Article de méthode

Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1

DOI :

10.3791/54425

⸱

3 septembre 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

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House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) est l’une des rares lignées de cellules auditives de souris actuellement disponibles à des fins de recherche. Ce protocole décrit comment travailler avec des cellules HEI-OC1 pour étudier les effets cytotoxiques des médicaments pharmacologiques ainsi que les propriétés fonctionnelles des protéines de l’oreille interne.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEI-OC1 est l’une des rares lignées cellulaires auditives de souris disponibles à des fins de recherche. Proposées à l’origine comme système in vitro pour le criblage de médicaments ototoxiques, ces cellules ont été utilisées pour étudier les voies apoptotiques activées par les médicaments, l’autophagie, la sénescence, le mécanisme de protection cellulaire, les réponses inflammatoires, la différenciation cellulaire, les effets génétiques et épigénétiques des médicaments pharmacologiques, les effets de l’hypoxie, le stress oxydatif et endoplasmique du réticulum et l’expression des canaux et récepteurs moléculaires. Parmi plusieurs autres marqueurs importants des cellules ciliées cochléaires, les cellules HEI-OC1 expriment de manière endogène la préstine, la protéine motrice paradigmatique des cellules ciliées externes. Ainsi, ils peuvent être très utiles pour élucider de nouveaux aspects fonctionnels de cette importante protéine auditive. Les cellules HEI-OC1 sont très robustes et leur culture ne présente généralement pas de grandes complications. Cependant, ils nécessitent certaines conditions particulières telles que l’évitement de l’utilisation de cocktails antibactériens courants contenant de la streptomycine ou d’autres antibiotiques ainsi que l’incubation à 33 °C pour stimuler la prolifération cellulaire et l’incubation à 39 °C pour déclencher la différenciation cellulaire. Nous décrivons ici comment cultiver des cellules HEI-OC1 et comment les utiliser dans certains tests typiques, tels que la prolifération cellulaire, la viabilité, la mort, l’autophagie et la sénescence, ainsi que comment effectuer des mesures de capacité patch-clamp et non linéaires.

Introduction

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Maison-oreille Institut organe de Corti 1 (CP1) HEI-cellules sont dérivées de l'organe auditif d'un 1,2 de souris transgéniques. L' incubation d'une cellule à partir de cette souris transgénique à 33 ° C / 10% de CO 2 (conditions permissives) induit l' expression d'un gène immortalisant qui déclenche la dé-différenciation et de la prolifération accélérée; en déplaçant les cellules à 39 ° C / 5% de CO 2 (conditions non permissives) conduisent à une diminution de la prolifération, la différenciation et, au moins dans le cas de HEI-OC1, la mort cellulaire 2,3.

cellules HEI-OC1 ont été clonés et caractérisés dans notre laboratoire il y a plus d'une décennie, et les études initiales ont indiqué qu'ils expriment des marqueurs spécifiques des cellules ciliées de la cochlée, comme prestine, myosine 7a, Atoh1, BDNF, calbindine et calmoduline, mais aussi des marqueurs de soutien des cellules telles que la connexine 26 et le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGF-R) 2. Par conséquent, il a été suggéré que HEI-OC1 pourrait représenter un common progénitrices des cellules sensorielles et de soutien de l'organe de Corti 2. Des études parallèles fournis des preuves solides que archétypales médicaments ototoxiques comme le cisplatine, la gentamicine et streptomycine caspase-3 activation induite dans ces cellules, tandis que les médicaments considérés comme non-ototoxiques, comme la pénicilline, ne l' ont pas 2,3. Par conséquent, cette lignée cellulaire a été proposé comme un système in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l' ototoxicité et pour le dépistage de l'ototoxicité potentiel ou propriétés otoprotective de nouveaux médicaments pharmacologiques. On estime que les cellules HEI-OC1 ont été utilisés dans plus de cent cinquante études publiées au cours des dix dernières années.

Considérant que , en regardant l'effet pro-apoptotique potentiel des différents médicaments a été le principal objectif de la plupart des études portant sur ​​cette lignée cellulaire, d' autres processus cellulaires importants tels que l' autophagie et la sénescence ont tout juste commencé à étudier dans les cellules HEI-OC1 4-7. jena étude récente de notre laboratoire 8, nous avons utilisé des cellules HEI-OC1 pour collecter un ensemble complet de données sur la mort cellulaire, la survie, la prolifération, la sénescence et l' autophagie induite par différents médicaments pharmacologiques fréquemment utilisés dans la clinique. Nous avons également comparé certaines des réponses des cellules HEI-OC1 avec ceux de HEK-293 (cellules rénales embryonnaires humaines) et des cellules HeLa (cellules épithéliales humaines) recevant un traitement identique. Nos résultats indiquent que les cellules HEI-OC1 répondent à la chaque médicament d'une manière typique, avec une dose unique et de la sensibilité en fonction du temps à au moins l'un des mécanismes à l'étude. Nous avons également souligné dans cette étude qu'une interprétation correcte des résultats expérimentaux , il faudra effectuer des études parallèles avec plus d'une technique 8.

Dans une autre étude , nous avons étudié l'utilisation de cellules HEI-OC1 pour évaluer la réponse fonctionnelle de prestine, la protéine motrice de cellules externes cochléaires de cheveux (CCEs) 9 . Nous avons signalé cytométrie en flux et des études de microscopie confocale à balayage laser sur le motif d'expression prestine, ainsi que la capacité non linéaire (NLC) et des études de serrage des cellules plaquées entières dans les cellules HEI-OC1 cultivées à permissive (P-HEI-OC1) et non permissives (NP-HEI-OC1) conditions. Nos résultats indiquent que les deux augmentation de la localisation de l'expression Prestin et de la membrane plasmatique totale d'une manière dépendant du temps dans les cellules NP-HEI-OC1. Chose intéressante, nous avons également constaté que l'augmentation de la localisation Prestin à la membrane plasmique des cellules NP-HEI-OC1 en corrélation avec une diminution de la Na + K + ATPase, qui translocation de la membrane plasmique vers le cytoplasme sans changements significatifs dans l' expression totale des cellules. De plus, nous avons démontré que les cellules P-HEI-OC1 ont un solide CNL associé à Prestin la fonction motrice, ce qui diminue lorsque la densité des molécules de Prestin présentes à la membrane plasmatique augmente. Au total, ces résultats appuient fortement l'utilité de HEI-OC1 cellules pour étudier les protéines auditives.

Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1, pourquoi il est commode d'utiliser des cellules de plus en plus dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) pour les études de cytotoxicité, comment évaluer le mécanisme / s de la cytotoxicité induite par le médicament et comment d'effectuer des études électrophysiologiques (par exemple, patch-clamp, la capacité non-linéaire (NLC)) pour étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire CCEs cochléaires.

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Protocole

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1. Culture cellulaire

Remarque: Tous les protocoles de culture de cellules doivent être effectuées en utilisant des techniques appropriées de culture cellulaire (pour référence , voir les 3 premiers chapitres de biologie cellulaire: Manuel de laboratoire, volume I 10). les cellules HEI-OC1 ne nécessitent pas de revêtement supplémentaire ou le traitement des boîtes de culture cellulaire pour la croissance et l'adhérence adéquate. Très important: ne pas utiliser de la vaisselle, verrerie à des fins de culture cellulaire; le phénotype et la réponse biologique des cellules aux médicaments pharmacologiques changeront (G Kalinec & F Kalinec, non publié); des boîtes de culture cellulaire en plastique conventionnels sont recommandées (voir le tableau des matériaux / équipement). Portez une attention particulière aux techniques aseptiques pour éviter les contaminations, mais jamais utiliser des antibiotiques (par exemple, l' ampicilline ou la streptomycine) avec des cellules HEI-OC1. Si nécessaire, utilisez amphotéricine B. Alors que les cellules HeLa et HEK-293 ont été utilisées comme témoin dans les études précédentes avec HEI-OC1 8, toute autre lignée cellulaire pourraitacceptable à cette fin.

  1. Réanimation de cellules congelées HEI-OC1
    Remarque: Ce protocole peut également être utilisé avec d' autres lignées cellulaires provenant de la même souris transgénique développé dans notre laboratoire, par exemple OC-k3, à partir de 11,12 organe de Corti et SV-k1, de la strie vasculaire 13,14.
    1. Retirer un flacon de cellules HEI-OC1 cryoconservés de N 2 liquide, et le placer dans un bain d'eau à 37 ° C. Immerger seulement la moitié inférieure du flacon et le laisser décongeler jusqu'à ce qu'une petite quantité de glace reste dans le flacon. Essuyez l'extérieur du flacon avec 70% d'alcool.
    2. Pipeter les cellules du flacon et de livrer la totalité du volume (~ 1,5 x 10 5 cellules / ml) lentement, goutte à goutte, dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml d'un milieu de croissance préchauffé, comme milieu de Eagle modifié par Dulbecco ( DMEM), complété avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS).
    3. Enlever le DMSO en centrifugeant le tube à 300-500 g pendant 5 minutes, en éliminant til surnageant et remettre en suspension les cellules dans 9 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS). Désagréger les mottes ou des feuilles de cellules par le flux et le reflux des cellules en suspension, de la pipette sur le support, et vice versa, trois à quatre fois avec la pointe de la pipette touche le fond du tube.
    4. Placer le volume total de cellules en suspension dans un milieu de croissance de 100 mm de diamètre non traitées, des boîtes de culture cellulaire en plastique.
    5. Incuber les cellules à 33 ° C avec 10% de CO 2 (conditions permissives).
  2. Subculture de cellules HEI-OC1
    Remarque: Avant la confluence (~ 80%), les cellules doivent être mises en suspension et repiquées afin d'éviter que la culture de la mort. Ce protocole peut également être utilisé avec d' autres lignées cellulaires développées dans notre laboratoire à partir de la même souris transgénique, comme OC-k3, à partir de 11,12 organe de Corti et SV-k1, de la strie vasculaire 13,14.
    1. Enlever le vieux médium et laver les cellules avec 2 ml de PBS.
    2. Couvrir la monocouche cellulaire avec une solution de trypsine à 0,25%, en utilisant 1 ml par 25 cm2 de surface. Pour passer à l'étape suivante de plus de 40% des cellules doit être détaché. Examiner les cellules en utilisant un microscope inversé et, si nécessaire, "gifler ou appuyez sur" les boîtes de culture doucement pour libérer les cellules attachées restantes.
      Remarque: Prenez soin que trypsinisation pendant de longues périodes peuvent causer la mort cellulaire; ne suffit pas et les cellules transférées sera insuffisante pour les études prévues.
    3. Remettre en suspension les cellules, en suivant le mode opératoire décrit dans 1.1.3, et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
    4. Centrifugeuse pendant 5 min à 300-500 xg, jeter le moyen, recueillir les cellules avec un milieu de croissance frais et les semences eux, au moins, quatre de 100 mm de diamètre des boîtes de culture cellulaire. Le nombre de cellules par boîte dépend de la quantité de cellules récupérées. Incuber les cellules à 33 ° C avec 10% de CO 2 (P-HEI-OC1) et diviser à nouveau autant de fois que nécessaireles expériences planifiées ou pour générer un nouveau stock.
    5. Pour la préparation des stocks, remplacer 100 plats mm de diamètre par 250-550 ml des flacons de culture cellulaire; pour des expériences, des plats plus petits ou multi-puits des plaques peut être plus adéquate.
    6. Pour la différenciation, incuber les cellules HEI-OC1 dans des conditions permissives jusqu'à ce qu'ils atteignent ~ 80% de confluence; puis déplacer les plats à 39 ° C avec 5% de CO 2 (NP-HEI-OC1) pendant 2 à 3 semaines.
      Remarque: Les cellules vont arrêter progressivement la prolifération et la mort. Changer le milieu tous les deux jours pour éliminer les cellules mortes. En fonction du nombre initial de cellules, généralement après 4 semaines ~ plus, les cellules seront disponibles pour les expériences. Différenciation commence dès que les cellules sont placées dans des conditions NP, mais pas toutes les cellules différencier au même rythme. Surtout, Prestin expression et de localisation de la membrane augmente pendant le processus de différenciation (voir résultats représentatifs, Figure 4), fournissant une qualitativeet une indication quantitative du niveau de différenciation.

2. Drug cytotoxicité Studies

Remarque: les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) sont recommandés pour ces études (voir résultats représentatifs, Figure 1).

  1. Viabilité cellulaire (MTT Assay)
    1. Recueillir les cellules P-HEI-OC1 en suivant la procédure décrite au point 1.2, et les compter avec soit un compteur de cellules automatique ou hémocytomètre. Ajuster la concentration à 2,0 x 10 5 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules sur plaques de 96 puits à fond plat claires (100 pl par puits), incuber pendant la nuit pour la fixation sur le substrat, puis les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ne pas oublier d'inclure des blancs et des cellules traitées non (contrôle)!
    3. Après un traitement médicamenteux (habituellement 24 ou 48 heures à 33 ° C), effectuer le test MTT selon le protocole du fabricant. En généralLes protocoles pour cet essai ont les étapes suivantes:
      1. Ajouter 10 pi de réactif de MTT à chaque puits.
      2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 à 4 heures jusqu'à ce que le colorant violet est visible, puis ajouter 100 pi du MTT détergent réactif à chaque puits. Ne pas secouer la plaque.
      3. Couvrir la plaque et le laisser dans l'obscurité pendant 2 à 4 heures à 37 ° C.
      4. Utilisez un lecteur de plaque de microplaques pour mesurer l'absorbance à 570 nm dans chaque puits, y compris les blancs (milieu de croissance à elle seule). Normaliser les données en utilisant la DO moyenne dans les cellules témoins à 100% de la viabilité.
  2. Dosage de la caspase 7/3 d'activation
    Remarque: les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) sont recommandés pour ces études.
    1. Recueillir les cellules HEI-OC1 en suivant la procédure décrite au point 1.2, et les compter avec soit un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Ajuster la concentration à 2,0 x 10 5 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules sur white paroi plaques à 96 puits (100 pl par puits), incuber pendant la nuit pour la fixation sur le substrat, puis les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ne pas oublier d'inclure des blancs et des cellules traitées non (contrôle)!
    3. Après traitement de la toxicomanie (généralement 24 ou 48 heures à 33 ° C), effectuer le dosage de caspase suivant le protocole du fabricant respectif. D'une manière générale, les protocoles pour cet essai ont les étapes suivantes:
      1. Préparer les réactifs, mélangez-les bien, et leur permettre de revenir à température ambiante.
      2. Retirer les cellules de l'incubateur et permettent aux plaques revenir à température ambiante.
      3. Ajouter la quantité de réactif indiqué dans chaque puits, en prenant soin d'éviter la contamination croisée en ne touchant pas les puits contenant des échantillons différents avec les mêmes embouts de pipette.
      4. Couvrir la plaque et mélanger pendant 30 secondes en utilisant un agitateur de plaque à 300-500 rpm.
      5. Incuber la plaque à température ambiante pendant une période d'au moins 30 min. Détermineze la période d'incubation optimale de manière empirique. Si la température ambiante fluctue utiliser un incubateur à température constante, en raison des fluctuations de température affectent la luminescence lecture.
      6. Mesurer la luminescence dans chaque puits, et pour normaliser les valeurs en utilisant la luminescence moyenne dans les cellules témoins à 100% de l'activation des caspases.
  3. Division cellulaire (prolifération)
    1. Recueillir les cellules HEI-OC1 en suivant la procédure décrite au point 1.2, et les compter avec soit un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Ajuster la concentration à 2,0 x 10 5 cellules / ml.
    2. Ensemencer les cellules sur plaques de 96 puits à fond plat claires (100 pl par puits), incuber pendant la nuit dans des conditions permissives pour la fixation sur le substrat, puis les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ne pas oublier d'inclure des blancs et des cellules traitées non (contrôle)!
    3. Une heure après le traitement, ajouter à chaque puits 1 pi de BrdU 100x préparée (5-bromo-2'-deoxyuridîner) solution, et retourner les plaques dans l'incubateur à 33 ° C.
    4. Après 12, 24 et 48 heures, retirez le support existant dans les plaques correspondantes et laver chaque puits une fois avec PBS.
    5. Effectuer le test de prolifération des cellules selon le protocole du fabricant. D'une manière générale, les protocoles pour cet essai ont les étapes suivantes:
      1. Préparer les réactifs, y compris la fixation / solution dénaturant, tampon de lavage, la solution de détection d'anticorps primaire, la solution de détection d'anticorps secondaire, et une solution de BrdU comme indiqué dans le protocole du fabricant.
      2. Ajouter la solution de fixation / dénaturant à chaque puits, dans les quantités indiquées dans le protocole du fabricant, et de garder la plaque à température ambiante pendant 30 min.
      3. Retirer la / une solution dénaturante de fixation et ajouter l'anticorps primaire à la concentration indiquée dans le protocole du fabricant. Gardez la plaque à température ambiante pendant 1 h.
      4. Retirer la solution avec la fourmi primaireibody, laver la plaque 3 fois avec le tampon de lavage, puis ajoutez l'anticorps secondaire à la concentration indiquée dans le protocole du fabricant. Maintenir la plaque avec l'anticorps secondaire à la température ambiante pendant 30 min.
      5. Retirer la solution avec l'anticorps secondaire, laver la plaque 3 fois avec le tampon de lavage, et ajouter le substrat. Après 10 min d'incubation à température ambiante, on ajoute la solution d'arrêt. Attention: Contrôler le changement de couleur; Si la solution devient très sombre, arrêter la réaction avant que le temps de développement standard de 10 min.
      6. Lire l'absorbance à 450 nm dans les 30 minutes de l'ajout de la solution STOP.
  4. cytotoxicité
    Remarque: les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) sont recommandés pour ces études.
    1. Incuber à des conditions permissives, généralement pendant 24-48 h, les cellules HEI-OC1 dans un milieu de culture cellulaire seul (témoin) ou du milieu ainsi que les médicaments d'intérêt.
    2. A la fin du traitement,, Laver les cellules à trois reprises avec du PBS, et séparer à l' aide de 1 ml par 25 cm 2 de surface d'une solution non enzymatique dissociation cellulaire pendant 3 min.
    3. Après avoir détaché, de recueillir et sédimenter les cellules par centrifugation à 3000 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant, et colorer les cellules pendant 15 min à l'obscurité avec le réactif inclus dans le dosage de cytotoxicité.
    4. Déterminer le nombre de cellules vivantes HEI-OC1 par cytométrie en flux, comme indiqué par le fabricant du cytomètre de flux.
  5. sénescence
    1. Incuber à des conditions permissives, généralement pendant 24-48 h, les cellules HEI-OC1 dans un milieu de culture cellulaire seul (témoin) ou du milieu ainsi que les médicaments d'intérêt.
    2. Déterminer le nombre de cellules positives à la sénescence associée à la bêta-galactosidase en utilisant la cytométrie de flux avec le protocole décrit par Debacq-Chainiaux et al. , 15 ou toute autre méthode connue pour obtenir des résultats fiables. Un bref protocole pour cytométrie de flux est le suivant:
      1. A la fin des traitements expérimentaux, laver les cellules à trois reprises avec du PBS, puis les incuber avec 100 nM bafilomycine A1 dans un milieu de culture cellulaire pendant 1 h dans des conditions permissives.
      2. Ajouter C12FDG à une concentration finale de ~ 33 pM, et continuer à faire incuber les cellules pendant 1-2 heures.
      3. Laver les cellules deux fois avec du PBS, les récolter en utilisant 1 ml par 25 cm 2 de surface d'une solution non-enzymatique de dissociation de cellules pendant 3 minutes, et le culot eux par centrifugation à 3000 g pendant 5 min.
      4. Remettre en suspension les cellules dans du PBS glacé et déterminer le nombre de cellules positives HEI-OC1 par cytométrie en flux, comme indiqué par le fabricant du cytomètre de flux.
  6. autophagie
    1. Collecter les cellules HEI-OC1 contrôlent et affamés (privés de sérum pendant 48 heures) en suivant la procédure décrite au point 1.2, et de les traiter pour Western blot suivant des protocoles standards. En général, les protocoles pour Western blot ont la st suivanteeps:
      1. Semence des cellules HEI-OC1 dans des plaques à 6 puits à une concentration de 1,0 x 10 5 cellules / ml. Après 24 et / ou 48 h, laver les cellules avec du PBS glacé.
      2. Lyse avec 200 ul de tampon TNESV (1% de NP40, du Tris-HCl 50 mM , pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2 mM d' EDTA, 1 mM de Na 3 VO 4) avec un cocktail inhibiteur de protease PMSF et 1 mM pendant 5 min sur la glace.
      3. Recueillir les cellules (en raclant le fond de chaque puits), transfert à microtubes et centrifuger à 16800 xg pendant 5 min à 4 ° C.
      4. Recueillir les surnageants et de quantifier la concentration en protéines en utilisant le dosage BCA.
      5. Ajouter un tampon de chargement 5x et du DTT 1 mM à chaque échantillon et faire bouillir pendant 5 minutes pour dénaturer les protéines.
      6. Exécuter les échantillons en utilisant une SDS-PAGE sur un gel à 4-12%, et la transfère sur des membranes de PVDF.
      7. Bloquer les membranes avec 5% de lait écrémé séché dans du TBS-T avec 0,1% de Tween 20 pendant 60 minutes à la température ambiante.
      8. Incuber les membranes pendant une nuit à 4 ° C avec ant primaireibodies.
      9. Le lendemain, se laver les membranes intensivement avec TBS-T, et incuber avec un anticorps IgG secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1: 1500) pendant 1 h.
      10. Détecter une immunoréactivité avec une chimioluminescence amplifiée (ECL) du système de détection. Normaliser les niveaux d'expression de protéines en utilisant GAPDH (1: 2000 dans du TBS-T dans 10% de lait écrémé séché) en tant que norme.
    2. Dans les Western blots étudier l'expression d'au moins deux marqueurs différents de autophagy tels que Beclin-1 et LC3B (habituellement à 1: 1000 dilution dans du TBS-T avec 2,5% de BSA). Ne pas oublier de regarder pour un contrôle de l'expression des protéines telles que GAPDH ou actine.
    3. Évaluer l'expression de la protéine d'intérêt par densitométrie à l'aide d'un scanner blot numérique ou logiciels informatiques tels que le domaine public NIH image ou ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Expériences d'électrophysiologie avec des cellules HEI-OC1

  1. Les cellules de récolte
    Remarque: les cellules utilisent de plus en plus de 100 mm des boîtes de culture de diamètre à 50% -80% de confluence. Trypsine, Accutase, solution sans enzyme, ou p hosphate- b de aline + e de uffered thylène d iamin t Etra un acide CETIC (PBS-EDTA) peut être utilisé pour soulever les cellules sans effets significatifs sur le nombre et la qualité des gigaseals . Dans certains cas, cependant, le traitement à la trypsine rend les cellules plus fragiles. Dans ces cas, permettre aux cellules de se rétablir pendant environ 30 minutes avant de commencer les expériences.
    1. Laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS sans Ca 2+ et Mg 2+.
    2. Ajouter 2 ml d'une solution de détacheur sans enzyme, comme la non-enzymatique solution de dissociation des cellules, et on incube les boîtes pendant 3 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    3. Utiliser un microscope inversé pour vérifier le détachement des cellules. Si nécessaire, déplacez le cell de boîte de culture pour détacher davantage de cellules, mais faites-le doucement.
      Note: Ne pas secouer le plat.
    4. Ajouter 10 ml de DMEM + 10% de FBS et les cellules pipeter doucement vers le haut et vers le bas cinq fois avec une pipette de 10 ml.
    5. Regardez les cellules sous un microscope. Si> 80% des cellules sont déjà séparées (simple), aucune autre pipetage est nécessaire. Si les cellules sont encore en grappes, répétez le pipetage doucement jusqu'à ce que plus de 80% des cellules sont célibataires.
    6. Placer les ~ 10 ml de cellules en suspension dans un tube conique de 15 ml, centrifuger 2 min à 100 xg, et jeter le surnageant.
    7. Utiliser ~ 200 ul d'une solution d'enregistrement externe (L-15 du milieu de Leibovitz ajustée à 305-310 mOsm avec de l'eau distillée) pour remettre en suspension les cellules. Un contrôle optique des cellules doit montrer beaucoup, cellules rondes individuelles avec des bords de la membrane lisse.
  2. Patch-clamp et mesures NLC
    1. Effectuer patch-clamp et des mesures de tension dépendant non linéaire capacité (NLC) en utilisant unamplificateurs dequate et logiciels, ainsi que des techniques électrophysiologiques standard. En tant que (intrapipette) solution interne utilisation mM de KCl, 150 1 mM de MgCl2, 0,1 mM d' EGTA, 2 mM d' ATP-Mg, 0,1 mM de GTP-Na, et de 10 mM de HEPES; ajuster le pH à 7,2 avec du Tris.
    2. Sous le microscope, sélectionnez une seule cellule saine, avec rond et bords de la membrane lisse. Fixer la pointe de la pipette en verre à la surface cellulaire et vérifier la résistance de la membrane. Cela devrait être autour de 3-6 mégohms, correspondant à un diamètre interne (ID) de la pointe de la pipette de ~ 2 um.
    3. Appuyez doucement sur la pointe de micropipette contre la membrane plasmique de la cellule, puis appliquer le vide. Une partie de la membrane cellulaire est aspiré dans la pipette, la génération d'une résistance électrique de l'ordre de 10 - 100 gigaohms (gigaseal).
    4. Déterminer l'état de cellules entières en perturbant la membrane plasmique, avec des impulsions d'aspiration.
    5. Utiliser des cellules qui ne se manifestent pas Prestin, telles que des cellules HEK-293, en tant que témoin 9.
      Remarque: Les réponses actuelles doivent être filtrés à 5 kHz, et les corrections faites pour les effets de la résistance série résiduelle. Toutes les collectes de données et la plupart des analyses peuvent être effectuées en utilisant le logiciel habituellement inclus dans les amplificateurs de verrouillage. Fonction capacitance peut être monté sur la première dérivée d'une fonction de Boltzmann deux Etats concernant la charge non linéaire à la tension de la membrane 16.

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Résultats

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Dans quelques publications récentes , nous avons signalé un ensemble complet d'études visant à évaluer la réponse des cellules HEI-OC1 à plusieurs médicaments pharmacologiques couramment utilisés, ainsi que l' enquête de la fonction prestine 8,9. Dans ces études, nous avons fait usage de tous les protocoles décrits dans les sections précédentes.

L' un des résultats de ces études antérieures est que les cellules HEI-...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce rapport, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1 et les utiliser pour évaluer les mécanismes de la cytotoxicité induite par le médicament et d'étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire cochléaire CCEs. Les procédures techniques, cependant, sont suffisamment généraux pour être facilement adapté à différentes études.

Tous les protocoles décrits ici nécessitent l'utilisation correcte des techniques de culture cellulaire bien établies...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts existant ou potentiel.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les subventions R01-DC010146 et R01-DC010397 des NIH. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle des National Institutes of Health.

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Matériaux

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HEI-OC1TOUS LES KITS DE DOSAGE, ÉQUIPEMENTS  ;
Classe II Armoire de sécurité biologiqueLa société BakerSterilgard IIIET LES SOCIÉTÉS INDIQUÉES DANS LA
CENTRIFUGEUSE RÉFRIGÉRÉEEppendorf5810RPRÉCÉDENT 2 COLONNES NE SONT QUE
MICROSCOPE INVERSÉZeissAxiovert 25ET TOUT AUTRE PRODUIT SIMILAIRE
BAIN D’EAUStovallHWB115POURRAIT ÊTRE UTILISÉ.
Compteur de cellulesNexcelomCellomètre Auto T4
Deux (2) incubateurs de cellules, un à 33 ° ; C/10 % CO2 et autres à 39 ° ; C/5 % CO2Forma Scientific3110
Boîtes de culture cellulaire, PS, 100 mm x 20 mm avec éventsGreinier Bio-One664-160
Boîtes de culture cellulaire, PS,  ; 60 mm x 15 mm avec évents  ;Greiner Bio-One628160
Fioles de culture tissulaire Cellstar  ; 250 mlGreiner Bio-One658-175
Flacons de culture tissulaire Cellstar 550 mlGreiner Bio-One660-175
  ; Plaque de culture cellulaire 6 puits, avec couvercle-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Plaque de culture tissulaire, 96 puits, fond plat avec couvercleBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 puits blanc, fond transparentGreiner Bio-One655098
50 ml Tube conique en polypropylène avec bouchon CellstarsBecton Dickinson  ;352070
15 ml Tubes coniques en polypropylène avec capuchon-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7,4 (1x)  ;Life Technologies10010-023
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Sérum fœtal bovin (FBS)  ;HycloneSH10073.1
Leibovitz’s L-15 Medium, sans rouge de phénolGibco/Invitrogen21083-027
Trypsine, 0,25 %  ;Life Technologies25200-056
TACS MTT Kit d’essai de prolifération cellulaireTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Essai  ; kitPromega  ; G8091  ;
Kit de test de prolifération cellulaire BrdU  ;Signalisation cellulaire6813
Solution de dissociation cellulaire non enzymatiqueSigma-AldrichC5789
Cell-Tox Green Kit de test de cytotoxicitéPromega  ; G8741  ;
Instrument FACSAriaIII  ;BD Biosciences  ; FACSAriaIIIAvec excitation 488 nm (laser bleu)
Scanner numérique par transfertLI-CORC-DiGit
et de transfertHoeferSE300 miniVE
Spectra Max Max 5 Lecteur de plaques avec logiciel Soft Max Pro 5.2Dispositifs moléculairesSpectraMax 5
Amplificateur Patch-clampHEKAEPC-10
Extracteur pour la préparation électrodes patchSutter InstrumentsP-97
Cellules DES EXEMPLES DE , À Unité d’électrophorèse

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

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Culture cellulaireEssai de prolif rationEssai de viabilitPatch clampCapacitance non lin aireExpression de la prestineCytom trie en fluxIncubation thermiqueDiff renciation cellulaire

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