Détermination des espèces et Quantification en mélanges utilisant la spectrométrie de masse MRM de Peptides appliquée à l'authentification de la viande

Résumé

Nous présentons un protocole pour identifier et quantifier les composants dans des mélanges d’espèces possédant des protéines similaires. La spectrométrie de masse détecte les peptides pour l’identification et donne une quantification relative par des rapports de surfaces de pics. En tant qu’outil de détection des fraudes, la méthode peut détecter 1 % de cheval dans le bœuf.

Résumé

Nous décrivons un protocole simple pour identifier et quantifier les deux composants dans des mélanges binaires d’espèces possédant une ou plusieurs protéines similaires. Au cœur de la méthode se trouve l’identification des « protéines correspondantes » dans l’espèce d’intérêt, en d’autres termes des protéines qui sont nominalement identiques mais qui possèdent des différences de séquence spécifiques à l’espèce. Lorsqu’elles sont soumises à la protéolyse, les protéines correspondantes donneront naissance à certains peptides qui sont également similaires, mais avec des variantes spécifiques à l’espèce. Il s’agit de « peptides correspondants ». Les peptides spécifiques à une espèce peuvent être utilisés comme marqueurs pour la détermination des espèces, tandis que les paires de peptides correspondants permettent la quantification relative de deux espèces dans un mélange. Les peptides sont détectés à l’aide de la spectrométrie de masse MRM (Multiple Reaction Monitoring), une technique très spécifique qui permet de déterminer les espèces à base de peptides, même dans des systèmes complexes. De plus, le rapport des surfaces de pic MRM dérivées des peptides correspondants soutient la quantification relative. Étant donné que les protéines et les peptides correspondants se comporteront, dans l’ensemble, de la même manière dans le traitement et dans l’extraction expérimentale et la préparation des échantillons, la quantification relative devrait rester relativement robuste. De plus, cette approche n’a pas besoin des étalons et des étalonnages requis par les méthodes de quantification absolue. Le protocole est décrit dans le contexte des viandes rouges, qui ont des protéines correspondantes pratiques sous la forme de leurs myoglobines respectives. Cette application est pertinente pour la détection de la fraude alimentaire : la méthode peut détecter 1 % poids pour poids de viande de cheval dans le bœuf. La quantification relative des protéines et des peptides correspondants (CPCP) à l’aide des rapports de surface des pics MRM donne de bonnes estimations de la composition poids/poids d’un mélange cheval et bœuf.

Introduction

Le scandale européen de la viande de cheval de 2013, au cours duquel de la viande de cheval non déclarée a été trouvée dans un certain nombre de produits à base de viande bovine de supermarché¹, souligne la nécessité de disposer de méthodes d’analyse capables de détecter et de mesurer la fraude alimentaire dans la viande. Plusieurs technologies ont été explorées, notamment l’immuno-enzymatique (ELISA) et les méthodes basées sur l’ADN². Une autre voie, basée sur la spectrométrie de masse, cible les peptides spécifiques à l’espèce qui proviennent à leur tour de protéines spécifiques à l’espèce. Nous décrivons ici une telle approche basée sur les peptides qui offre à la fois l’identification et la quantification relative de l’espèce adultérante dans un mélange de viande³.

Le protocole s’inscrit dans le contexte des viandes rouges et de la volonté de déterminer la présence de l’une chez l’autre à l’échelle de 1 % en poids, niveau considéré par certains comme représentant une falsification frauduleuse des aliments par opposition à une contamination⁴. La méthode repose en premier lieu sur l’identification d’une protéine qui est nominalement « la même » dans toutes les viandes cibles. La myoglobine, la protéine responsable de la couleur rouge de la viande, est un bon candidat car elle est abondante, relativement tolérante à la chaleur et soluble dans l’eau, et a été utilisée pour la détermination de l’espèce de la viande auparavant^5,6. Les myoglobines du bœuf (Bos Taurus), du porc (Sus scrofa), du cheval (Equus caballus) et de l’agneau (Ovis aries)³, par exemple, sont nominalement les mêmes, selon les besoins, mais leurs séquences ne sont pas identiques. De tels groupes de protéines « similaires mais différentes », comme ces quatre myoglobines, peuvent commodément être décrits comme des « protéines correspondantes ». Les différences de séquence dans ces quatre myoglobines sont spécifiques à l’espèce : par exemple, les protéines de myoglobine complètes pour le bœuf et le cheval, P02192 et P68082 respectivement, comprennent chacune 154 acides aminés avec 18 différences de séquence entre les deux. Soumises à une protéolyse à l’aide de la trypsine, ces protéines produisent deux ensembles de peptides, dont certains sont identiques, et d’autres qui présentent une ou plusieurs différences d’acides aminés spécifiques à l’espèce : les protéines correspondantes donnent donc naissance aux peptides correspondants.

L’approche CPCP cherche donc d’abord à identifier les protéines de deux espèces ou plus où ces protéines présentent des variantes de séquence spécifiques à l’espèce limitées. Ce sont des protéines correspondantes. Après la protéolyse, les protéines correspondantes donnent naissance à des peptides, dont certains présentent également des variantes de séquence spécifiques à l’espèce héritées de la protéine parente. Ce sont des peptides correspondants. L’approche CPCP peut être utilisée pour comparer les niveaux de deux protéines correspondantes dans un échantillon d’espèces mixtes en surveillant les niveaux de peptides correspondants.

La technologie naturelle pour la détection de peptides connus est la spectrométrie de masse à réaction multiple, ou MRM-MS⁷. Les peptides spécifiques à une espèce produisent des ions précurseurs qui, avec leurs ions fragments de spectrométrie de masse, sont facilement répertoriés à l’avance par des outils logiciels. Ces listes sont ensuite utilisées pour indiquer au spectromètre de masse d’enregistrer uniquement des paires spécifiques d’ions précurseurs et fragments, appelées transitions. Un peptide cible particulier est donc identifié non seulement par son temps de rétention dans la chromatographie précédant le spectromètre de masse, mais aussi par un ensemble de transitions partageant un ion précurseur commun. Il s’agit d’un moyen hautement sélectif de détecter des peptides connus qui utilise efficacement la ressource du spectromètre de masse.

D’autres auteurs ont utilisé la spectrométrie de masse pour tester l’adultération de la viande via des marqueurs peptidiques mais à partir de protéines disparates^8-14. Cependant, l’utilisation du schéma CPCP (protéines et peptides correspondants) permet d’optimiser les conditions expérimentales, ce qui facilite l’identification des espèces dans le mélange à partir de transitions spécifiques connues aux espèces. De plus, les protéines et les peptides correspondants se comporteront généralement de la même manière dans les étapes d’extraction, de protéolyse et de détection. Étant donné que les aires de pics de transition sont quantitatives et reproductibles, les rapports des surfaces de pics résultant de paires de peptides correspondants d’espèces différentes fournissent une estimation directe des quantités relatives de deux viandes dans un mélange. En revanche, les voies de quantification plus traditionnelles exploitent des étalonnages basés sur des matériaux de référence pour établir une quantification absolue^14,15.

Bien que le protocole soit décrit dans le contexte de la myoglobine et de la viande, des protéines autres que la myoglobine pourraient être utilisées pour l’identification et la quantification relative via la stratégie CPCP dans les mélanges de viande, mais potentiellement avec des modifications du protocole. De plus, la stratégie est également applicable aux mélanges binaires d’autres espèces partageant une ou plusieurs protéines correspondantes.

Le point de départ du protocole est la myoglobine de référence purifiée, qui peut être achetée pour certaines espèces mais qui pour d’autres doit être préparée par chromatographie d’exclusion stérique conventionnelle. La procédure de préparation de la myoglobine de référence n’est pas incluse dans le protocole, mais est décrite ailleurs³. Des outils logiciels¹⁶ sont utilisés pour répertorier les peptides candidats et les transitions résultant des myoglobines d’intérêt. Chaque myoglobine de référence est soumise à une protéolyse et les peptides résultants sont analysés par chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse en tandem à ionisation par électronébulisation (LC-ESI-MS/MS) afin de découvrir quels ions précurseurs et transitions candidats sont les plus utiles, et de déterminer les temps de rétention des peptides correspondants. Le résultat de cette étape est une liste révisée de peptides cibles avec leurs transitions, adaptée à la détermination des espèces, et une liste de paires CPCP, adaptée à la quantification relative. Pour tester de vraies viandes, des extractions d’échantillons sont préparées puis soumises à une protéolyse pour générer des peptides à partir de la myoglobine et d’autres protéines étrangères. Les peptides à base de myoglobine sont ensuite surveillés par LC-ESI-MS/MS en fonction de leurs transitions répertoriées. Les espèces présentes dans un mélange sont identifiées par les pics de transition associés aux peptides marqueurs. Les estimations des quantités relatives de deux viandes dans un mélange binaire sont calculées à l’aide des rapports des zones de pics de transition. Un ensemble de mélanges d’essai de paires de viandes permettra de vérifier et d’étalonner le rapport des aires de pics pour une paire donnée de transitions par rapport à des mélanges réels.

Protocole

1. protéolyse et analyse de myoglobine référence

1. Protéolyse de la myoglobine de référence
   1. Préparer des solutions des myoglobine de référence purifiées (intervalle 0,2 à 0,5 mg / ml dans 25 mM de bicarbonate d' ammonium) ^3.
   2. Transfert 1 ml aliquotes de chaque échantillon à 2 ml tubes de centrifugeuse.
   3. la dénaturation thermique des protéines extraites par chauffage de l'échantillon dans un bloc chauffant à 95 ° C pendant 30 min. Refroidir l'échantillon pendant environ 15 min jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante. Ajouter 30 mg d'urée (concentration finale 0,5 M) pour améliorer la digestion, puis mélanger.
2. protéolyse tryptique
   1. Préparer une solution à 1 mg / ml de trypsine dans 25 mM de bicarbonate d'ammonium et de stocker de la glace, au besoin. Ajouter un volume suffisant de trypsine de telle sorte que l'activité enzymatique finale est de 420 BAEE (benzoyl-L-arginine N - chlorhydrate de l' ester éthylique) unités / mg de protéine extraite, puis mélanger par tourbillonnement doux et laisser une nuit à 3 proteolyze7 ° C.
   2. Effectuer dodécylsulfate de sodium polyacrylamide sulfate électrophorèse sur gel (SDS-PAGE) ¹⁷ pour démontrer l'exhaustivité de la protéolyse.
3. Dessalement de l'échantillon post-protéolyse
   1. Diluer l'échantillon 1: 2 v: v avec de l'eau.
   2. Activer un polymère à phase inverse (RP), la cartouche remplie d'un matériau RP 30 mg en ajoutant 1 ml de methanol, puis équilibrer la cartouche en ajoutant de l'acide formique à 1 ml de 1%.
   3. Chargez l'échantillon sur la cartouche par gravité.
   4. Laver avec 1 ml d'acide formique à 5% de méthanol / 1% par gravité.
   5. Eluer les peptides avec 1 ml d'acétonitrile / eau (90:10 v: v; acide formique à 0,1%) par gravité dans 2 ml microtubes préremplies avec 5 pi de diméthylsulfoxyde (DMSO).
   6. On élimine le solvant sous vide à 50 ° C en utilisant un évaporateur centrifuge pendant 120 minutes, puis on redissout le résidu dans 250 ul d'acétonitrile / eau (3:97 volume: volume, 0,1% d'acide formique).
   7. Transfertla solution à un faible volume du flacon auto-échantillonneur.
      Note: les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'au moment de liquide spectrométrie de masse par Chromatographie (LC / MS) analyse.
4. Génération de listes de transition pour MRM
   1. Repérez les séquences de myoglobine pour les différentes viandes de la base de données UniProt.
   2. Entrez les séquences de myoglobine dans la case «cible» du logiciel de prédiction peptide et de transition (par exemple, Skyline). Si nécessaire, passez la souris sur un peptide de révéler sa liste de fragment.
   3. Cliquez sur «Paramètres» et sélectionnez «Peptide Settings». Entrez les préférences pour la digestion (ie, trypsine) et le nombre de clivages manqués (0). Valider la sélection requise pour d'autres paramètres, en particulier, la longueur du peptide (6-25), les exclusions N-terminaux (0) et pris en charge les modifications d'acides aminés (aucun).
   4. Cliquez sur "Paramètres" et sélectionnez "Paramètres de transition». Sélectionnez les préférences pourle type d'instrument utilisé pour l'analyse LC / MS.
   5. Cliquez sur "Exporter" et sélectionnez "Liste de transition» pour créer une feuille de calcul contenant les transitions et les paramètres de GRM générés.
5. Analyse par LC / MS
   1. Mettre en place un système de gradient binaire (eau (A) et de l'acétonitrile (B), chacun avec 0,1% formique v d'acide: v) chromatographe liquide à haute performance (CLHP) avec échantillonneur automatique, colonne C18 core shell HPLC (10 cm x 2,1 mm , 2,6 um de taille de particules) connectée à un spectromètre de masse triple quadripolaire fonctionnant en mode électrospray positif avec détection de MRM.
   2. Dans le logiciel de collecte de données (par exemple, analyste), sélectionnez "Fichier" et "Nouveau" et cliquez sur «Méthode d' acquisition» dans la boîte de pop-up , puis cliquez sur 'OK'.
      Note: Ceci ouvre l'instrument éditeur de méthode, qui contient une liste des appareils connectés qui permettront la mise en place d'une nouvelle méthode / MS LC.
   3. Cliquez sur 'pompe binaire' et input la valeur de débit (300 pi / min) et les temps de gradient dans le tableau, établissant un profil de gradient binaire de 3% de B à 30% B plus de 22 min, augmentant à 100% de B à 23 min pour un 5 min lavent avant de revenir aux conditions initiales et rééquilibration pendant encore 6 min.
   4. Cliquez sur 'Autosampler' et insérez le volume d'injection (5 pi). Activer le «Needle Cycle de lavage» et entrer dans le «Wash Time» (30 sec) et sélectionnez «Port Flush».
   5. Cliquez sur 'Contrôleur de colonne thermostaté' et dans 'la colonne Four Properties' définir la «Température Gauche» et «Température droite» (40 ° C).
   6. Cliquez sur 'Mass Spectrometer »puis cliquez sur« Modifier les paramètres »pour entrer dans les conditions de gaz de source. Sélectionnez le «Type de numérisation» comme «MRM (MRM)» et le «Polarité» comme «positive». Aller à 'Résumé Période' et entrez le 'Durée Time', la durée totale de la LC analyse und équilibration (35 min).
   7. Dans le tableau clic droit et sélectionnez 'Declustering potentiel (DP) »et« Collision Energy (CP) "pour ajouter ces colonnes à la table. Entrez les Q1, Q3, Time (msec), ID, les valeurs DP et CE pour toutes les transitions, pour une seule espèce de viande, créé dans la liste de transition (voir étape 1.4.5).
      Note: Temps (ms) correspond à la durée de séjour, la durée du spectromètre de masse passe le balayage de chaque passage, la somme qui ne doit pas être supérieure à 3 secondes.
   8. Enregistrez le fichier Méthode d'acquisition (extension de fichier .dam).
      Remarque: Les étapes 1.5.2 - 1.5.8 doivent être répétées pour chaque espèce de viande. Cela va créer un fichier de méthode unique pour chaque espèce de viande en mode écran en préparation pour l'analyse ci-dessous.
   9. Dans le logiciel de collecte de données, cliquez sur «Acquire» et sélectionnez «Equilibrer». Dans la boîte qui apparaît, sélectionnez la méthode d'acquisition requise pour commencer l'équilibration de l'instrument.
   10. Mettez les flacons d'échantillon dans arack dans l'échantillonneur automatique.
   11. Cliquez sur "Fichier" et sélectionner "Nouveau" puis "Batch Acquisition». Dans l'onglet 'Sample' select 'Ajouter Set' puis 'Ajouter des échantillons ». Insérer le nombre d'échantillons à analyser et cliquez sur 'OK'. Dans la case "Acquisition", sélectionnez le fichier de la méthode qui sera utilisée pour l'analyse à partir du menu déroulant.
   12. Dans le tableau, sélectionnez «Code de la plaque» et sélectionnez la configuration du bac approprié dans le menu déroulant. Clic gauche dans la 'Plate code' en-tête de colonne, puis cliquez à droite et sélectionnez 'Fill Down'. Dans 'Position Vial' entrer dans la position de chaque échantillon dans l'échantillonneur automatique dans les lignes.
   13. Dans «Fichier de données 'entrer le nom du fichier pour l'acquisition, cliquez sur puis à gauche dans l'entête de la colonne suivie par un clic droit et sélectionnez' Fill Down '. Dans 'Sample Name' insérer l'identité de chacun des échantillons à analyser. Enregistrer en tant que fichier d'acquisition de lots (fichier extension .dab).
   14. Cliquez sur l'onglet «Soumettre» puis sélectionnez les échantillons qui doivent être analysés sur la LC / MS. Cliquez sur «Soumettre». Cliquez sur 'acquérir' et 'Start Sample "pour commencer l'analyse.
       Note: Chaque méthode d'acquisition numérise les transitions MRM sur toute la longueur du chromatographe pour une seule espèce de viande. paramètres du spectromètre de masse pour une acquisition MRM varient selon le type d'instrument et peptide.
   15. Voir les fichiers de données générés en utilisant un logiciel de visualisation de données. Cliquez sur XIC (ions extraits) et dans la liste déroulante en surbrillance tous les fragments (valeurs de Q3) pour un seul précurseur (Q1). Un nouveau volet ouvert qui montre que les transitions sélectionnées.
   16. Enregistrer le temps de rétention (R _t) pour les groupes de transitions simultanées étant donné que ceux - ci correspondent à un seul peptide.
   17. Répétez les deux étapes précédentes pour chaque ensemble de transitions afin d'attribuer les pics à leurs peptides respectifs pour chaquedes espèces de viande.
   18. Notez les peptides marqueurs qui sont appropriés pour fournir l' identification des espèces (par exemple, peptide HPGDFGADAQGAMTK, précurseur m / z = 752, R _t = 12,0 min, pour le cheval), ainsi que leurs temps de rétention, et notez qui forment des paires appropriées pour la quantification relative correspondant .
       Remarque: Par exemple, le peptide marqueur de cheval (précurseur m / z = 752) présente un peptide de boeuf correspondant HPSDFGADAQAAMSK (précurseur m / z = 767, _Rt = 13,2 min).
   19. Afin de créer une méthode dynamique unique englobant toutes les espèces de viande, dans le logiciel de visualisation de données, pour chaque espèce de viande, à son tour, ouvrir les données de transition XIC pour chaque précurseur (attribué à un peptide particulier 1.5.8).
   20. Zoom sur le cluster de pointe au moment de rétention sélectionnée par un clic gauche et en faisant glisser le curseur sous le cluster. Identifier les transitions les plus intenses (par un clic droit sur l'étiquette de pointe).
   21. enregistrer manuellement les transitionset des temps de rétention dans une feuille de calcul.
   22. Pour entrer les paramètres comme une nouvelle méthode dynamique sur le logiciel / MS LC, cliquez sur «Mass Spectrometer» puis cliquez sur «Modifier les paramètres» pour entrer dans les conditions de gaz de source. Sélectionnez le «Type de numérisation» comme «MRM (MRM)» et le «Polarité» comme «positive».
   23. Aller à 'Résumé de la période "et entrez le temps de la durée (définie comme le temps total pour l'analyse LC et équilibration). Dans le tableau clic droit et sélectionnez 'Declustering potentiel (DP) »et« Collision Energy (CP) "pour ajouter ces colonnes à la table.
       Remarque: La colonne «Time» désigne maintenant le temps de rétention attendu (min) pour chaque transition.
   24. Dans la section "Modifier les paramètres de la / MS logiciel de collecte de données de LC, cochez la case« planifiée MRM ». Entrez le Q1, Q3, Temps (min), ID, les valeurs DP et CE pour les transitions créées dans la feuille de calcul (1.5.21) et enregistrez la méthode d'acquisition (file l'extension .dam).
       Remarque: Cette méthode réduit typiquement le nombre de transitions MRM à 4 la plus intense pour chaque peptide et numérise uniquement à travers la fenêtre de temps de rétention de chaque pic de peptide, ce qui donne une sensibilité améliorée et la qualité des données. Une méthode «dynamique» est une méthode «de rétention guidée temps fenêtrage», parfois appelé ordonnancement.

2. Préparation et analyse des échantillons d'étalonnage

1. Extraction des mélanges à base de viande
   1. Utilisation de la viande préalablement congelé puis broyé en une poudre, préparer une gamme de mélanges de viande par pesée des quantités respectives de la viande (masse totale d'environ 300 mg) dans 15 ml tubes en plastique de centrifugeuse.
   2. Ajouter 4 ml de tampon d'extraction (0,15 M de chlorure de potassium + 0,15 M de tampon phosphate à pH 6,5). Vortex pendant 30 secondes. Extrait sur un agitateur de laboratoire à température ambiante pendant 2 h à 250 cycles / min.
      Note: Cycles / min se réfère à un mouvement oscillatoire.
   3. Transférer 2 ml deextrait dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml. Centrifuger pendant 5 min à 4 ° C à 17000 x g.
   4. Transfert 200 aliquotes du surnageant (réservant une petite quantité pour le dosage de la protéine, voir 2.2) dans 2 ml des tubes de centrifugeuse et sec en utilisant un évaporateur centrifuge (programme pré-établi: 50 ° C, sans ventilation et min durée 120).
2. Dosage protéique
   1. Transfert 7 aliquotes du surnageant réservé (voir 2.1.4), en triple exemplaire dans les puits d'une plaque de 96 puits.
   2. Transfert 7 aliquotes d'une série d'étalons de protéine, en triple exemplaire, la gamme de 0 à 1,0 mg / ml de sérum-albumine bovine (SAB), dans la même plaque à 96 puits.
   3. Ajouter 200 ul de Coomassie ainsi que le dosage de protéines de réactif dans chaque puits.
   4. comparer visuellement la couleur des puits d'échantillons avec les normes de protéines pour vérifier les échantillons sont dans la gamme des normes d'étalonnage. Si nécessaire, répéter avec l'échantillon dilué de sorte qu'il devient à portée.
   5. Laissez la plaque à stet pendant 3 min.
   6. Éclater les bulles qui se sont formées avec une aiguille hypodermique.
   7. Analyser la plaque sur le lecteur de plaque en utilisant un protocole de point de terminaison standard à une longueur d'onde de 595 nm.
   8. Déterminer la concentration en protéines des échantillons en utilisant les données d'étalonnage des étalons protéiques.
      Note: Ceci est nécessaire pour le calcul de la quantité de trypsine utilisée dans la digestion par la trypsine.
3. Protéolyse des mélanges à base de viande
   1. Redissoudre le résidu séché de l'étape 2.1.4 dans 1 ml de solution de bicarbonate d'ammonium 25 mM. Bien mélanger sur un rotamixer.
   2. Suivre le protocole de l'étape 1.1.3 à 1.3.7.
4. Analyse par LC / MS
   1. Mettre en place la LC / MS comme précédemment (étape 1.5.1).
   2. Créer un nouveau lot d'acquisition comme indiqué précédemment (étapes 1.5.9 - 1.5.14), la sélection de la méthode d'acquisition créé à l'étape au 1.5.24 qui utilise une LC dynamique / méthode MS combinant toutes les espèces de viande, et d'acquérir les données pour les Digeséchantillons de viande ted.
   3. Afficher le chromatogramme complète dans le logiciel de visualisation de données. Afficher la XIC pour chaque transition fixé à son tour. Visuellement confirmer chaque cluster contient le nombre requis de pics en forme de cloche au temps de rétention prévu, confirmant ainsi l'existence du peptide sélectionné.
   4. Effectuer la quantification en utilisant les données de visualisation logiciel pour intégrer les zones de pointe pour chacune des transitions d'intérêt en double-cliquant sur 'Build Quantification Method »dans la barre de navigation.
   5. Dans le volet "Select Sample", sélectionnez le «Fichier de données» et «échantillon» à analyser pour générer une table 'analytes'.
   6. Cliquez sur l'onglet «Intégration» pour afficher la première des transitions (analytes) pour être intégré.
   7. Cliquez sur la boîte "Analyte" pour afficher la liste déroulante des transitions vers le bas. Sélectionnez chaque transition à son tour pour l'afficher et de confirmer visuellement le bon pic est sélectionné pour l'intégration. À Modifier ou forcer l'intégration, clic gauche et faites glisser le curseur sur le pic de cible (ce sera surligné en vert). Cliquez sur le bouton 'Select Peak' et cliquez sur «Appliquer».
   8. Enregistrer l'espace de travail sous forme de fichier de la méthode (de .qmf).
      Note: Ceci crée un fichier Quantification Méthode pour le calcul ultérieur des zones de pic de l'échantillon.
   9. Double cliquez sur «Quantification Assistant» dans la barre de navigation. Dans la fenêtre «Sélectionner des échantillons 'créer' Quantification Set 'en sélectionnant un seul« Fichier de données', puis un ou plusieurs «échantillons disponibles». Sélectionnez 'Next' pour afficher 'Sélectionnez Paramètres et requêtes "boîte. Laisser avec les valeurs par défaut, sélectionnez «Suivant» pour afficher «Sélectionner la méthode '. Dans le menu déroulant case «Méthode» sélectionner le fichier «Méthode d'intégration» créé à l'étape 2.4.8, puis sélectionnez «Terminer».
      Note: Ceci crée un «Tableau des résultats», y compris les surfaces des pics de transition liés à des mélanges à base de viande.
   10. Save the 'Résultats Table' (extension de fichier .rdb), l'exportation sous forme de fichier texte (.txt) et l'ouvrir dans un tableur pour examiner les données.
   11. graphiques de tracé de pourcentage (par la transition zone de crête) d'une viande dans un autre par rapport au pourcentage mesuré (p / p) des deux viandes pour le MRM sélectionné pour les transitions sélectionnées à partir de peptides correspondant, en se concentrant sur les cas où les deux fragments contiennent le même nombre d'acides aminés comptés à partir de l'extrémité C-terminale.
       Remarque: fragments identiques avec des sites de fragmentation identiques donnent des résultats optimaux.
   12. Examiner les parcelles de 2.4.11 ci-dessus. Soit visuellement, ou en utilisant un outil de ligne de tendance dans le paquet de tracé, d'identifier un groupe de parcelles qui sont à la fois linéaire et de gradient similaire. Utiliser un ou plusieurs de ces CPCP ainsi que des combinaisons de fragments d'étalonnage dans les échantillons de viande réel.
       Note: Un graphique montrant un gradient inhabituel peut indiquer soit peptide ou la suppression de fragment avec une réduction conséquente du signal strength. parcelles non-linéaires peuvent indiquer la détection de crête pauvres ou d'autres problèmes.

3. Les échantillons de viande

1. Extraction de protéines à partir d'échantillons de viande cible
   1. Le cas échéant, l'accise étrangère matériau non-viande de l'échantillon à l'aide d'une spatule. Par exemple, gratter la sauce et les pâtes d'une lasagne fraîche.
   2. Peser 20 g de la viande dans un récipient en métal.
   3. Ajouter 100 ml de 0,15 M de chlorure de potassium / tampon 0,15 M de potassium à un pH de 6,5 monophosphate.
   4. Extraire les protéines par mélange de la viande dans un homogénéisateur à grande vitesse pendant 1 min.
   5. Suivre le protocole de l'étape 2.1.4 - 2.3.2.
2. L'analyse des échantillons par LC / MS
   1. Répétez l'étape 2.4.2 pour acquérir des données en utilisant la méthode de LC dynamique / MS.
   2. Identifier les peptides de chaque myoglobine de viande effectuée à l'étape 2.4.3.
   3. Pour la quantification, en utilisant le logiciel de quantification pour intégrer les aires des pics pour chaque transition d'intérêt,comme indiqué à l'étape 2.4.9.
   4. Pour l'identification des espèces dans un mélange, enregistrer ces peptides marqueurs répondant à des critères convenus pour le nombre de transitions et de signaler au bruit pour les transitions.
   5. Pour la quantification, utiliser des zones de transition de pointe intégrées, comme convenu à l'étape 2.4.12 et, en utilisant pourcentage en aire de transition de pointe, calculer le pourcentage de la myoglobine des deux espèces dans le mélange.
   6. Utiliser la connaissance préalable de la littérature ¹⁸ des niveaux de myoglobine probables dans la viande afin d' estimer les quantités relatives p / p de deux viandes présentes dans l'échantillon.

Résultats

Dans une expérience unique de MRM dynamique en mode chaque transition programmé est enregistré séparément (comme nombre de détecteurs par seconde, cps) sur une fenêtre de temps de rétention spécifié. Par conséquent, à partir de toutes les données collectées dans une expérience, le pic d'intensité pour chaque transition peut être extrait individuellement. Ensuite, le seul signal est fini pour la fenêtre de temps de rétention fixé à cette transition. En dehors de la fenêtre, le signal est nulle par définition. Le signal pour une transition, par exemple, 752 → 1269 de cheval (peptide monoisotopique masse 1,501.66 daltons, précurseur d' ions m / z 751.84 daltons état ​​de charge = 2, un fragment d' ions y ¹³⁾ a généralement pour concurrencer uniquement avec le bruit de mesure et non d'autres pics de transition qui pourrait peut-être d'autres espèces. La sortie est donc un ensemble de pics propres, un par transition, à un temps de rétention commun pour ces transitions partageant un ion précurseur commun.

figure 1 montre la sortie pour l'ensemble des quatre transitions 752 → (1269, 706, 248, 1366) pour un mélange de 1% p / p cheval dans la viande bovine. Depuis les quatre transitions affichées sont associées à cheval, et sont absents dans des échantillons de pur bœuf, d'agneau ou de porc, ces pics signifient la présence de cheval. Selon les critères de robustesse, un ensemble de deux ou plusieurs transitions dépassant chacun un certain signal spécifié au niveau de bruit établit l'identification. Ce chiffre établit donc la présence de cheval dans le mélange de 1% p / p cheval dans la viande bovine.

Parfois, une seule transition isolée est détectée. Cela indique un match de chance d'ion précurseur et un seul fragment, peut-être à partir d'une protéine étrangère, avec ceux attendus du système et programmé dans le spectromètre de masse. Le caractère singulier de la crête, et sa présence à un temps de rétention inattendu, est le signature d'une transition accidentelle qui peut être ignoré.

L'aire sous chaque pic de transition peut être calculée individuellement. À base d'un fragment approprié, le rapport du cheval dans les zones de pic de transition de la viande, par exemple, 752 → 1269 (cheval) à 767 → 1299 (bœuf), sera proportionnelle au rapport de la viande réelle dans le mélange. La figure 2 montre une parcelle de pourcentage en aire de pic pour ces deux transitions par rapport au poids en pourcentage du poids du cheval dans un mélange de cheval avec du boeuf. Si les zones de pic de transition de pourcentage correspondent au pourcentage de poids pour le poids de la viande, puis la pente est 1. La pente de cette parcelle est de 1,03, ce qui indique que, pour ces transitions et CPCP paire, les zones de transition de pointe donnent une mesure fiable des quantités relatives des deux viandes dans le mélange. Si la viande de cheval dans l'échantillon était deux fois plus riche que dans la myoglobine de la viande, puis, avec d'autres facteurs sans changement, la pente de la ligne serait supérieur à un.

Figure 1. intensités MRM de transition en fonction du temps de rétention pour 1% p / p cheval dans la viande bovine. Les transitions sont 752 → (1269, 706, 248, 1366), en orange, noir, bleu et vert, respectivement. Le peptide marqueur est HPGDFGADAQGAMTK. Les quatre fragments de transition peuvent être noté y ^13, y ^7, y ² et y ¹⁴ respectivement, où y ⁿ désigne le comptage en n acides aminés de l' extrémité C-terminale du peptide. Le signal au bruit varie de 23 à 53 au cours des quatre transitions. Une ligne rouge supplémentaire représente la transition 752 → 1269 pour 0% de cheval, 100% de boeuf à titre de comparaison. Seule la région non nulle de la durée de rétention est affiché. Ce chiffre a été modifié depuis Watson et al. ^3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Parcelle de cheval dans le bœuf, le poids pour cent pour le poids, par rapport à cheval dans le bœuf comme pour cent transition zone de pic. Le tracé utilise la paire de peptides de boeuf (767) et le cheval (752) et l'y ¹³ ion fragment pour les deux. Si A représente la surface du pic , puis l'ordonnée 100 A _H / (A _H + A _B). La pente de la droite de meilleur ajustement (R ² = 0,99) est de 1,03. Ce chiffre a été modifié depuis Watson et al. ^3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La sélection d'une protéine cible appropriée est importante. Une bonne protéine cible a besoin d'avoir des formes correspondantes en espèces d'intérêt, la variation de séquence dépendant de l'espèce suffisante, la spécificité de l'espèce, et existent en quantités accessibles dans les organismes. Pour l'évaluation des mélanges qui ont subi un traitement (par exemple, le traitement thermique), une protéine ayant une séquence relativement insensible à ce que le traitement est souhaitable. Myoglobine est un bon candidat pour les viandes rouges, y compris les viandes rouges cuites, mais pas la seule possibilité. Une fois que la protéine cible est déterminée, la partie la plus critique du protocole est la protéolyse de la protéine. Une protéine différente de myoglobine peut bien exiger un protocole de protéolyse alternative.

Le protocole tel que décrit comprend un segment sur la base de référence protéine purifiée. Cela a pour but de découvrir la rétention des fenêtres de temps et d'ions précurseurs et fragments appropriés. Ce segment est très utile mais pas indispensable.

Bien que des paires de peptides correspondantes de deux espèces d'intérêt peuvent être énumérés, même sans expérience, il est parfois le cas où une différence de séquence a des conséquences dramatiques sur le profil de digestion. Par exemple, la paire de peptide VLGFHG (bœuf) et ELGFQG (cheval) donnent un résultat de quantification anormale (manifeste comme un gradient inférieur à celui de la figure 2). En effet, le dernier peptide provient d'un clivage KE relativement supprimée, ce qui provoque une sous-estimation du niveau de cheval dans le mélange. peptides correspondants à partir de différents acides aminés sont donc à éviter. Souvent, les fragments de deux peptides correspondants ont des séquences d'acides aminés et sont bien comportés, mais ce n'est pas toujours le cas et doit être vérifiée au cours du développement de la méthode. L'identification des espèces est beaucoup moins sensible à ces questions que la quantification relative.

Le protocole a été démontrée pendant quatre viandes rouges³ s. espèces de viande supplémentaires peuvent être inclus, mais la qualité de la forme du pic de transition peut se détériorer si trop de peptides marqueurs co-éluent, réduisant le temps de séjour et, finalement, dégradant les estimations relatives de quantification. L'amélioration de l'instrumentation, déjà disponible, permettra d'améliorer cela. Une question connexe est que toutes les viandes ont des myoglobine. Par exemple, le cheval, l'âne et la myoglobine zébrées sont identiques et donc à proprement parler de la méthode est seulement capable de détecter cheval ou âne ou zèbre dans la viande bovine. Dans certains cas, même si la myoglobine ne sont pas identiques, certains peptides clés peuvent être. Par exemple, certains peptides marqueurs agneau myoglobine dérivé apparaissent également chez la chèvre.

Une complication face à ceci et toute autre méthode de quantification à base de protéines est que le niveau de la protéine doit être supposé constant dans toutes les espèces si les niveaux de protéine ou de peptide sont d'assimiler trivialement à des niveaux de viande en mélange. Pour la myoglobine et les quatre rouge mmange ce n'est pas universellement vrai. Les niveaux en général sont des espèces dépendantes, avec du porc présentant le niveau le plus bas des quatre. En outre, le niveau de myoglobine varie avec la coupe de viande et de l'âge des animaux. Donc, bien que des rapports de zones de pic de transition carte de manière fiable à des ratios de myoglobine, le mappage ratio des viandes réelles est un dessin d'estimation sur des hypothèses concernant les sources probables des viandes dans le mélange.

L'approche décrite dans ce travail diffère dans un certain nombre de façons d'autres contributions publiées. Une route plus typique est d'utiliser des méthodes protéomiques pour identifier divers peptides marqueurs disparates espèces dépendantes, dans ce cas , les marqueurs pour les différentes espèces possèdent pas de relation particulière avec l'autre ^8-12,14,19. En revanche, nous avons sélectionné des protéines communes à toutes les espèces d'intérêt jusqu'à des espèces dépendantes des variants de séquence ^3. En plus d'être le centre de notre stratégie par rapport à la quantification, ceci présente l'avantage que l'échantillonles stratégies de préparation peuvent être optimisés. En outre, ces protéines correspondantes sont susceptibles de se comporter de façon similaire, par exemple, dans l'extraction ou la transformation commerciale d'échantillons, tels que la cuisson ou la mise en conserve. L'identification des espèces procède alors normalement via la détection de peptides marqueurs disparates, alors que dans l'approche CPCP identification des espèces produit via la détection de peptides étroitement apparentés qui possèdent généralement une ou deux différences de séquence. Enfin, la quantification des protéines pour estimer le pour cent en poids d'une espèce à une autre peut procéder classiquement par l' intermédiaire d'une quantification absolue de chaque protéine basée sur des standards connus séparément ^7,14,15. Cependant, l'utilisation de la méthode de CPCP il n'y a pas besoin de méthodes d'étalonnage. Au lieu de cela, les niveaux relatifs sont estimés en comparant les intensités de signal des deux peptides correspondants des deux espèces, sans passer par l'étape de mesure absolue au total. Étant donné que le but ultime est un pourcentage en poids d'une espèce dans another, une quantification relative, le CPCP est à la fois plus directe et plus simple que de comparer deux mesures de quantification absolue. Ces caractéristiques se traduisent par des courts expérimentaux, prévus pour être environ deux heures en utilisant des protocoles raffinés, ce qui rend la technique utile comme outil de surveillance rapide dans le domaine de la détection des fraudes alimentaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Base de données Uniprot	www.uniprot.org		Base de données de séquences de protéines
Logiciel Skyline	www.skyline.gs.washington.edu		Logiciel gratuit à télécharger qui permet de créer des méthodes ciblées pour les études protéomiques, peptides et fragments pronostic  ;
Bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com	Méthanol O9830
, grade HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Royaume-Uni www. fisher.co.uk	10674922
Acétonitrile, grade HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Royaume-Uni www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com	U5378
Trypsine (provenant de pancréas bovin traité avec TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com	T1426
Acide formique  ;	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Protein standard	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Royaume-Uni www.sigmaaldrich.com	P0914
Homogénéisateur Ultra Turrax T25	Fisher Scientific, Loughoborough, Royaume-Uni www. fisher.co.uk	13190693
Agitateur de laboratoire Edmund and Buhler KS10 Centrifugeuse
Heraeus Fresco 17 Centrifugeuse	à vide Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
RC 1022	Jouan
Plate Reader Strata-X
33u Cartouches polymères en phase inverse 60 mg/3 ml	tubes Phenomenex, Macclesfield, Royaume-Uni	Spectromètre de masse triple-quadripôle 8B-S100-UBJ
4000 QTrap	AB Sciex, Warrington, Royaume-Uni www.sciex.com
1200 résolution rapide Système LC	Agilent, Stockport, Royaume-Uni
XB C18 colonne capillaire en phase inverse (100 mm x 2,1 mm, 2,6 & micro ;	Phenomenex, Macclesfield, Royaume-Uni www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 logiciel	AB Sciex, Warrington, Royaume-Uni www.sciex.com		Acquisition et analyse de données QTrap, y compris l’intégration de la zone
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