Research Article
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Nous présentons un protocole pour identifier et quantifier les composants dans des mélanges d’espèces possédant des protéines similaires. La spectrométrie de masse détecte les peptides pour l’identification et donne une quantification relative par des rapports de surfaces de pics. En tant qu’outil de détection des fraudes, la méthode peut détecter 1 % de cheval dans le bœuf.
Nous décrivons un protocole simple pour identifier et quantifier les deux composants dans des mélanges binaires d’espèces possédant une ou plusieurs protéines similaires. Au cœur de la méthode se trouve l’identification des « protéines correspondantes » dans l’espèce d’intérêt, en d’autres termes des protéines qui sont nominalement identiques mais qui possèdent des différences de séquence spécifiques à l’espèce. Lorsqu’elles sont soumises à la protéolyse, les protéines correspondantes donneront naissance à certains peptides qui sont également similaires, mais avec des variantes spécifiques à l’espèce. Il s’agit de « peptides correspondants ». Les peptides spécifiques à une espèce peuvent être utilisés comme marqueurs pour la détermination des espèces, tandis que les paires de peptides correspondants permettent la quantification relative de deux espèces dans un mélange. Les peptides sont détectés à l’aide de la spectrométrie de masse MRM (Multiple Reaction Monitoring), une technique très spécifique qui permet de déterminer les espèces à base de peptides, même dans des systèmes complexes. De plus, le rapport des surfaces de pic MRM dérivées des peptides correspondants soutient la quantification relative. Étant donné que les protéines et les peptides correspondants se comporteront, dans l’ensemble, de la même manière dans le traitement et dans l’extraction expérimentale et la préparation des échantillons, la quantification relative devrait rester relativement robuste. De plus, cette approche n’a pas besoin des étalons et des étalonnages requis par les méthodes de quantification absolue. Le protocole est décrit dans le contexte des viandes rouges, qui ont des protéines correspondantes pratiques sous la forme de leurs myoglobines respectives. Cette application est pertinente pour la détection de la fraude alimentaire : la méthode peut détecter 1 % poids pour poids de viande de cheval dans le bœuf. La quantification relative des protéines et des peptides correspondants (CPCP) à l’aide des rapports de surface des pics MRM donne de bonnes estimations de la composition poids/poids d’un mélange cheval et bœuf.
Le scandale européen de la viande de cheval de 2013, au cours duquel de la viande de cheval non déclarée a été trouvée dans un certain nombre de produits à base de viande bovine de supermarché1, souligne la nécessité de disposer de méthodes d’analyse capables de détecter et de mesurer la fraude alimentaire dans la viande. Plusieurs technologies ont été explorées, notamment l’immuno-enzymatique (ELISA) et les méthodes basées sur l’ADN2. Une autre voie, basée sur la spectrométrie de masse, cible les peptides spécifiques à l’espèce qui proviennent à leur tour de protéines spécifiques à l’espèce. Nous décrivons ici une telle approche basée sur les peptides qui offre à la fois l’identification et la quantification relative de l’espèce adultérante dans un mélange de viande3.
Le protocole s’inscrit dans le contexte des viandes rouges et de la volonté de déterminer la présence de l’une chez l’autre à l’échelle de 1 % en poids, niveau considéré par certains comme représentant une falsification frauduleuse des aliments par opposition à une contamination4. La méthode repose en premier lieu sur l’identification d’une protéine qui est nominalement « la même » dans toutes les viandes cibles. La myoglobine, la protéine responsable de la couleur rouge de la viande, est un bon candidat car elle est abondante, relativement tolérante à la chaleur et soluble dans l’eau, et a été utilisée pour la détermination de l’espèce de la viande auparavant5,6. Les myoglobines du bœuf (Bos Taurus), du porc (Sus scrofa), du cheval (Equus caballus) et de l’agneau (Ovis aries)3, par exemple, sont nominalement les mêmes, selon les besoins, mais leurs séquences ne sont pas identiques. De tels groupes de protéines « similaires mais différentes », comme ces quatre myoglobines, peuvent commodément être décrits comme des « protéines correspondantes ». Les différences de séquence dans ces quatre myoglobines sont spécifiques à l’espèce : par exemple, les protéines de myoglobine complètes pour le bœuf et le cheval, P02192 et P68082 respectivement, comprennent chacune 154 acides aminés avec 18 différences de séquence entre les deux. Soumises à une protéolyse à l’aide de la trypsine, ces protéines produisent deux ensembles de peptides, dont certains sont identiques, et d’autres qui présentent une ou plusieurs différences d’acides aminés spécifiques à l’espèce : les protéines correspondantes donnent donc naissance aux peptides correspondants.
L’approche CPCP cherche donc d’abord à identifier les protéines de deux espèces ou plus où ces protéines présentent des variantes de séquence spécifiques à l’espèce limitées. Ce sont des protéines correspondantes. Après la protéolyse, les protéines correspondantes donnent naissance à des peptides, dont certains présentent également des variantes de séquence spécifiques à l’espèce héritées de la protéine parente. Ce sont des peptides correspondants. L’approche CPCP peut être utilisée pour comparer les niveaux de deux protéines correspondantes dans un échantillon d’espèces mixtes en surveillant les niveaux de peptides correspondants.
La technologie naturelle pour la détection de peptides connus est la spectrométrie de masse à réaction multiple, ou MRM-MS7. Les peptides spécifiques à une espèce produisent des ions précurseurs qui, avec leurs ions fragments de spectrométrie de masse, sont facilement répertoriés à l’avance par des outils logiciels. Ces listes sont ensuite utilisées pour indiquer au spectromètre de masse d’enregistrer uniquement des paires spécifiques d’ions précurseurs et fragments, appelées transitions. Un peptide cible particulier est donc identifié non seulement par son temps de rétention dans la chromatographie précédant le spectromètre de masse, mais aussi par un ensemble de transitions partageant un ion précurseur commun. Il s’agit d’un moyen hautement sélectif de détecter des peptides connus qui utilise efficacement la ressource du spectromètre de masse.
D’autres auteurs ont utilisé la spectrométrie de masse pour tester l’adultération de la viande via des marqueurs peptidiques mais à partir de protéines disparates8-14. Cependant, l’utilisation du schéma CPCP (protéines et peptides correspondants) permet d’optimiser les conditions expérimentales, ce qui facilite l’identification des espèces dans le mélange à partir de transitions spécifiques connues aux espèces. De plus, les protéines et les peptides correspondants se comporteront généralement de la même manière dans les étapes d’extraction, de protéolyse et de détection. Étant donné que les aires de pics de transition sont quantitatives et reproductibles, les rapports des surfaces de pics résultant de paires de peptides correspondants d’espèces différentes fournissent une estimation directe des quantités relatives de deux viandes dans un mélange. En revanche, les voies de quantification plus traditionnelles exploitent des étalonnages basés sur des matériaux de référence pour établir une quantification absolue14,15.
Bien que le protocole soit décrit dans le contexte de la myoglobine et de la viande, des protéines autres que la myoglobine pourraient être utilisées pour l’identification et la quantification relative via la stratégie CPCP dans les mélanges de viande, mais potentiellement avec des modifications du protocole. De plus, la stratégie est également applicable aux mélanges binaires d’autres espèces partageant une ou plusieurs protéines correspondantes.
Le point de départ du protocole est la myoglobine de référence purifiée, qui peut être achetée pour certaines espèces mais qui pour d’autres doit être préparée par chromatographie d’exclusion stérique conventionnelle. La procédure de préparation de la myoglobine de référence n’est pas incluse dans le protocole, mais est décrite ailleurs3. Des outils logiciels16 sont utilisés pour répertorier les peptides candidats et les transitions résultant des myoglobines d’intérêt. Chaque myoglobine de référence est soumise à une protéolyse et les peptides résultants sont analysés par chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse en tandem à ionisation par électronébulisation (LC-ESI-MS/MS) afin de découvrir quels ions précurseurs et transitions candidats sont les plus utiles, et de déterminer les temps de rétention des peptides correspondants. Le résultat de cette étape est une liste révisée de peptides cibles avec leurs transitions, adaptée à la détermination des espèces, et une liste de paires CPCP, adaptée à la quantification relative. Pour tester de vraies viandes, des extractions d’échantillons sont préparées puis soumises à une protéolyse pour générer des peptides à partir de la myoglobine et d’autres protéines étrangères. Les peptides à base de myoglobine sont ensuite surveillés par LC-ESI-MS/MS en fonction de leurs transitions répertoriées. Les espèces présentes dans un mélange sont identifiées par les pics de transition associés aux peptides marqueurs. Les estimations des quantités relatives de deux viandes dans un mélange binaire sont calculées à l’aide des rapports des zones de pics de transition. Un ensemble de mélanges d’essai de paires de viandes permettra de vérifier et d’étalonner le rapport des aires de pics pour une paire donnée de transitions par rapport à des mélanges réels.
1. protéolyse et analyse de myoglobine référence
2. Préparation et analyse des échantillons d'étalonnage
3. Les échantillons de viande
Dans une expérience unique de MRM dynamique en mode chaque transition programmé est enregistré séparément (comme nombre de détecteurs par seconde, cps) sur une fenêtre de temps de rétention spécifié. Par conséquent, à partir de toutes les données collectées dans une expérience, le pic d'intensité pour chaque transition peut être extrait individuellement. Ensuite, le seul signal est fini pour la fenêtre de temps de rétention fixé à cette transition. En dehors de la fenêtre, le signal est nulle par définition. Le signal pour une transition, par exemple, 752 → 1269 de cheval (peptide monoisotopique masse 1,501.66 daltons, précurseur d' ions m / z 751.84 daltons état de charge = 2, un fragment d' ions y 13) a généralement pour concurrencer uniquement avec le bruit de mesure et non d'autres pics de transition qui pourrait peut-être d'autres espèces. La sortie est donc un ensemble de pics propres, un par transition, à un temps de rétention commun pour ces transitions partageant un ion précurseur commun.
figure 1 montre la sortie pour l'ensemble des quatre transitions 752 → (1269, 706, 248, 1366) pour un mélange de 1% p / p cheval dans la viande bovine. Depuis les quatre transitions affichées sont associées à cheval, et sont absents dans des échantillons de pur bœuf, d'agneau ou de porc, ces pics signifient la présence de cheval. Selon les critères de robustesse, un ensemble de deux ou plusieurs transitions dépassant chacun un certain signal spécifié au niveau de bruit établit l'identification. Ce chiffre établit donc la présence de cheval dans le mélange de 1% p / p cheval dans la viande bovine.
Parfois, une seule transition isolée est détectée. Cela indique un match de chance d'ion précurseur et un seul fragment, peut-être à partir d'une protéine étrangère, avec ceux attendus du système et programmé dans le spectromètre de masse. Le caractère singulier de la crête, et sa présence à un temps de rétention inattendu, est le signature d'une transition accidentelle qui peut être ignoré.
L'aire sous chaque pic de transition peut être calculée individuellement. À base d'un fragment approprié, le rapport du cheval dans les zones de pic de transition de la viande, par exemple, 752 → 1269 (cheval) à 767 → 1299 (bœuf), sera proportionnelle au rapport de la viande réelle dans le mélange. La figure 2 montre une parcelle de pourcentage en aire de pic pour ces deux transitions par rapport au poids en pourcentage du poids du cheval dans un mélange de cheval avec du boeuf. Si les zones de pic de transition de pourcentage correspondent au pourcentage de poids pour le poids de la viande, puis la pente est 1. La pente de cette parcelle est de 1,03, ce qui indique que, pour ces transitions et CPCP paire, les zones de transition de pointe donnent une mesure fiable des quantités relatives des deux viandes dans le mélange. Si la viande de cheval dans l'échantillon était deux fois plus riche que dans la myoglobine de la viande, puis, avec d'autres facteurs sans changement, la pente de la ligne serait supérieur à un.
Figure 1. intensités MRM de transition en fonction du temps de rétention pour 1% p / p cheval dans la viande bovine. Les transitions sont 752 → (1269, 706, 248, 1366), en orange, noir, bleu et vert, respectivement. Le peptide marqueur est HPGDFGADAQGAMTK. Les quatre fragments de transition peuvent être noté y 13, y 7, y 2 et y 14 respectivement, où y n désigne le comptage en n acides aminés de l' extrémité C-terminale du peptide. Le signal au bruit varie de 23 à 53 au cours des quatre transitions. Une ligne rouge supplémentaire représente la transition 752 → 1269 pour 0% de cheval, 100% de boeuf à titre de comparaison. Seule la région non nulle de la durée de rétention est affiché. Ce chiffre a été modifié depuis Watson et al. 3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Parcelle de cheval dans le bœuf, le poids pour cent pour le poids, par rapport à cheval dans le bœuf comme pour cent transition zone de pic. Le tracé utilise la paire de peptides de boeuf (767) et le cheval (752) et l'y 13 ion fragment pour les deux. Si A représente la surface du pic , puis l'ordonnée 100 A H / (A H + A B). La pente de la droite de meilleur ajustement (R 2 = 0,99) est de 1,03. Ce chiffre a été modifié depuis Watson et al. 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Nous présentons un protocole pour identifier et quantifier les composants dans des mélanges d’espèces possédant des protéines similaires. La spectrométrie de masse détecte les peptides pour l’identification et donne une quantification relative par des rapports de surfaces de pics. En tant qu’outil de détection des fraudes, la méthode peut détecter 1 % de cheval dans le bœuf.
Nous remercions le soutien financier des fonds de subvention stratégique de base de l’Institut de recherche sur l’alimentation, projet BBSRC BB/J004545/1.
| Base de données Uniprot | www.uniprot.org | Base de données de séquences de protéines | |
| Logiciel Skyline | www.skyline.gs.washington.edu | Logiciel gratuit à télécharger qui permet de créer des méthodes ciblées pour les études protéomiques, peptides et fragments pronostic ; | |
| Bicarbonate d’ammonium | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com | Méthanol O9830 | |
| , grade HPLC | Fisher Scientific, Loughoborough, Royaume-Uni www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acétonitrile, grade HPLC | Fisher Scientific, Loughoborough, Royaume-Uni www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsine (provenant de pancréas bovin traité avec TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Acide formique ; | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Homogénéisateur Ultra Turrax T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, Royaume-Uni www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Agitateur de laboratoire Edmund and Buhler KS10 Centrifugeuse | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifugeuse | à vide Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader Strata-X | |||
| 33u Cartouches polymères en phase inverse 60 mg/3 ml | tubes Phenomenex, Macclesfield, Royaume-Uni | Spectromètre de masse triple-quadripôle 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap | AB Sciex, Warrington, Royaume-Uni www.sciex.com | ||
| 1200 résolution rapide Système LC | Agilent, Stockport, Royaume-Uni | ||
| XB C18 colonne capillaire en phase inverse (100 mm x 2,1 mm, 2,6 & micro ; | Phenomenex, Macclesfield, Royaume-Uni www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 logiciel | AB Sciex, Warrington, Royaume-Uni www.sciex.com | Acquisition et analyse de données QTrap, y compris l’intégration de la zone | |
| de |
