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Article de méthode

Captage et sortie de Viable cellules tumorales circulantes du sang

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DOI :

10.3791/54435

⸱

28 octobre 2016

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Miami, 2SRI International, 3Department of Biomedical Engineering, DJTMF Biomedical Nanotechnology Institute at the University of Miami, University of Miami

Dans cet article

Résumé

Un protocole d'utiliser un poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltre enduit pour la capture efficace et la libération thermosensible de cellules viables tumorales circulantes (CTC) est présenté. Cette méthode permet la capture de CTC à partir du sang des patients et la libération subséquente de CTC viable pour la culture en aval hors puce, des analyses et de caractérisation.

Résumé

Nous démontrons une méthode pour la taille de capture à base de cellules viables de la tumeur de circulation (CTC) dans le sang total, ainsi que la libération de ces cellules de la puce pour l'analyse et / ou de la culture en aval. La stratégie emploie l'utilisation d'un roman Parylène C fente de la membrane poreuse microfiltre pour capturer CTC et un revêtement de poly (N--iso propylacrylamide) (PIPAAm) pour thermosensible libération viable du CTC capturé. La capture de cellules vivantes est activé en tirant parti de la conception d'une géométrie fente de pores avec des dimensions spécifiques pour réduire la contrainte de cisaillement généralement associé au processus de filtration. Alors que le microfiltre présente une grande efficacité de capture, la libération de ces cellules est non-trivial. Typiquement, seul un faible pourcentage de cellules sont libérées lorsque des techniques telles que l'écoulement inverse ou en grattant les cellules sont utilisées. La forte adhérence de ces cellules cancéreuses epitheliales sur la membrane de parylène C est attribuable à une interaction électrostatique non spécifique. Pour contrecarrer eest l'effet, nous avons utilisé l'utilisation du revêtement PIPAAm et exploité ses propriétés interfaciales sensibles à la chaleur pour libérer les cellules du filtre. Le sang est d'abord filtrée à température ambiante. En dessous de 32 ° C, PIPAAm est hydrophile. Ensuite, le filtre est placé soit dans les milieux de culture ou un tampon maintenue à 37 ° C, ce qui se traduit par la rotation PIPAAm hydrophobe, et en libérant ensuite les cellules liées électrostatiquement.

Introduction

La maladie métastatique est responsable de la plupart des décès par cancer. Développer biomarqueur de diagnostic et de pronostic compagnon pour la métastase est crucial dans la gestion et le traitement du cancer. les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle central dans la diffusion de la tumeur et les métastases. En outre, étant facilement accessible comme une «biopsie liquide» biomarqueur, CTC chez les patients atteints d'un cancer du sang périphérique a augmenté comme un «foyer» pour la recherche sur les biomarqueurs du cancer. CTC ont été bien validé comme un biomarqueur pronostique dans divers milieux de cancer, notamment du sein, de la prostate et le cancer colorectal 1-3. Cependant, les avancées récentes dans le domaine de la CCT a indiqué que la seule énumération de ces cellules rares a limité l' utilité clinique, comme montré dans les essais cliniques interventionnels 4. Ainsi, il existe un besoin émergent pour les technologies qui permettent la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la CCT. Actuellement, seuls quelques technologies existent qui permettent for non-antigène polarisé, la capture viable et la libération de la CCT, ce qui permet robuste aval moléculaire et fonctionnelle analyse 5,6. La majorité de ces dispositifs micro - usinés sont couplées aux plates - formes microfluidiques et ont donc un facteur limitant dans la quantité de sang qui peut être traitée, qui varie de 2 à 4 ml 7-10. CTC sont des événements rares dans un seul tube de prélèvement de sang (7,5 ml), donc de réduire encore la quantité de sang qui peut être traitée, entrave considérablement les chances de capturer et isoler ces cellules d'intérêt.

Nous avons développé deux types de dispositifs Parylène C de la membrane de microfiltration pour la capture du tétrachlorure de carbone qui exploitent les différences de taille entre les plus grandes cellules tumorales et les cellules sanguines normales plus petites 11,12. Nous avons précédemment rapporté sur le filtre poreux de dénombrement rond et comparé avec une plate - forme approuvée par la FDA, où le micro - filtre a été montré supérieur au tétrachlorure de carbone efficacité de capturepour les échantillons de sang des patients du cancer 13,14. Cependant, une limitation du filtre ronde est la nécessité d'utiliser un fixatif à base de formaldéhyde avant la filtration. Ce processus préserve les cellules morphologie tout en leur permettant de résister à la contrainte et la pression de cisaillement pendant le processus de filtration. Alors que le dénombrement et des études moléculaires peuvent être réalisées sur la puce 13, le fixatif altère la capacité d'effectuer la caractérisation fonctionnelle. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé un filtre à pores de fente qui nie la nécessité de fixer les cellules avant filtration (Figure 1). La géométrie fente de pores (6 pm largeur x 40 um pores de fente de longueur) permet aux cellules tumorales à capturer tout obstruant partiellement un pore et donc en permettant le passage libre pour d'autres cellules sanguines et atténuer la montée en pression qui conduirait à des dommages cellulaires et une éventuelle rupture 15,16 La fente de cartouche de pores est composé de 2 pièces qui prennent en sandwich acryliquesle filtre fente de pores entre la pièce supérieure et inférieure avec Polydiméthylsiloxane (PDMS) agissant comme un joint d' étanchéité pour fournir une fuite de joint étanche 14,15 (figure 1).

Bien que l'efficacité de capture du filtre fente de pores est élevé, (tableau 1), le CTC capturé sont liés à la membrane de parylène C par de fortes interactions non-spécifiques électrostatiques au lieu de la matrice extracellulaire (ECM) médiée adhérence 15. Des méthodes telles que l'écoulement inverse, ou l'utilisation de racleurs de cellules ne parviennent pas à libérer efficacement les cellules du filtre, ou entraîner des dommages aux cellules et la mort cellulaire. Nous avons exploré une utilisation non conventionnelle de PIPAAm pour formuler une stratégie de libération 15. PIPAAm est un polymère qui est soumis à une température de solution critique inférieure (LCST) la transition de phase réversible à une température de solution de 32 17 ° C. Traditionnellement, cette propriété de PIPAAm a été largement explorée pour les applications d'ingénierie tissulaire. Habituellement, les cellules sontles surfaces cultivées sur PIPAAm enrobé à 37 ° C lorsque PIPAAm est hydrophobe. Les cellules peuvent ensuite être détachées sous forme de feuille quand la température de la culture est déplacée au - dessous de 32 ° C, où la surface revêtue PIPAAm devient hydratée 17,18. Nous avons exploité cette propriété thermique en effectuant le processus de filtration à la température ambiante (inférieure à 32 ° C), puis permettre la libération de cellules en plaçant le filtre dans les milieux de culture maintenue à 37 ° C. A cette température, la couche de polymère devient hydrophobe PIPAAm, libérant ainsi les cellules liées électrostatiquement 15 (figure 1).

Bien que la méthode sensible à la température, ainsi que d' autres méthodes ont été mises en œuvre avec succès pour atteindre viable capture CTC et de libérer 19 - 21, une clé inconvénient potentiel partagé par ces technologies déclarées est qu'ils emploient tous un principe de l' antigène dépendant de la CCT capture. Capture d'antigène CTC sur la base, comme le montre la précédemment, peut conduire à une analyse biaisée CTC 11,14. Par exemple, de nombreuses technologies basées sur l'affinité emploient anticorps qui se lie EpCAM pour le CTC capture. Cependant, la CCT a été montré pour exprimer différents niveaux de EpCAM, conduisant à une omission de EpCAM faible et EpCAM CTC négative par ces technologies. En outre, les limitations peuvent se produire lorsque la CCT d'origine non épithéliale est d'intérêt, tels que la CCT dans les milieux de mélanome et le sarcome. Ainsi, une technologie qui permet la capture et la libération viable CTC sans biais potentiel introduit par l'antigène à base de capture est hautement souhaitable.

Fait important, le dispositif microfiltre de capture est purement dimensionnée sur la base et la stratégie de libération est agnostique à la présence de certains marqueurs de surface. Nous croyons que l'emploi du microfiltre revêtu PIPAAm aidera à élargir notre compréhension du processus métastatique, en fournissant la capacité de capturer et libérer la CCT pour les analyses en aval efficace et efficiente. Cela peut puissanteexposer ially nouvelles molécules pour lesquelles de nouvelles thérapies ciblées systémiques pourraient être dirigés ainsi que de fournir un biomarqueur qui peut être contrôlé facilement et l'aide dans le cancer de gestion des patients.

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Protocole

Déclaration éthique: Pour protéger les droits des sujets humains, des échantillons de sang ont été obtenus suite à un consentement éclairé dans les protocoles approuvés par l'Université de Miami examen institutionnel des conseils en vertu de la CISR 20150020.
NOTE: Le sang à filtrer pour le CTC capture doit être recueillie dans un tube EDTA pour empêcher la coagulation.

1. Le revêtement du Microfilter avec Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)

  1. Peser PIPAAm pour préparer une solution à 10% p / v dans le butanol. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution soit limpide.
  2. Cut plastique microscope glisse dans environ 12 mm x 12 mm carrés, soit avec une paire de ciseaux ou lame tranchante. Vous pouvez également utiliser une guillotine.
    NOTE: Ces carrés serviront de support pour les filtres au cours du processus de revêtement par centrifugation.
  3. En utilisant une paire de ciseaux de bord droit, couper la fente pore microfiltre tranche en 8 mm x 8 mm carrés.
  4. L'utilisation d'une bande de film de polyimide sécuriser les filtres de coupe sur le squa plastiqueres préalablement coupé à l'étape 1.3. Appliquer le film uniquement sur le bord et le coin du filtre de telle sorte qu'au moins 7 mm x 7 mm de la surface du filtre est non-couverte par la bande.

figure-protocol-1
Figure 2:. Illustration représentant du Microfilter Set-up pour PIPAAm Coating 8 mm x 8 mm microfiltre est positionné sur le 12 mm x 12 mm en plastique coupe carrée à partir d' une lame de microscope en plastique. Bande de polyimide est utilisé pour sécuriser le microfiltre en place pour faire tourner le manteau PIPAAm.Reproduced avec la permission de la référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Placez le microfiltre qui est fixé sur la place du plastique, sur le mandrin à vide du spin-coater.
  2. Programmer le spin-coater la recette suivante: Démarrer, 500 rpm pendant 10 secondes, 6000 rh pendant 60 s, 500 rpm pendant 10 secondes, Stop.
  3. Puiser une quantité suffisante de 10% p / v solution PIPAAm (préparé en 1.1) pour couvrir complètement la surface du microfiltre à l'aide d'une pipette de transfert en plastique standard et démarrer la tournette.
  4. Retirez le microfiltre enduit PIPAAm du spin-coater après le processus de revêtement est terminé. Laissez le filtre attaché au carré en plastique pendant le stockage.
    NOTE: L'enduit-filtre peut être conservé à température ambiante pendant jusqu'à 3 mois.

2. Assemblée de Filtration Cassette avec Microfilter PIPAAm Coated

  1. Réhydrater PIPAAm microfiltre enduit à la température ambiante en plaçant le microfiltre encore fixé sur la place du plastique dans une boîte de Pétri. Ajouter 1x PBS jusqu'à ce que le microfiltre est complètement immergé et laisser reposer pendant 5 min.
  2. Après l'étape d'hydratation, libérer le filtre de la place en plastique en coupant la bande de film de polyimide en utilisant une paire de ciseaux.
    REMARQUE: Prenez note de quel côté du filtre ale revêtement PIPAAm.
  3. Assembler le microfiltre dans la cassette de filtration, en intercalant le microfiltre entre la pièce en acrylique et en bas, ainsi que les pièces 2 Polydiméthylsiloxane (PDMS) agissant comme un joint / joint. Fixer la cassette acrylique avec clips pour fixer le filtre et fournir un joint étanche.
    NOTE: Le revêtement PIPAAm doit être orientée vers le haut, de sorte que l'échantillon est filtré à travers, les cellules sont capturées sur PIPAAm surface revêtue du filtre (figure 1).

3. Filtration de l'échantillon de sang avec Capture et sortie du CTC de la Microfilter

  1. Comme chaque marque de pompe de seringue a sa propre interface utilisateur, reportez-vous au manuel d'utilisation de la pompe et programmer la pompe seringue à circuler à un débit de 75ml / h et régler le volume à 20 ml.
  2. Chaud 3 ml de milieu (disponible dans le commerce), de culture de cellules de McCoy (préparée en ajoutant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline et de streptomycine) à 37 ° C.
    NOTE:. Le choix des médias sera basé sur le type de cancer du patient, ou bien si cela est une expérience de système de modèle dans lequel les cellules cultivées doivent être enrichis dans le sang de donneur sain, utiliser les médias les cellules sont normalement cultivées en cas de doute, s'il vous plaît se référer le guide de culture / méthode fournie par la société les cellules ont été achetées auprès de.
  3. Ajouter 7,5 ml de solution saline équilibrée disponible dans le commerce de Hank (HBSS) à 7,5 ml de sang échantillon et aspirer ce sang dilué dans une seringue de 25 ml.
    REMARQUE: Réglez le volume de HBSS de sorte que l'échantillon de sang est dilué avec un volume égal de 1: 1 avec HBSS Par exemple , si 10 ml de sang est utilisé, puis mélanger avec un volume égal de 10 ml de HBSS pour obtenir le 1: 1. Dilution.
  4. Engager la cassette de filtration avec la seringue et placez-le sur la pompe à seringue. Placer un tube de 50 ml à fond pour recueillir l'écoulement à travers et démarrer la pompe.
    NOTE: La filtration devrait prendre environ 10 à 12 min. Toutes les étapes de filtration doivent être transportésà température normale ambiante (20-25 ° C), y compris l'étape 3.8
  5. Après filtration est terminée, dégager la cassette de filtration prenant note de quel côté est le sommet qui a les cellules capturées sur la surface PIPAAm revêtu. Aspirer 1 ml de milieu de culture chaud dans une nouvelle seringue.
  6. Réengager la cassette de filtration, avec la seringue contenant le support, mais cette fois-ci engage l'extrémité inférieure de la cassette, de sorte que la surface revêtue de PIPAAm du filtre est tournée à l'opposé de la seringue.
    NOTE: Ce sera pour libérer les cellules qui peuvent être incorporées dans les pores de fente en appliquant le flux inverse douce.
  7. Placez la seringue sur la pompe à seringue et tenir une petite boîte de Pétri ou d'une plaque à 6 puits juste sous la cassette de filtration. Réglez le débit à 100 ml / h débit et démarrer la pompe.
  8. Passez tous les médias à travers le filtre et de recueillir l'écoulement dans la boîte de Pétri. Attendez que tous les médias de passer à travers, puis arrêter la pompe et retirer la seringue une filtration cassette de la pompe.
  9. Dégager la cassette de filtration de la seringue et l'ouvrir pour récupérer le filtre à partir de la cassette. Placer le filtre avec la surface PIPAAm vers le bas dans la même boîte de Pétri utilisé pour recueillir le flux inverse lors de la libération des cellules des pores. Ajouter le reste des médias chauds et placer la boîte de Pétri dans un incubateur de culture fixée à 37 ° C.
  10. Après 30 minutes, toutes les cellules sont libérées du filtre. Cependant, laisser le filtre dans la boîte de Pétri pendant 24 heures pour assurer que toutes les cellules se détachent.
    NOTE: En variante, les cellules libérées peuvent être collectées dans un tube à centrifuger pour effectuer une analyse plus poussée en aval telles que la PCR, ELISA, Western Blot pour ne citer que quelques exemples.
  11. Après 24 heures de culture, retirez délicatement le microfiltre en utilisant une pince.
    REMARQUE: Le filtre peut être jeté à ce moment que les cellules ont été libérés de lui.
  12. pipette doucement le milieu de culture de haut en bas en utilisant un & # 1000181; l pipette, pour remettre en suspension les érythrocytes et les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) qui sont capturés sur le filtre et libéré dans la plaque avec la CCT. Effectuer soigneusement et lentement cette action pour éviter le détachement des cellules cancéreuses faiblement jointes. Retirez délicatement le support ensemble contenant les érythrocytes remises en suspension et PBMC tout en laissant derrière les cellules cancéreuses ci-joint et les remplacer avec un milieu frais préchauffé à 37 ° C.
    REMARQUE: Cette étape peut être répétée une fois si les érythrocytes excessives sont présents après un lavage.

4. CTC évaluation Viabilité

  1. Évaluer la viabilité de culture CTC en utilisant un test en direct / Dead 8.
    NOTE: De nombreux essais en direct / Dead sont disponibles dans le commerce. Après le protocole du fabricant est fortement conseillé. S'il vous plaît se référer à la liste des matières / réactifs pour le kit d'essai commercial utilisé pour cette expérience.

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Résultats

L'utilisation du sang de donneurs sains (obtenu en vertu d'un protocole approuvé par l'Université de Miami CISR 20.150.020 suite à un consentement éclairé) dopés avec des cellules cancéreuses en culture, la technique thermosensible pour la libération de cellules viables circulant tumorales (CTC), la capture réalisée, la libération et l'efficacité de la récupération de 94% ± 9%, 82% ± 5% et 77% ± 5% , respectivement (tableau 1) 15. Par comparais...

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Discussion

Le processus de capture CTC viable à partir du sang total et en les libérant du microfiltre est relativement simple; cependant quelques points critiques méritent d'être mentionnés. Il est impératif, comme avec toute la culture cellulaire qu'une condition stérile est maintenue grâce à l'ensemble du processus. La première étape de revêtement du filtre avec PIPAAm est critique, car la base de la technique de libérer les cellules du filtre est basée sur l'exploitation des propriétés interfaciales de températ...

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Déclarations de divulgation

Une partie de ce travail a été protégée par la demande de brevet provisoire américaine n° 62/219,808. Siddarth Rawal est un actionnaire de Circulogix Inc. qui produit commercialement les filtres et les cassettes/cartouches filtrantes utilisés dans cet article.

Remerciements

Nous remercions tous les patients qui ont fait don d’échantillons de sang pour soutenir ce travail. Nous remercions les Drs Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli et Marc E. Lippman pour leur aide dans l’acquisition d’échantillons cliniques, ainsi que les Drs Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche et Diana Lopez pour leurs discussions perspicaces. Zheng Ao remercie le soutien et l’assistance partiels du programme d’études supérieures en biologie du cancer Sheila et David Fuente, Sylvester Comprehensive Cancer Center.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre à fenteCirculogix Inc.MSF-01Filtres de différentes tailles disponibles pour la filtration du CTC à partir du sang ou de l’urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  ;Ploysciences Inc.21458Non dangereux. Conserver à température ambiante.
1-ButanolSigma AldrichB7906Utilisation dans une zone bien ventilée
Lames de microscope en plastiqueCole-Parmer48510-30N’importe quelle lame en plastique ou alternativement n’importe quel type de carré (métal, acrylique, etc.) peut être utilisé s’il est nécessaire de maintenir le carré de filtre 8mmx8mm
Spin CoaterSystèmes de revêtement spécialisésSCS G3 Spin CoaterInstrument
Polyimide TapeUlineS-7595Polyimide est le nom générique de la bande Kapton qui peut être achetée auprès de plusieurs fournisseurs (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank’s Balanced Salt SolutionGibco14025-092
1x PBSGibco10010-023
Falcon Boîtes de Petri 35 x 10 mmVWR25373-041
Cassette de microfiltreCirculogix Inc.FC-01Les catridges personnalisés sont disponibles grâce à la filtration pour CTC à partir du sang ou de l’urine.
Seringue 20 mlBD Scientific302830
Pousse-seringueKD scientific  ;78-0100VN’importe quel pousse-seringue capable de contenir une seringue de 25 ml peut être utilisé
Cellstar 50 ml Tube à centrifugerVWR82050-322
Greiner Bio One Plaque à 6 puitsVWR89131-688N’importe quelle marque peut être utilisée, à condition que la surface soit compatible pour l’adesion des cellules et non répulsive
SKBR3 CellsATCCHTB-30
Live Dead AssayLife TechnologiesL3224Tout test qui peut fournir une analyse raisonnable pour évaluer les cellules vivantes fonctionnera
Incubateur de culture cellulaireVWR98000-368Tout incubateur pouvant être utilisé pour la culture cellulaire suffira

Références

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