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Article de méthode

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

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DOI :

10.3791/54432

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1 décembre 2017

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1Unité d’Immunobiologie des Cellules Dendritiques, Department of Immunology, Institut Pasteur, INSERM U818, 2Genentech

Dans cet article

Résumé

Le modèle établi de cathétérisme transuréthrale de la souris permet l’étude des pathologies de la vessie, y compris les infections urinaires, mais ne peut être effectué chez les femelles. Un nouveau modèle de mâle instillation transurétrale, présenté ici, permettra des recherches dans une région marquée par fortes différences cliniques et épidémiologiques entre les sexes.

Résumé

Infections des voies urinaires (IVU) sont extrêmement répandues dans le monde entier, encourir une morbidité significative et des dépenses associées aux soins. Petits modèles animaux, qui reflètent la progression et l’établissement de la maladie, permettent la dissection des interactions hôte-pathogène et génération d’immunité aux infections. Chez la souris, l’instillation intravésicale des uropathogènes e. coli, l’agent causal dans plus de 85 % de la communauté acquis UTI, reprend bon nombre des étapes de l’infection chez les humains. Jusqu'à récemment, toutefois, UTI pourrait seulement être modélisé chez les femelles. Cette limitation a freiné l’étude des différences liées au sexe dans l’infection urinaire, mais aussi des autres pathologies de la vessie, comme le cancer. Nous décrivons ici une méthode pour inculquer des souris mâles qui permet une comparaison directe entre mâles et femelles animaux et fournir un protocole détaillé afin d’évaluer le tissu de la vessie par cytométrie en flux comme un moyen de mieux comprendre les réactions de l’hôte à l’infection. Ensemble, ces approches facilitera l’identification des facteurs de l’hôte qui contribuent à des biais de sexe observées dans l’infection urinaire et d’autres maladies associées à la vessie.

Introduction

Infections des voies urinaires (IVU) sont l’une des infections plus courantes dans les pays développés,1. Les taux d’infection sont similaires entre les femmes et les hommes chez les nouveau-nés et les personnes âgées2. Premenopausal femmes adultes, cependant, ont une incidence beaucoup plue d’UTI extra-hospitalière par rapport aux hommes2,3. Étant donné que cette maladie produit des effets principalement femmes, recherche fondamentale et clinique vise une écrasante majorité le UTI chez les femelles. Toutefois, l’infection urinaire chez les hommes est un défi de santé importants et sous-étudié4. En effet, infection urinaire chez les hommes sont associés à une morbidité plus élevée, ces infections sont habituellement définies sous la forme compliquée4,5.

À mesure que notre compréhension du rôle central des biais de sexe dans la physiologie et la pathologie évolue, nouvelles méthodes sont nécessaires pour explorer cet aspect précédemment négligé de la maladie. Différences entre les sexes jouent un rôle essentiel dans l’immunité et infection ; les femelles ont une incidence plus élevée d’une maladie auto-immune, tandis que les mâles sont plus sensibles à certaines infections, telles que la tuberculose, le paludisme et le VIH6,7. Cancer de la vessie, une autre pathologie urologique, est significativement plus fréquent chez les hommes que chez les femmes, et plusieurs études ont montré un rôle des androgènes dans le développement d’une tumeur maligne8,9,10,11 ,,12. Notamment, toutefois, l’enquête de thérapies intravésicale pour cancer de la vessie est effectuée exclusivement chez les femelles, en raison de l’incapacité de section à plusieurs reprises des souris mâles13.

L’étude de la pathogenèse de l’infection urinaire s’appuie fortement sur les modèles de rongeurs d’infection (par exemple, les souris et rats). Les modèles murins d’infection urinaire peuvent employer uropathogènes isolé à l’origine d’infections humaines, comme uropathogènes e. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcus, Proteusou14. En général, les bactéries sont introduits dans la vessie par cathétérisme de l’urètre. Suite à une infection, des vessies et des reins peut être enlevée pour évaluer les paramètres spécifiques de l’infection, tels que la colonisation bactérienne, des lésions tissulaires ou hôte réponse immunitaire15,16. Universellement, cependant, seulement les animaux femelles sont utilisés pour la recherche de l’UTI. En effet, plusieurs études ont noté que, pour des raisons anatomiques, cathétérisme des souris mâles n’est pas possible de13,17,18,19. Plus récemment, une approche chirurgicale à l’instillation mâle a été décrit, dans laquelle l’abdomen est ouvert, la vessie est déplacée à l’extérieur en appliquant une légère pression à l’ouverture dans l’abdomen et bactéries sont injectées dans la vessie de20. Cette approche permet l’infection masculine, au prix d’une intervention chirurgicale. Ainsi, un bémol majeur de cette approche comprend l’influence de l’inflammation, sur l’issue de l’infection, tels que le potentiel de provoquer une réponse anti-inflammatoire de cicatrisation de l' incision21. Comme nos intérêts incluent la compréhension des préjugés sexuels en réponse à la maladie, nous avons développé une méthode d’instillation intravésicale bactérienne chez les souris mâles qui correspond le mieux à l’approche transuréthrale non-chirurgicale longtemps utilisée chez des rongeurs femelles22 .

Notre modèle s’appuie sur une méthodologie éprouvée et offre la possibilité de comparer directement la réponse immunitaire de hôte à l’infection urinaire chez les animaux mâles et femelles. Cette méthode va permettre la dissection des différences fondées sur le sexe dans l’infection et potentiellement offrir des indices moléculaires et cellulaires pour les différences marquées dans la sensibilité et la réponse à l’infection entre les sexes. En outre, ce modèle a valeur au-delà des études de l’UTI, permettant la mise en place de modèles d’étude d’autres maladies associées à la vessie, comme le cancer de la vessie, prostatite, sous - ou over - active les syndrome de la vessie et la cystite interstitielle.

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Protocole

Expériences de souris ont été réalisées conformément à l’approbation du protocole numéro 2012-0024 par le Comité de "éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale), en application de la Directive 2010/63 européen UNION EUROPÉENNE.

1. préparation des cathéters

  1. Préparer une canule intraveineuse-accès pédiatrique pour chaque groupe de souris infectées. En utilisant le mécanisme à ressort intégré, dépouiller chaque canule de son aiguille, tel qu’indiqué par le fabricant. Jeter les aiguilles, conservant seulement la canule intraveineuse en plastique.
  2. Stériliser les cathéters dans une hotte à flux laminaire pour cycle un rayonnement ultraviolet (UV), généralement de 25 à 30 min.
    Remarque : Cathéters peuvent être utilisés pour plus d’une souris, mais un nouveau cathéter doit être utilisé entre les groupes expérimentaux, sexes ou les souches bactériennes.

2. préparation des uropathogènes e. coli Infection

  1. Au moins deux jours avant l’infection, en utilisant une boucle de l’inoculation stérile, strie UPEC provenant d’un stock de bactéries congelé sur une gélose de bouillon Luria (LB), contenant des antibiotiques si nécessaire. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine.
  2. Dans un erlenmeyer stérile de 100 ml, ensemencer 10 ml LB, contenant des antibiotiques si nécessaire, avec une seule colonie de la plaque LB et incuber debout à 37 ° C pendant la nuit (environ 16-18 h).
    Nota : Les cultures permanentes acceptent l’expression de type 1 pili, qui sont nécessaires pour infection23. Cultures cultivées secouant aura moins efficace expression pili et par conséquent, incompatibles taux d’infection.
  3. Mesurer la densité optique (do)600 , de la culture au jour le jour et calculer le nombre de bactéries / ml à l’aide d’une courbe de croissance prédéterminée. Comme exemple, pour la souche UPEC UTI89, OD600 = 0,35 équivaut à 2 x 108 UFC / ml, ainsi, une culture d’une nuit ou plus avec un OD600 = 2.4 équivaudrait à 13,7 x 108 UFC par ml. déterminer empiriquement la relation entre le OD600 et des bactéries viables avec chaque nouvelle souche utilisée pour l’infection.
  4. Déterminer la quantité de bactéries nécessaires en tenant compte du nombre d’animaux infectés et que chaque souris devraient recevoir environ 107 unités formant colonie (UFC) dans 50 µl de PBS. Inclure dans le calcul le volume mort de ~ 130 µl de l’essentiel du cathéter et de la seringue et 100 µl nécessaires pour déterminer l’inoculum.
    1. Faites tourner la suspension bactérienne dans une micro-centrifugeuse table à 17 000 x g pendant 1 min et Resuspendre le culot bactérien qui en résulte à 2 x 108 UFC / ml dans du PBS. En série, diluer une aliquote de cette suspension et la plaque sur une gélose LB, le cas échéant, de déterminer l’inoculum exacte pour chaque infection par des antibiotiques.
  5. Dessiner l’inoculum bactérien dans une seringue de 1 ml et fixer le cathéter à l’extrémité de la seringue. Tapez sur la seringue pour enlever tout l’air et appuyer sur le poussoir pour remplir l’espace sans circulation d’air dans le cathéter avant de commencer l’instillation.

3. préparation des souris

  1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de xylazine kétamine et 5 mg/kg de 100 mg/kg. Chauffage d’appoint peut être fourni.
  2. Veiller à ce que chaque souris sont sous sédation entièrement en serrant le coussinet plantaire avec la pression du fluide. Souris sont entièrement sous sédation lorsqu’ils ne font pas réagir et nécessite 3-5 minutes pour arriver à cet État.
  3. Placez la souris en position couchée et appliquez une pression moyenne sur le bas-ventre de vider la vessie de l’urine. Vessie pleine envie d’un petit pois sous la peau entre les crêtes ileac.
    Remarque : Par inhalation isoflurane a été utilisé pour la section des souris femelles15,22, cependant, il n’a pas été testé si les souris mâles sont suffisamment anesthésiés par inhalation isoflurane pour cette procédure.

4. transuréthrale Instillation de souris femelles

  1. À l’aide de la main non dominante, placez le pouce sur la queue et un doigt de la main sur l’abdomen de la souris et appliquez une légère pression pour s’opposer au sens pour maintenir la souris fermement en place.
  2. Placer l’embout du cathéter perpendiculaire à la souris à l’orifice urétral. Avec une pression modérée, glissez le cathéter dans l’urètre, jusqu'à ce que le hub répond à l’orifice urétral, tout en réduisant simultanément la seringue afin qu’elle soit parallèle à la surface de travail. Le cathéter ne nécessite aucun graissage. Ne pas pousser ou forcer le cathéter dans l’urètre. Le cathéter doit glisser en douceur et facilement dans l’urètre, avec peu ou pas de résistance.
    1. Avant d’instiller l’inoculum (étape 4.3), une fois le cathéter est en place, très doucement, tirez la peau abdominale, vers la tête de la souris avec le doigt de la non dominantes à la main qui est déjà sur le ventre de la souris (étape 4.1). Si le cathéter est dans l’urètre, les tissus composant l’orifice de l’urètre ne bougera pas, considérant que si le cathéter est mal placé dans le vagin, les tissus seront déplace vers le haut et loin le cathéter. Ce test rapid devrait être effectué sur chaque souris.
  3. Lorsque la plaque tournante du cathéter remplit l’orifice urétral, lentement administrer 50 µl de l’inoculum bactérien. Un taux d’instillation lente réduit les reflux vésico-urétéral dans le rein. Retirer lentement le cathéter pour éviter les fuites, sur un nombre de 5. Placez les souris dans leur cage en position couchée.

5. transuréthrale Instillation de souris mâles

  1. Placer deux pouce Pince parotidien et direction caudale aux organes génitaux externes de la souris. Rétracter le prépuce pour exposer entièrement le gland du pénis. Une fois que le pénis est placé à l’extérieur, relâcher la pince pouce.
  2. Repositionner la pince afin de stabiliser le pénis saillant perpendiculairement à l’animal, tenant l’organe doucement mais tendu. Visualiser le méat urétral et soigneusement introduire le cathéter dans la petite ouverture à l’extrémité de l’organe. Guidez le cathéter dans le pénis, vers le corps de la souris, en maintenant une tension douce avec la pince. Le cathéter ne nécessite aucun graissage. Ne forcez pas le cathéter dans le pénis ; le cathéter doit glisser en douceur dans l’urètre, indiquant l’emplacement exact.
  3. Une fois la plaque tournante du cathéter répond à l’extrémité du pénis, très lentement administrer 50 µl de l’inoculum, tout en conservant la position du pénis. La qualité de l’instillation peut être observée en ce moment selon un score de qualité de l’instillation prédéterminée, comme celui illustré à la Figure 2.
  4. Retirer le cathéter lentement, au nombre de 5, pour éviter les fuites de l’inoculum. Placez les souris dans leur cage en position couchée. Animaux devrait commencer à récupérer 30-45 min après l’administration de l’anesthésie.

6. détermination de l’UFC dans les organes infectés

  1. À des moments prédéterminés, sacrifice de souris à l’aide d’approuvé modes opératoires normalisés (par exemple, dislocation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifier l’abdomen soigneusement avec de l’éthanol 70 % pour minimiser la contamination de la fourrure.
  2. Faire une incision dans le tiers inférieur de l’abdomen de la souris d’au moins 2 cm à l’aide de ciseaux et aseptiquement enlever la vessie et toute autre organes voulues, y compris mais sans s’y limiter, reins, testicules, vésicules séminales ou glandes préputiales, dans 5 ml bouchon en polypropylène pression tubes contenant 1 ml de PBS stérile. Conserver tous les échantillons sur la glace.
  3. Homogénéiser les organes avec un homogénéisateur poche jusqu'à ce que presque aucun tissu plein ne reste, environ 15-60 sec selon l’organe. La graisse ne pas bien homogénéiser et est facilement reconnaissable comme le tissu beige-blanc brillant. Jeter la graisse avant ou après homogénéisation. Laver l’homogénéisateur en éthanol suivie de PBS entre chaque expérimentales ou d’un groupe de l’orgue.
    Remarque : Utilisent généralement les homogénéisateurs poche ou homogénéisateurs de moulin de perle. Alors que tous ces systèmes ont donné des résultats semblables, tel que déterminé par la comparaison directe des CFU bactérienne à 24 heures après l’infection, les conditions optimales d’homogénéiser les tissus de l’hôte tout en préservant la viabilité bactérienne doivent être déterminées de manière empirique avant effectuer régulièrement le présent protocole.
  4. Effectuer des dilutions successives de suspensions orgue homogénéisé. Plaque des dilutions sur plaques de gélose LB, contenant des antibiotiques lorsque cela est approprié et incuber pendant la nuit (~ 15 h) à 37 ° C. Les souches UPEC ont des temps de doublement très rapides et à ce titre, il faut ne pas Incuber les boîtes de gélose trop longtemps parce que cela va entraver la capacité de compter les colonies individuelles.

7. cytométrie du tissu de la vessie

  1. Préparer un tampon digestion contenant la collagénase à 34 unités/mL et DNase à 100 µg/mL dans du PBS. Rester sur la glace. Préparer un tube conique de 15 ml par animal à analyser et tampon digestion aliquote de 1 ml par tube.
  2. À des intervalles prédéterminés, sacrifice de souris à l’aide d’approuvé modes opératoires normalisés (par exemple, la dislocation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifier l’abdomen soigneusement avec de l’éthanol 70 % pour minimiser la contamination de la fourrure.
  3. Faire une incision dans le tiers inférieur de l’abdomen de la souris d’au moins 2 cm à l’aide de ciseaux et enlever tout le boudin. Viande hachée bien avec des ciseaux, découper la vessie en 2-3 mm2 petits morceaux, en général environ 8 morceaux.
    1. Ajouter une vessie hachée par tube contenant un tampon de la digestion. Secouez pour laver les tissus de la vessie hachées dans le tampon de la digestion. Rester sur la glace jusqu'à ce que toutes les outres sont disséqués et hachées.
  4. Incuber les vessies hachées pendant 60 à 75 min à 37 ° C, avec une agitation vigoureuse à la main pendant 5 s toutes les 15 min. Lorsque le tissu a un aspect vitreux transparent, qui ressemble à papier de soie humide, la digestion est terminée. Digestion prolongée va supprimer les protéines de surface des cellules nécessaires à l’identification et doit être évitée.
  5. Inactiver les enzymes de la digestion en ajoutant 2-3 mL de tampon de cytométrie en flux glacee (PBS contenant 2 % sérum fœtal (SVF) et 0,2 mM EDTA) et mélanger doucement. Placer les tubes sur la glace.
  6. Pour assurer une suspension monocellulaire et supprimer n’importe quel tissu conjonctif, passer le contenu du tube à travers un filtre 100µm placé dans un tube conique de 15 mL. Appuyez doucement sur n’importe quel tissu restant à travers le filtre avec la fin d’un piston de la seringue. Lavez le filtre avec un tampon de cytométrie de flux supplémentaires de 2 mL. Conserver les échantillons sur la glace.
  7. Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 ° C. Remettre en suspension les boulettes dans 100 µL écoulement cytometry tampon Fc bloc conteneur, diluée à 5 µg/mL et le transfert d’un 96 puits autour de la plaque inférieure. Après 10-15 min, ajouter 100 µL désiré anticorps cocktail à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30-45 min, sur la glace, abri de la lumière.
    Remarque : Le bloc Fc est un réactif utilisé pour empêcher la fixation de la portion Fc des anticorps dirigés contre les cellules exprimant les récepteurs Fc. Son but est de minimiser les anticorps non spécifiques. Détermination des anticorps à utiliser sera dépendante de l’hypothèse testée dans l’expérience et doit être sélectionnée avec l’apport de la littérature. Dans la Figure 3, pour mesurer l’infiltration de cellules immunitaires dans l’ensemble, un anticorps anti-CD45 était employé, qui est une protéine de pan-immunitaire cellulaire.
  8. Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 ° C. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 200 µL de tampon de cytométrie en flux et transmettre des échantillons à travers un tamis de cellule 40 µm sur un tube de 5 ml en polystyrène juste avant acquisition sur un cytomètre en flux.
  9. Recueillir la totalité de l’échantillon sur le cytomètre en flux. Une bonne digestion produira 200 000-400 000 cellules, avec 8 000-10 000 CD45+ des cellules immunitaires de vessies de souris naïves, tandis que les organes infectés contiendra plusieurs cellules16 (Figure 3).
    Remarque : Les échantillons préparés pour cytométrie ne peuvent servir à évaluer l’UFC. Il n’est pas recommandé de diviser la vessie en deux parties, car aucune preuve n’existe pour démontrer que la colonisation UPEC ou infiltration de cellules immunitaires est uniforme dans l’ensemble du tissu.

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Résultats

Dans l’élaboration du présent protocole, des cohortes de souris C57Bl/6 femelles et mâles âgés de 6 à 8 semaines ont été instillée et bactérienne charge évaluée dans les vessies aux points de temps allant de 1 h à 30 jours. Les résultats de ces études sont détaillées ailleurs (Zychlinsky Scharff et al., en attente). Ici, nous présentons des données représentatives d’infections 24hr. Notamment, la charge bactérienne était équivalente entre les souris mâles et femelles à 24 heures ...

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Discussion

Instillation transuréthrale de souris mâles vous propose de nombreuses nouvelles possibilités de recherche sur l’influence du sexe sur la maladie muqueuse de la vessie, mais présente aussi plusieurs défis. Avant tout, une seule limitation est que l’instillation au départ pourrait pour être techniquement difficile, ce qui entraîne une inflammation excessive durant l’insertion du cathéter. Amélioration de la technique est possible par l’instillation de souris mortes avec une solution colorée, comme colorant bleu d’Evans. P...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Matthieu Rousseau pour une lecture critique du manuscrit et le laboratoire d’immunobiologie dendritiques pour leurs points de vue utiles lors de l’élaboration du présent protocole et le projet. Ce travail a été soutenu en partie par le financement de l’Union européenne septième Programme Marie Curie Action-cadre (PCIG11-GA-2012-3221170 et l’Immuno-oncologie LabEx (ami).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cathéters IV blindés BD Insyte Autoguard 24 G, diamètre externe de 0,7 mm, longueur 14 mMde catalogue de la 381811 ou 381411*de BD Medical dépend du pays
Greiner Bio-One731171
LB Miller bouillonDifco244620
LB Gélose MillerDifco244520
CuvettesBio-rad223-9955
seringuesB Braun9166017V
Pince à pouce (Adson)Outils de science fine11006-12
Tubes de 5 ml, polypropylèneSondes352063
Tissue RuptorQiagen990890
Tubes à capuchon rabattable de 15 mlThermo Scientific362694
DNAseInvitrogen18047019
Liberase TMSigma-Aldrich5401119001doivent être aliquottées et stockées à -20 ° ; C pour éviter la congélation-décongélation répétée
100 µ ; M MACS SmartStrainers  ;Miltenyi130-098-463compatible avec les tubes de 15 ml, préféré
100 & micro ; crépines à cellules M  ;Falcon352360compatible avec les tubes de 50 ml, si les passoires intelligentes MACS ne sont pas disponibles
Plaque à 96 puitsFalcon353077
Fc blockBD Pharmingen553142anti-CD16/CD32 anti-souris
Anticorps CD45BD Biosciences561487de nombreuses options de conjugaison fluorescente différentes sont disponibles
Tubes de 5 ml en polystyrène avec capuchon filtrantFalcon
seringue à insulineTerumoBS05M2913
homogénéisateur à mainQiagen9001272TissueCytomètre
fluxRuptor BD BiosciencesN/AFortessa SORP  ;
Logiciel de cytométrie en fluxBD BiosciencesN/ADiva
Le numéro * jetables Falcon 352235 en

Références

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