a été choisi pour minimiser les différences génétiques, et des échantillons ont été prélevés dans sept vignobles représentant trois macro-zones différentes au cours de trois saisons de croissance différents. Une LC-MS approche untargeted métabolomique est recommandé en raison de sa sensibilité élevée, accompagnée d'un traitement efficace des données en utilisant un logiciel MZmine et une stratégie d'identification des métabolites basée sur l'analyse de l'arbre de la fragmentation. l'analyse du transcriptome global peut être réalisé en utilisant microarraysLes sondes contenant couvrant ~ 99% de tous les gènes de la vigne prédites, ce qui permet l'analyse simultanée de tous les gènes exprimés de manière différentielle dans le contexte des différents terroirs. Enfin, l'analyse des données multidimensionnelles sur la base de méthodes de projection peut être utilisé pour surmonter l'effet fort spécifiques vintage, permettant aux métabolomique et les données de transcriptomique à être intégrées et analysées en détail pour identifier les corrélations informatives.

Introduction

l'analyse de données à grande échelle basée sur les génomes, transcriptome, protéome et métabolomes de plantes fournit un aperçu sans précédent dans le comportement de systèmes complexes, tels que les caractéristiques du terroir de vin qui reflètent les interactions entre les plantes de la vigne et de leur environnement. Parce que le terroir d'un vin peut être distinct même lorsque des clones de vigne identiques sont cultivées dans différents vignobles, l'analyse génomique est de peu d'utilité parce que les génomes clonales sont identiques. Au lieu de cela, il est nécessaire d'examiner les corrélations entre l'expression génique et les propriétés métaboliques des baies, qui déterminent les caractéristiques de qualité du vin. L'analyse de l'expression des gènes au niveau des transcriptome bénéficie des propriétés chimiques similaires de tous les relevés de notes, ce qui facilite l'analyse quantitative en exploitant des caractéristiques universelles telles que l'hybridation à des sondes immobilisées sur des microréseaux. En revanche, les méthodes d'analyse universelles en protéomique unend métabolomique sont plus difficiles en raison de la grande diversité physique et chimique des protéines et des métabolites individuels. Dans le cas de la métabolomique cette diversité est encore plus extrême parce que les métabolites individuels diffèrent considérablement en taille, la polarité, l'abondance et la volatilité, donc pas de processus d'extraction unique ou méthode analytique offre une approche holistique.

Parmi les plates-formes d'analyse appropriées pour les métabolites non volatils, ceux basés sur la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS) sont beaucoup plus sensibles que des alternatives telles que HPLC avec ultraviolets ou diodes détecteurs matriciels (HPLC-UV, HPLC-DAD ) ou par résonance magnétique nucléaire (RMN), mais une analyse quantitative par HPLC-MS peut être influencée par des phénomènes tels que l'effet de la matrice et la suppression d'ions / amélioration 1-3. L'enquête de ces effets lors de l'analyse des Corvina baies de raisin par HPLC-MS en utilisant une source d'ionisation électrospray (HPLC-ESI-MS), a montré que les sucres et d'autres molécules avec des temps les plus faibles de rétention ont été fortement sous-déclarées, reflétant probablement aussi le grand nombre de molécules dans cette zone, et que l'abondance d'autres molécules pourrait être sous-estimée, surestimée ou non affecté par l'effet de la matrice , mais la normalisation des données pour l'effet de la matrice semblait avoir un impact limité sur le résultat de 4,5 globale. Le procédé décrit ici est optimisée pour l'analyse des métabolites à moyen polarité qui accumulent à des niveaux élevés dans les baies de raisin pendant la maturation, et qui sont fortement touchée par le terroir. Ils comprennent anthocyanes, flavonols, flavan-3-ols, procyanidines, d'autres flavonoïdes, le resvératrol, les stilbènes, les acides hydroxycinnamiques et les acides hydroxybenzoïques, qui déterminent ensemble la couleur, le goût et les propriétés liées à la santé des vins. D'autres métabolites, tels que les sucres et les acides organiques aliphatiques, sont ignorées parce que la quantification par CLHP-SM est peu fiable en raison de la matrice effect et la suppression d'ions phénomènes 5. Dans la gamme de polarité sélectionnée par cette méthode, l'approche est untargeted en ce qu'il vise à détecter autant de métabolites différents que possible 6.

Méthodes de transcriptomique permettant des milliers de transcriptions de la vigne à surveiller simultanément sont facilitées par la disponibilité de la séquence du génome de la vigne complète 7,8. méthodes de transcriptomique précoces basées sur séquençage à haut débit d'ADNc ont évolué avec l'avènement du séquençage de nouvelle génération dans une collection de procédures collectivement décrites comme la technologie de l'ARN-Seq. Cette approche est en train de devenir la méthode de choix pour les études de transcriptomique. Cependant, un grand corps de la littérature sur la base de microréseaux, qui permettent à des milliers de transcriptions à quantifier en parallèle par hybridation, a accumulé pour la vigne. En effet, avant l'ARN-Seq est devenue une technologie grand public, de nombreuses plates-formes dédiées microarray commerciales avaient étédéveloppé permettant la vigne transcriptome à inspecter en détail. Parmi la grande variété de plates - formes, deux seulement permis l' analyse du transcriptome génome entier 9. La gamme la plus évolué a permis à l'hybridation de jusqu'à 12 échantillons indépendants sur un seul appareil, réduisant ainsi les coûts de chaque expérience. Les 12 sous-réseaux constitués chacun 135.000 sondes 60-mères représentant 29,549 transcrits de la vigne. Ce dispositif a été utilisé dans un grand nombre d'études 10-24. Ces deux plates - formes ont été abandonnées , mais un nouveau microréseau personnalisé a été récemment conçu et représente un développement plus récent , car il contient un plus grand nombre de sondes représentant des gènes de la vigne nouvellement découverts supplémentaires 25.

Les ensembles de données de grande vente produites par la transcriptomique et la métabolomique analyse nécessitent des méthodes statistiques appropriées pour l'analyse des données, y compris des techniques multivariées pour déterminer les corrélations entre forme différentes de données. Les techniques multivariées les plus utilisées sont celles basées sur la projection, et ceux - ci peuvent être sans surveillance, comme analyse en composantes principales (ACP), ou supervisé, comme projection orthogonale bidirectionnel à des structures latentes analyse discriminante (O2PLS-DA) 26. Le protocole présenté dans cet article utilise PCA pour l'analyse exploratoire des données et O2PLS-DA pour identifier les différences entre les groupes d'échantillons.

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Protocole

1. choisir le matériel approprié et construire un plan d'échantillonnage

  1. Commencez l'expérience en élaborant un plan d'échantillonnage approprié. Il n'y a pas d'approche générique et universel afin d'évaluer chaque plan au cas par cas. Veiller à ce que le plan d'échantillonnage indique les lieux d'échantillonnage, les heures et la procédure d'échantillonnage précis. Voir la figure 1 pour le plan d'échantillonnage utilisé dans cette étude de cas.
    NOTE: Dans cette étude de cas, les baies de raisin à partir d' un seul clone (. Vitis vinifera cv Corvina, clone 48) ont été recueillies à partir de sept vignobles commerciaux dans trois macro-zones différentes dans la province de Vérone (Lac de Garde, Valpolicella et Soave). Les principales caractéristiques de chaque vignoble sont résumés dans le tableau 1. Les baies ont été recueillies au cours de trois saisons de croissance (2006, 2007, et 2008) à trois points de temps, correspondant à la véraison (le début de la maturation), à mi-maturation et baies mûres.
    1. Pour chacune des adhésions (vineyard / an / phase de maturation), récolte 30 grappes de différentes positions le long de deux rangs de vigne, avec des hauteurs et des emplacements sur la plante randomisées.
    2. Sélectionnez trois baies au hasard dans chaque grappe, en évitant ceux avec des dommages visibles et / ou des signes d'infection.
    3. Répétez les étapes 1.1.1 et 1.1.2 pour obtenir trois piscines indépendants.
    4. Épépiner les baies et geler immédiatement le péricarpe dans de l'azote liquide.
    5. Crush 10 baies congelées de chaque poule avec un moulin à moulin automatique, et de diviser chaque échantillon en poudre en deux parties égales, l'une pour l'analyse de la transcriptomique et un pour l'analyse de la métabolomique.
    6. Stocker les poudres à -80 ° C.
UN M BA BM CS FA MN PM
Macro-zone Soave lac de Garde Valpolicella lac de Garde Valpolicella Valpolicella Soave
Hauteur (m) 250 120 450 100 130 250 130
Rootstock 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
Direction de Row EW NS EW EW EW NS NS
Système de formation Système Overhead (Pergola) Système Overhead (Pergola) Tirer Vertical Positionnement (Guyot) Système Overhead (Pergola) Overhead Système (Pergola) Tirer Vertical Positionnement (Guyot) Tirer Vertical Positionnement (Guyot)
Le type de sol Argile limoneuse Terreau Argile Terreau Terreau d'argile loam limoneux Terreau d'argile
La plantation mise en page (m) 3.20 x 1.00 4,50 x 0,80 4,00 x 1,25 3.50 x 1.20 3,50 x 0,75 2.80 x 1.00 1,80 x 0,80
Total de chaux% 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
Actif chaux% 0,5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
Le sable % 15 47 66 42 29 13 36
Loam% 43 36 21 37 39 67 36
Clay% 42 17 13 21 32 20 28
Le pH du sol 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
Substance organique (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
Phosphore échangeables (mg / kg) 26 73 73 68 48 47 64
Potassium échangeable (mg / kg) 190 376 620 230 168 154 126
Magnésium échangeables (mg / kg) 272 468 848 623 294 293 183
Calcium échangeable (mg / kg) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
Berry sucres réducteurs 2006 211.25 ± 1.20 176.20 ± 0,42 187.40 ± 0.00 203.70 ± 1.13 212,55 ± 0,64 195.20 ± 0.00 211,65 ± 0,64
Berry sucres réducteurs 2007 190,00 ± 1,27 165,25 ± 0,49 153,00 ± 0,42 203,60 ± 0,71 210,90 ± 0,71 192,25 ± 0,64 188,70 ± 1,84
Berry sucres réducteurs 2008 191,35 ± 0,64 178,90 ± 0,57 170,05 ± 0,49 205.15 ± 1.48 188.70 ± 0,57 169,35 ± 0,49 108,05 ± 1,06
Berry pH 2006 3,01 ± 0,01 2,96 ± 0,01 2,84 ± 0,00 2,9 ± 0,00 2,98 ± 0,00 3.02 ± 0.00 3,06 ± 0,01
Berry pH 2007 2,97 ± 0,00 3,00 ± 0,00 2,74 ± 0,00 3,07 ± 0,01 2,98 ± 0,00 2,87 ± 0,01 3,09 ± 0,00
Berry pH 2008 2,83 ± 0,00 3,04 ± 0,01 2,71 ± 0,00 2,98 ± 0,01 2,98 ± 0,00 2,82 ± 0,00 3.11 ± 0.00
date de récolte 2006 2007 2008
véraison 8-Aug 18-Jul 12 août
Mid affinage 4-Sep 8-Aug 2-Sep
Mûr 18-Sep 29-Aug 23-Sep

Tableau 1: Principales caractéristiques de chaque vignoble etéchantillon collection dates. m = mètres, EW = Mangez-Ouest, NS = Nord-Sud.
figure-protocol-1
Figure 1:. Représentation schématique de la procédure d'échantillonnage Les trois la production de vin macro-zones sont situées dans les environs de la ville de Vérone, Vénétie, Italie. Les trois points de temps sont véraison (V) représentant le début de la maturation dans la viticulture, à mi-maturation (MR) et les baies mûres (R). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préparer Berry poudre Extraits Analyser les métabolites et traiter les données

  1. Préparer les échantillons Berry poudre pour l'analyse.
    1. Préparer les extraits métaboliques des échantillons de baies à la température ambiante en trois volumes (p / v) de methanol acidifié avec 0,1% (v / v)l'acide micro dans un bain à ultrasons à 40 kHz pendant 15 min. Utiliser de l'eau LC-MS-grade et l'acide formique et le méthanol de qualité HPLC.
    2. Centrifuger les extraits à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Diluer le surnageant de l'étape 2.1.2 en deux volumes (v / v) d'eau déminéralisée et passer à travers un filtre de 0,2 um.
  2. Analyser les extraits Berry par HPLC-ESI-MS.
    1. Mettre en place le système HPLC-ESI-MS selon les recommandations du fournisseur.
      NOTE: Dans cette étude de cas, l'installation comprend un système HPLC équipé d'un échantillonneur automatique, connecté en ligne avec un spectromètre de masse à piège à ions et source d'ionisation électrospray.
    2. Connecter le système HPLC avec une colonne de garde de C18 (7,5 x 2,1 mm 2) et une colonne de phase C18 Inversée (150 x 2,1 mm 2, la taille des particules 3 pm).
    3. Préparer les solvants utilisés en tant que phase mobile. En utilisant 5% (v / v) d'acétonitrile, 0,5% (v / v) d'acide formique dans de l'eau comme solvant A et 100% d'acétonitrile en tant que solvent B. Utilisation acétonitrile LC-MS-qualité, l'eau et l'acide formique.
    4. Exécuter la séparation par HPLC avec un gradient linéaire de solvants A et B à un débit constant de 0,2 ml min - 1 en utilisant un volume d'injection d'échantillon de 30 ul.
      1. Dans un premier temps équilibrer la colonne avec 100% de solvant A. Après injection de l'échantillon, établir un gradient de 0% à 10% de solvant B en 5 min, de 10% à 20% de solvant B en 20 min, de 20% à 25% de solvant B dans le 5 min et de 25% à 70% de solvant B en 15 min.
      2. Analyser chaque échantillon en double exemplaire. Randomize analyse de l'échantillon pour éviter les effets d'instruments à moteur. Autoriser 20 min pour rééquilibration avec 100% Un solvant entre chaque analyse.
    5. Acquérir des spectres de masse dans les modes négatifs et positifs alternatifs ionisation. Pour les résultats décrits dans cette étude de cas, définissez les paramètres comme dans le tableau 2. Le réglage de la machine dépend de la plate - forme spécifique.
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un autre costumeméthodes capables selon la plate-forme spécifique.
      1. Dans tous les cas, comme avec toute plate-forme de séparation, assurez-vous d'utiliser un temps rééquilibration approprié, afin d'avoir la rétention reproductibilité du temps. Lorsque le nombre d'échantillons est élevé (supérieur à dix échantillons), les analyser dans des lots de 9-10 échantillons, avec des programmes de nettoyage de la colonne chromatographique (gradients lents entre les deux solvants d'élution) entre chaque lot. Pour avoir assez de reproductibilité des temps de rétention, veiller à ce que la première analyse chromatographique de chaque lot est une analyse à blanc (analyse du solvant).
    6. Acquérir également les spectres de masse en mode d'ions négatifs et positifs fragmentés fixant les options de fragmentation (deux précurseurs d'ions, MS 3). Annoter les métabolites par analyse de l' arbre de fragmentation (MS / MS et MS 3) selon les instructions du fabricant.
      NOTE: Ceci est particulièrement adapté pour les métabolites végétaux, car ils sont souvent glycosylées, thervant la première fragmentation (MS / MS) tend à éliminer les fractions de sucre en laissant l'ion aglycone libre, et la fragmentation subséquente (MS 3) permet d'identifier l'aglycone contre une bibliothèque de normes authentique.
    7. Acquérir MS / MS et MS 3 spectres dans la gamme m / z 50-1,500 avec une amplitude de fragmentation de 1 V. Vous pouvez également utiliser d' autres méthodes appropriées en fonction de la plate - forme spécifique.
    8. Pour chaque signal m / z, comparer la MS / MS et MS 3 modèles de fragmentation et de temps de rétention à la bibliothèque de normes authentique selon les instructions du fabricant.
      NOTE: Plusieurs types de plates-formes comprennent des installations de logiciels pour construire ce genre de bibliothèque à travers l'analyse des normes authentiques. Cela devrait identifier un grand nombre de signaux, mais tous les signaux non sera annoté.
    9. Pour les signaux anonymes restants, comparez les MS / modèles 3 fragmentation MS et MS avec ceux publiés dans la littérature, searching pour valeurs m / z (c. -à- chiffres "m / z 353" pour trouver des publications dans lesquelles des molécules avec une telle m / z sont mentionnés) avec l' un des moteurs de recherche commune librement disponibles, ou utiliser des bases de données en ligne tels que MassBank (www .massbank.jp / fr / database.html) et la base de données du métabolome humain (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Composants de spectrométrie de masse Fonction Paramètres
Electrospray Ionisation Source gaz de nébulisation 50 psi, 350 ° C
gaz de séchage 10 L min -1
Ion trap et le détecteur Balayage Mode de balayage complet, 13.000 m / z par seconde, plage 50-1,500 m / z
Masse cible 400 m / z
Collision gaz Hélium
la pression du vide 1,4 x 10 -5 mbar
Source de Capillaires 4,000 V
Plaque d'extrémité décalée -500 V
Écumoire -40 V
sortie Cap -121 V
1 octobre DC -12 V
2 octobre DC -1.7 V
Objectif 1 +5 V
Objectif 2 +60 V
ICC pour le mode d'ionisation positive 20,000
ICC pour le mode d'ionisation négative 7000

Tableau 2: jeu de paramètres principal pour l' acquisition de spectres de masse.

Opération Sélection Fonction Paramètres Valeurs
Détection de crête détection de masse centroïde Niveau de bruit 3500
Chromatogramme constructeur Point culminant de données min laps de temps 0,15
hauteur min 4000
m / z tolérance 0,3
Détection de crête déconvolution pic Recherche minimum local seuil chromatographique 70
Recherche minimum dans la gamme RT (min) 00:50
hauteur relative minimum 15%
hauteur absolue minimum 4000
rapport Min du pic top / bord 2
Durée plage (min) 0-10
isotopes pics isotopiques mérou - m / z tolérance 1.2
la tolérance RT 00:50
forme monotones Non
Charge maximum 3
isotope Représentant Non
Alignement Rejoignez aligneur - m / z tolérance 1.2
Poids pour m / z dix
Rétention tolérance de temps 00:50
Poids pour la RT 5
Exiger même état de charge Non
Exiger même ID Non
Comparez profil d'isotopes Non
Combler les lacunes finder pic - tolérance d'intensité 20%
m / z tolérance 0,9
Rétention tolérance de temps 00:40
correction RT Non
Filtration Dupliquer filtre de pointe - m / z tolérance 1.2
la tolérance RT 00h30
Exiger même identification Non

Tableau 3: Mzmine flux de travail avec des valeurs spécifiques pour traiter les fichiers LC-MS baie de raisin données négatives.

  1. Traiter les données LC-MS.
    1. Access outélécharger un logiciel de traitement de données qui peuvent extraire des informations pertinentes à partir de nombreux chromatogrammes premières et de construire une matrice de données dans laquelle chaque métabolite détecté est quantifié dans chaque échantillon.
      REMARQUE: étapes Le protocole sont ci-dessous sur mesure pour l'open-source MZmine logiciel v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). Il est un logiciel open-source pour le traitement des données de spectrométrie de masse, avec l'accent principal sur les données LC-MS. 27
    2. Transformer les données de chromatogramme LC-MS au format netCDF à l'aide du logiciel fourni par le fabricant de l'équipement. Pour les résultats décrits ici, utilisez le v5.2 Bruker Daltonics Esquire et d'analyse de données v3.2 logiciels et suivez les étapes selon les instructions du fabricant.
      NOTE: D'autres convertisseurs peuvent être utilisés (divers convertisseurs logiciels libres sont disponibles).
    3. Importez les fichiers .cdf dans le logiciel.
    4. Mettre en œuvre les procédures de filtrage de détection de pointe, alignement, remplissage d'espace et de pointe avec le PARAMETteurs rapportés dans le tableau 3.
      1. Comme première étape, sélectionnez un fichier .cdf importé, puis passez à la visualisation → TIC / XIC Visualizer. Placez le curseur sur la base du pic le plus petit dans le chromatogramme et de prendre note sur le signal minimum d'intensité de l'ion de base. Ensuite, allez à Raw Méthodes Données → Détection Peak.
      2. Sélectionnez Détection de masse et remplir le niveau du signal pour détecter des ions individuels pour chaque balayage et de créer une liste d'ions.
        REMARQUE: Vérifiez l'algorithme avant d'effectuer la détection de masse - cela dépend du spectromètre de masse. Dans notre cas, nous choisissons Centroïde.
      3. Sélectionnez Chromatogramme Builder et remplir avec le niveau du signal pour relier les points de données de la liste d'ions et de construire un chromatogramme pour chaque valeur de masse. Voir les paramètres spécifiés dans le manuel du spectromètre de masse pour régler le Min Laps de temps et m / z tolérance.
      4. Ensuite, allez à Peak Méthodes Liste → Pic Détection → Chromatogramme Deconvorésolu-. Sélectionnez l'algorithme approprié (dans ce cas, la recherche locale minimum) pour permettre la séparation de chaque chromatogramme en pics individuels.
      5. inspecter manuellement les chromatogrammes pour connaître les valeurs appropriées pour les paramètres suivants. Réglez le seuil chromatographique à 30% pour éliminer le bruit et Recherche minimum en RT Range à 2 (min) pour identifier la présence de la population locale minimales pour distinguer deux pics.
      6. Réglez Taille minimum relative au 2.0. inspecter manuellement le chromatogramme pour identifier la hauteur absolue minimale de signal qui correspond à un pic, et non à l'arrière-plan; définir cette valeur comme absolue Hauteur (par exemple, 10 000 dans l'expérience présentée).
      7. Set Ratio Min Peak Top / Edge 1.1 pour indiquer le ratio minimum entre le haut et le plus bas intensités des points de données d'un pic d'être reconnu comme un véritable pic.
      8. inspecter manuellement les chromatogrammes pour voir quelle est la durée minimale des différents pics dans le Chromat utiliséconditions ographiques (par exemple, entre 0,2 et 2 min, en fonction du composé, dans les expériences présentées), et par conséquent utilisent ces valeurs comme Pic Durée Range (min) pour définir la plage de longueur acceptable de pointe que la durée.
      9. Ensuite, allez à pic Liste Méthodes → Isotopes → isotopiques Peaks Grouper pour grouper des isotopes dans un pic, le plus souvent dans le plus intense. Remarque: Les paramètres dépendent de la résolution du spectromètre de masse et la reproductibilité des temps de rétention.
      10. Enfin, allez à pic Liste Méthodes → Alignement → Joignez - vous à Aligneur pour aligner des pics en fonction de leur m / z et la rétention du temps en utilisant un score de match.
    5. Après avoir aligné les pics, combler les lacunes de données en cliquant sur le pic Liste Méthodes → Gap Remplissage → Pic Finder. Enfin, le filtre en double points de données en cliquant sur le pic Méthodes → Filtrage → Dupliquer Filtre Pic Liste.
    6. Exporter l'ensemble de données résultant en tant que .csfichier v.
    7. Modifier manuellement la. Extension csv à une extension txt.. Si aucune des extensions de fichiers sont visibles, modifier les paramètres de l'ordinateur pour révéler les extensions de fichier. Accédez à Explorateur de fichiers Options → Affichage → Paramètres avancés et décochez la case «Masquer les extensions des types de fichiers connus.
    8. Importez les fichiers .txt dans un tableur. On obtient ainsi une matrice de données dans laquelle tous les métabolites détectés, reconnus par un numéro d'identification de temps, valeur m / z et la rétention, sont quantifiés dans tous les échantillons en fonction de leurs valeurs de la zone de pointe.

3. Préparer Berry poudre Extraits pour l'analyse du transcriptome et traiter les données

  1. Extrait ARN total des échantillons Berry et déterminer la qualité de l'ARN.
    1. Extraire l'ARN total à partir des échantillons de baies.
      NOTE: Dans cette étude de cas, un kit exclusif et une procédure modifiée qui assure l'élimination complète des molécules qui interfere avec l'analyse de l'ARN, tels que les polysaccharides et les polyphénols ont été utilisés. Les instructions ci - dessous sont spécifiques pour ce kit 18.
      1. Peser 400 mg de poudre de baies pour chaque échantillon, le diviser en deux parties et placer 200 mg chacune dans deux tubes de microcentrifugation.
      2. Ajouter 900 ul de la solution de lyse contenant du β-mercaptoéthanol (fourni dans le kit) pour chaque 200 mg de poudre et vortexer vigoureusement immédiatement et pendant au moins 30 secondes. Chauffer l'échantillon à 56 ° C pendant 5 min sous agitation à 800 tours par minute.
      3. Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse de paillasse pendant 10 minutes pour sédimenter les débris cellulaires.
      4. Pipet 700 pi du surnageant dans la colonne de filtration fourni dans le kit (anneau de retenue bleu) assis dans un tube collecteur de 2 ml. Fermez le bouchon et centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse de paillasse pendant 1 min pour éliminer les débris résiduels. Répétez cette étape deux fois en utilisant la même colonne de filtration, mais un tube de collecte frais, résultant en trois tubes contenant chacun ~ 700 ul du lysat clarifié.
      5. Pipet 750 pi de solution de liaison (fourni dans le kit) dans chaque tube de lysat clarifié et mélanger immédiatement par pipetage de haut en bas au moins cinq fois. Transférer 700 ul de ce mélange à la colonne de liaison fourni dans le kit (anneau de retenue rouge) assis dans un tube collecteur de 2 ml. Fermez le bouchon et centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse de paillasse pendant 1 min pour lier l'ARN.
      6. Décanter la fraction d'écoulement, inverser le tube de collecte et tapez brièvement sur un tampon propre de papier absorbant pour drainer le liquide résiduel.
      7. Retour de la colonne dans le tube de collecte et de pipeter le mélange restant dans la même colonne et répéter la centrifugation et les étapes de décantation. Répétez jusqu'à ce que la totalité du mélange a été filtré dans la même colonne de liaison rouge.
      8. Maintenant, suivez les instructions restantes dans le kit et éluer l'ARN dans un tampon d'élution de 50 pi (fourni dans le kit) et stocker it à -80 ° C prêt pour les étapes de contrôle de qualité.
    2. Déterminer la quantité et la pureté de l'ARN en utilisant un spectrophotomètre. Enregistrer les rapports d'absorbance qui montrent le degré de contamination par les protéines (A 260/280) et les polyphénols / polysaccharides (A 260/230).
      NOTE: ARN approprié pour microarray hybridation doit marquer au moins 1,8 pour les deux ratios.
    3. Déterminer l'intégrité de l'ARN.
      REMARQUE: Différents systèmes peuvent être utilisés. Un acquéreur numérique qui effectue une course électrophorétique capillaire en combinaison avec un colorant fluorescent a été utilisé dans cette étude de cas. ARN approprié pour microarray hybridation doit avoir un numéro d'intégrité de l'ARN (RIN) d'au moins 8.
  2. Préparer des échantillons et Hybrider l'ARN à un microréseau personnalisé.
    1. Réglez le montant de départ de l'ARN total pour l'analyse des microréseaux à 200 ng par dilution de la solution d'ARN obtenu à l'étape 3.1.1.8 avec de l'eau sans RNase désionisée. Ajouter lequantité appropriée d'ARN dans un tube de 1,5 ml dans un volume final de 1,5 ul.
    2. Ajouter 2 ul de mélange dilué de pic à chaque échantillon d'ARN et de suivre les instructions du fabricant pour synthétiser l'ADNc du premier brin, transcrire en ARNc et étiqueter le ARNc avec cyanine 3CTP.
    3. Purifier l'ARNc marqué selon les instructions du fabricant et éluer dans 30 l'eau libre de RNase-ul.
    4. Déterminer l'activité et le rendement spécifique de chaque ARNc en enregistrant trois valeurs sur un spectrophotomètre cyanine 3: concentration de colorant (pmol pi -1), la pureté de l' ARN (A 260/280) et la concentration ARNc (ng pi -1). Utilisez les formules trouvées dans le manuel d'instructions du fabricant pour calculer le rendement de l'ARNc (pg) et l'activité spécifique (pmol Cy3 par pg ARNc).
      NOTE: Recommandé rendements et activités spécifiques diffèrent sur la base du format de microréseau spécifique. Dans cette étude de cas d'un format de 44K 4-pack étaitchoisi, le rendement était recommandé 1,65 et l'activité spécifique était de 9.
    5. Concevoir le microréseau personnalisé à l'aide des logiciels appropriés pour la conception de la sonde.
      1. Pour les résultats décrits dans cette étude de cas, préparer un nouveau microréseau personnalisé, conçu sur le format 44K 4-pack en utilisant une application basée sur le Web pour la conception de puces à ADN personnalisé et des bibliothèques d'oligonucléotides. Sondes de conception pour correspondre à 34,651 transcrits cibles, y compris 29.971 prédit transcriptions du Pinot noir V1 tableau, 4.500 nouveaux loci identifiés dans le cultivar Pinot par la reconstruction de transcriptome Corvina et 180 gènes Corvina privés 25.
        NOTE: Cela impliquait la production de 34,651 sondes spécifiques 60-mer, comprenant 29.798 Pinot noir prédit transcrits, 4392 nouveaux loci de Pinot et 179 gènes Corvina privés.
    6. Préparer l'assemblage d'hybridation basé sur les spécifications de format 4-pack comme suit.
      1. Placer 1,65 pg d'ARNc marqué au Cy3 dans un volume final de 41,8ul d'eau libre de RNase-désionisée. Ajouter 11 pi de 10x Agent de blocage et 2,2 ul 25x Fragmentation Buffer. Incuber à 60 ° C pendant 30 min dans un bain thermostatique à fragmenter l'ARN. Refroidir immédiatement sur la glace pendant 1min.
      2. Enfin, ajouter 55 pi de tampon d'hybridation 2x, bien mélanger par pipetage et de spin pendant 1 min à 15500 xg à la température ambiante. Promptement placer le tube à centrifuger sur la glace. Utiliser immédiatement, ne pas stocker.
    7. Chargez le microréseau personnalisé comme suit.
      1. Chargez une lame de joint avec l'étiquette vers le haut dans la base d'une chambre d'hybridation. charger lentement 100 pi d'échantillon d'hybridation obtenus à l'étape 3.2.6.2 sur chaque joint ainsi, la distribution du liquide avec la pointe de la pipette, en évitant les bulles.
      2. placez lentement le microréseau personnalisé vers le bas, en veillant à ce que le code à barres numérique est orientée vers le haut. Assurez-vous que la paire sandwich est correctement aligné. Enfin placez le couvercle de la chambre d'hybridation sur le sandwichdiapositives et de la main-serrer la pince sur la chambre. Tournez la chambre assemblé pour évaluer la mobilité des bulles.
    8. Placez chambre de coulissement assemblé dans une rôtisserie dans une hybridation four réglé à 65 ° C. Réglez le rotateur pour tourner à 10 tours par minute. Laisser l'hybridation se dérouler pendant 17 h.
    9. Procéder au lavage microarray diapositive comme suit.
      1. Tout d'abord, préparer trois plats de diapositives-taches et les remplir avec les tampons de lavage appropriés: 2 plats avec le tampon de lavage 1 à la température ambiante et 1 plat avec préchauffé (37 ° C) Wash Buffer 2.
      2. Démonter la chambre d'hybridation et enlever le sandwich. Avec le microréseau slide code à barres numérique vers le haut, plonger le sandwich dans le premier plat slide-coloration rempli Wash Buffer 1 à température ambiante et, avec l'aide d'une pince propre, séparer le joint d'étanchéité de la lame de microréseau. Transférez rapidement la lame de microréseau dans une grille coulissante et le placer dans le deuxième plat slide-coloration rempli Wash Buffer 1à la température ambiante.
      3. Mettre le plat slide-coloration sur un agitateur magnétique et laver 1 min sous agitation modérée. Transférez rapidement la grille coulissante dans le troisième plat coulissant coloration rempli de pré-chauffé (37 ° C) Wash Buffer 2 et laver 1 min sous agitation modérée.
      4. Lentement retirer le rack de la boîte de slide-coloration et retirer délicatement la lame du rack, évitant des gouttelettes.
        NOTE: Ne pas ajouter de Triton X-102 aux tampons de lavage et omettre l'étape acétonitrile de lavage.
    10. Rangez la puce lavée dans l'obscurité à la température ambiante.
  3. Scannez le microréseau et extraire les principales caractéristiques.
    1. Placer la lame de microréseau dans un scanner approprié et analyser chaque tableau en utilisant les paramètres recommandés dans les instructions du manuel du fabricant de puces à ADN. Pour les résultats décrits ici, placez chaque lame de microréseau dans un support de diapositives pour faciliter la procédure de balayage.
    2. Importez la sortie .shpdéposer dans un logiciel approprié qui est capable de convertir un signal numérique en valeurs de fluorescence numériques. Vérifiez le rapport de contrôle de la qualité pour veiller à ce que la procédure d'hybridation a réussi.
      1. Pour les résultats décrits ici, utilisez les réglages des paramètres recommandés dans le manuel d'instructions du logiciel d'extraction de caractéristiques et d' inspecter le rapport de contrôle de la qualité pour veiller à ce que les paramètres indiqués dans le tableau 4 sont dans la plage normale donnée par le fabricant.
Nom Metric Limite supérieure Limite inférieure La description
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 N / A Pourcentage de fonctionnalités qui sont caractéristiques des valeurs aberrantes non-uniformité dans l'un des canaux
Limite de détection 2.00 0.10 Plus Moyenne 1 écart type des ins pic en dessous de la gamme de concentration linéaire
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 Absolue de la pente de l'ajustement pour Signal vs Concentration des sondes E1a
MedCVProcSignal 8.00 N / A Median% CV pour le signal traité
gNegCtrlAveBGSubSig 5,00 -10.00 Moyenne de fond de signal de tous les contrôles inliers négatifs soustrait (BGSubSignal est calculée en soustrayant une valeur appelée BGUsed de la fonction de signal moyenne)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 N / A Moyenne d'un signal net de tous les contrôles inliers négatifs
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 N / A L'écart-type defond soustrait les signaux de tous les contrôles inliers négatifs
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 N / A Median% CV pour le signal traité des sondes non-contrôle
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 N / A Résiduelle de fond en forme élimination de la tendance

Tableau 4: Principaux paramètres à vérifier pour vérifier la qualité des puces à ADN hybridation.

  1. Traiter les données biopuces.
    1. Une fois que toutes les diapositives de puces à ADN ont été numérisés et le contrôle de la qualité a été évaluée positivement, préparer un data-matrice délimité par des tabulations en sélectionnant les valeurs gProcessedSignal de chaque fichier unique sous - réseau résultat, représentant les intensités de fluorescence brutes de chaque sonde.
    2. Dans une feuille de calcul, normaliser les données sur le 75 e centile dans chaque tableau (valeurs P) et calculmangé la moyenne de toutes les valeurs de P entre tous les différents sous-réseaux pour calculer le ratio de R.
    3. Ensuite, sur la même feuille de calcul, normaliser chaque valeur gProcessedSignal le rapport R de sa propre sous-réseau.

4. Effectuer l'analyse statistique détaillée des métabolomique et transcriptomique données

  1. Préparer le logiciel d'analyse statistique.
    NOTE: Dans cette étude de cas, un logiciel capable d'effectuer PCA, PLS-DA et O2PLS-DA a été utilisé.
    1. Importez les métabolomique et les données de transcriptomique. Allez dans Fichier → Nouveau projet → Nouveau projet Regular Regular pour importer la matrice de données obtenue avec le logiciel MZmine. Ensuite, cliquez sur Modifier → Transposer toute la matrice → Maison et attribuer l'ID → Terminer primaire et secondaire approprié.
    2. Moyenne centrer les données et les étendre en utilisant l'échelle de Pareto. Dans la fenêtre d'accueil, allez sur Modifier → M1 et changer la Paramé appropriéetres selon les données. Pour les résultats décrits ici, changer l'échelle de l'Unité Variance à Par.
    3. Escaladez les données de transcriptomique en utilisant le paramètre Unité Variance.
  2. Effectuer l'analyse statistique multivariée.
    1. Mettre en œuvre l'APC comme le montre la F igure 2. Dans cette étude de cas, PCA révèle les principales différences entre les échantillons, ce qui reflète les différents stades de maturation et de saisons de croissance.
      1. Dans la fenêtre Workset, sélectionnez PCA-X comme type de modèle. Appuyez sur Autofit. Faites attention à la R2X (cum) et Q2 (cum) valeurs car elles donnent une idée de la qualité du modèle.
        NOTE: En général, plus les valeurs plus le modèle, mais les modèles à très haute R2X (cum) pourraient trop ajuster les données. Comme règle empirique, nous cessons d'ajouter des composantes principales lorsque la Q2 (cum) la valeur commence à diminuer.
      2. Ensuite, sélectionnez Scores → Scatter pour voir le graphique qui montre le regroupement possible des échantillons.
      3. Inspecter l'APCNote Plot. Si un bon modèle est obtenu (Q2cum> 0,5), utiliser les mêmes classes d'échantillons pour construire un modèle O2PLS-DA (étape 4.2.2).
    2. Construire deux modèles O2PLS-DA à l'aide des échantillons classés par macro-zone et valider les modèles en utilisant un test de permutation avec 200 permutations.
      1. Attribuer les classes en allant à la fenêtre Accueil → Nouveau Comme → M1 → Observations. Définissez les classes souhaitées. Ensuite, modifier le type de modèle de PCA-X à O2PLS-DA. Appuyez sur Autofit. Assurez-vous que le nombre de composants du modèle PLS-DA est le même que celui de la O2PLS-DA.
      2. Pour valider le modèle O2PLS-DA, aller Analyser CV-ANOVA et voir la p-valeur de droite. De plus, cliquez sur Nouveau Comme dans la fenêtre d'accueil → M2 et modifier le type de modèle de O2PLS-DA à PLS-DA. Appuyez sur Autofit.
      3. Allez à Analyser → Permutations et effectuer 200 permutations (de-sélectionnez l'option Recalculer Permutations).
        Remarque: Le résultat final montre une fenêtre dans laquelle la valeur R2 should généralement frappé l'axe Y dans les valeurs sous 0,4, tandis que la Q2 devrait frapper la partie négative de l'axe Y. Si les valeurs R2 et / ou Q2 sont incorrects, réduire le nombre de composants à la fois dans les modèles PLS-DA et O2PLS-DA.
      4. Passez à sélectionner M2 dans la fenêtre de projet et cliquez sur Scores → Scatter pour voir le tracé et la position des classes d'échantillons. Pour observer ce métabolites caractériser une ou plusieurs catégories, aller à Tracer / Liste → Scatter.
      5. Changer le Sélectionner le type de données aux observations et Chargements → Ajouter la série et de modifier l'article dans l'axe X et de série dans pq (corr) et Pred Comp en 1 et de 2 ou d'autres composants lorsqu'ils sont présents, respectivement.
      6. Avec le bouton droit de la souris enfoncé sur le terrain, aller à la propriété → Couleur et sélectionnez En termes de distinguer les symboles de tracé entre les molécules et les classes. Allez à la mise en page → Format Plot → Axis et / ou Styles pour modifier le terrain avec les caractéristiques souhaitées.
    3. Sur la base des résultats des métabolomique d'analyse O2PLS-DA, présentent des différences dans les niveaux relatifs des métabolites ou des classes spécifiques de métabolites que les histogrammes.
    4. Sur la base des résultats de l'analyse transcriptomique O2PLS-DA, récupérer et affecter des gènes modulés différentiellement à Gene Ontology (GO) classifications 28.
    5. Identifier les relations entre les niveaux de métabolites et l'expression du gène manuellement.

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Résultats

L'étude de cas décrit dans cet article a donné une matrice de données finale comprenant 552 signaux (m / z caractéristiques) , y compris des ions moléculaires ainsi que leurs isotopes, adduits et quelques fragments, relativement quantifiés parmi 189 échantillons (7 vignobles x 3 étapes de maturation x 3 saisons de x croissance 3 répétitions biologiques). Le nombre total de points de données a donc été 104.328. Analyse de l' arbre de Fragmentation a abouti à l'annotat...

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Discussion

Cet article décrit les métabolomique, de la transcriptomique et des protocoles d'analyse statistiques utilisées pour interpréter la notion de terroir baie de raisin. Analyse métabolomique par HPLC-ESI-SM est suffisamment sensible pour détecter un grand nombre de métabolites simultanément, mais la quantification relative est affectée par l'effet de la matrice et la suppression d'ions / amélioration. Cependant, une approche similaire a déjà été utilisé pour décrire la maturation et de dépérissement post-récolt...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a bénéficié des activités de mise en réseau coordonnées dans le cadre de l’action COST FA1106 financée par l’UE « Une approche systémique intégrée pour déterminer les mécanismes de développement contrôlant la qualité des fruits charnus chez les tomates et les vignes ». Ce travail a été soutenu par le projet « Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale » financé par la Fondation Banque CARIVERONA et par le projet « Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto) » financé par le Ministère italien des Politiques Agricoles et Forestières. SDS a été financé par le ministère italien de l’Université et de la Recherche FIRB RBFR13GHC5 projet « La plasticité épigénomique de la vigne dans le génotype par interactions environnementales ».

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BroyeurIKAIKA A11 basic
HPLC AutosamplerBeckman Coulter  ;-System Gold 508 Autosampler
Système HPLCBeckman Coulter  ;-System Gold 127 Module de solvant HPLC
C18 Guard ColumnGrace  ;-Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm ; 5 &mu ; m) Colonne de garde
C18 ColonneGrace  ;-Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm ; 3 &mu ; m) Spectromètre
de masseBruker Daltonics  ;-Bruker Esquire 6000 ; Le spectomètre de masse était équipé d’une source ESI et l’analyseur était un piège à ions.
Solvants d’extraction et tampons HPLCSigma34966Méthanol grade LC-MS
Sigma94318Acide formique grade
Sigma34967Acétonitrile grade LC-MS
Sigma39253Eau  ;
(0,2 &mu ; m)Sartorius17764
Logiciels pour la collecte et le traitement des données (b)Bruker Daltonics-BrukerDaltonics Esquire 5.2 Contrôle (a) ; Esquire 3.2 Analyse de données et logiciels MzMine 2.2 (b)
Spectrum Plant Kit d’ARN totalSigma-AldrichSTRN250-1KTPour l’extraction de l’ARN total des péricarpes de raisin
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano ReagentsAgilent Technologies5067-1511
Puces d’ARNAgilent Technologies5067-1511
Tampon de lavage d’expression génique Agilent 1Agilent Technologies5188-5325
Tampon de lavage d’expression génique Agilent 2Agilent Technologies5188-5326
Kit d’étiquetage LowInput QuickAmp UnicoloreAgilent Technologies5190-2305
Kit ARN Spike In - UnicoloreAgilent Technologies5188-5282
Kit d’hybridation d’expression géniqueAgilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104Pour la purification de l’ARNc
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer MicroarrayAgilent TechnologiesG2514F-048771  ;
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
Glissières d’étanchéitéAgilent TechnologiesG2534-60012Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array
Hybridation Bain thermostatiqueJulabo-Chambre
d’hybridationAgilent TechnologiesG2534-60001
Four d’hybridation de microréseauxAgilent TechnologiesG2545A
Four d’hybridation Rotator RackAgilent TechnologiesG2530-60029
Rotator Rack ConversionAgilent TechnologiesG2530-60030
Kit de colorationBio-Optica10-2000Slide-staining dish et Slide rack
Agitateur magnétiqueAREX Heating Agitateur magnétiqueF20540163  ;
Four thermostatiqueThermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent Scanner de microarraysAgilent TechnologiesG2565CA
Carrousel de scanner, 48 positionsAgilent TechnologiesG2505-60502
Supports de lamesAgilent TechnologiesG2505-60525
Logiciel d’extraction de caractéristiques v11.5Agilent Technologiesàl’intérieur du scanner de microréseaux Agilent G2565CA
logiciel SIMCA + V13Umetrics
sur colonne LC-MS Filtres à seringue Minisart RC 4 de qualité LC-MS Rod

Références

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Analyse du transcriptomem tabolomique par LC MShybridation sur puce ADNanalyse en composantes principalesanalyse discriminante O2PLSidentification des m tabolitesint gration statistique des donn esplan d chantillonnage des baies

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